De Ondergedoken afdrukken van cellen op een gemodificeerde oppervlak met behulp van een continue stroom Microspotter

Het algemene doel van deze procedure is om drie T drie fibroblasten op een met serum bekleed oppervlak af te drukken. Dit wordt bereikt door eerst serum voor te adsorberen op een weefselweefsel kweekoppervlak. De tweede stap is om een suspensie van fibroblasten op het oppervlak af te drukken met behulp van een continu stromende micro spotter, gevolgd door incubatie van de cellen bij 37 graden Celsius gedurende twee uur.

Vervolgens worden gedrukte cellen evenals cellen die gezaaid zijn via standaard celkweek, gekleurd met propidiumjodide en onder een omgekeerde microscoop gevisualiseerd ter vergelijking. Uiteindelijk wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om celviabiliteit, dichtheid en morfologie op relevante tijdstippen te beoordelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals pinprinten, is dat de printkop een afdichting vormt over het oppervlak, waardoor cellen gedrukt kunnen worden terwijl ze ondergedompeld zijn in celmedium.

Hoewel het ondergedompeld afdrukken van cellen nuttig is voor het screenen van nieuwe geneesmiddelkandidaten op veiligheid en werkzaamheid, is ondergedompeld afdrukken in het algemeen ook nuttig voor andere toepassingen. Bijvoorbeeld, we kunnen nieuwe geneesmiddelkandidaten analyseren tegen weefselsneden, of we kunnen het gebruiken als model voor orgaansystemen. Bijvoorbeeld, een leverperfusiemodel.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode het moeilijk vinden omdat tijdens het primen van de printer en het afdrukken van cellen, er geen lucht in de leidingen mag komen, omdat dit celdood kan veroorzaken. Om te beginnen, ontdooi NIH drie T drie cellen gedurende twee tot drie minuten in een schuddend waterbad op 37 graden Celsius. Breng de cellen opnieuw op in vijf milliliters compleet medium en centrifugeer gedurende drie minuten bij 1500 Gs.

Verwijder het celsupernatant zonder de celpellet te verstoren. Breng vervolgens de cellen opnieuw op in vijf milliliters medium en breng 10 microliters van de celsuspensie over naar een 0,5 milliliter microcentrifugebuisje. Voeg vervolgens 10 microliters triam blauw toe aan de celsuspensie en roer met de punt van de pipette 10 microliters van de gekleurde cellen in een hemo cytometer kamer.

Voordat u de cellen telt bij 10 x vergroting, telt u de levende cellen die op kleine witte balletjes lijken in vier van de negen grote vierkantjes. Tel alleen de levende cellen die er niet donkerblauw uitzien van de trippen blauwe kleurstof. Bereken het gemiddelde aantal cellen per groot vierkantje, wat resulteert in het aantal cellen vermenigvuldigd met 10.000 cellen per milliliter in de oorspronkelijke celsuspensie.

Zaai vervolgens cellen met een dichtheid van 100.000 cellen per milliliter met een totaal van vijf milliliters in elke T 25 fles. Kweek de cellen tot tussen de 70 en 80% confluentie voordat u experimenten begint. Om het afdrukoppervlak voor te bereiden, gebruik een marker om een rechthoek ter grootte van de printkop op de bodem van een weefselkweek behandelde polystyreen 12.

Put plaat pipet 50 microliters foetaal bovien serum in het rechthoekige gebied en spreid het over het hele gebied. Laat de putplaat met de punt in een steriele bioveiligheidskast overnacht om de serumvlek volledig te laten drogen. Om ondergedompeld afdrukken te beginnen, spoelt u de printkop uit met gedestilleerd water.

Vul vervolgens een 60 millimeter petrischaal met gedestilleerd water en dock de printkop op het oppervlak. Laat gedurende twee minuten gedestilleerd water door elk van de lijnen stromen met behulp van een pneumatische pomp op 150 microliters per minuut. Gooi vervolgens het water uit de petrischaal en vul deze met schoon water. Beweeg vervolgens de printkop drie keer op en neer in het water.

Dock het midden van de printkop boven de serum beklede vlek in de voorbereide 12 putplaat. Prime vervolgens de printkop met voorgewarmd compleet medium bij 300 microliters per kanaal.

Als u meerdere prints uitvoert, voeg dan naast de water spoeling ook een bleekmiddel spoeling toe tussen de prints. Druk vervolgens de gesuspendeerde cellen af op de oppervlakte met een concentratie van 50.000 cellen per milliliter, en bij 60 microliters per minuut. 100 microliters per kanaal.

Na het afdrukken van cellen, plaats u de printkop links gedockt tegen het oppervlak en de manifold in een celkweek incubator. Zet in op 5% koolstofdioxide en 37 graden Celsius gedurende twee uur. Verwijder na de twee uur incubatie de printkop en plaats de deksel op de kweekschaal.

Het tijdstip waarop de printkop wordt verwijderd, wordt beschouwd als het nul uur tijdstip. Ter vergelijking wordt ook standaard celkweek uitgevoerd. Voeg een milliliter voorgewarmd medium toe aan een van de met serum besproeide 12 putplaten, neem vervolgens een milliliter van de resterende celsuspensie en pipet deze in een enkele put van de 12 putplaat.

Dit zal een kweek produceren die 50.000 cellen in de schaal bevat. Plaats de celkweekplaat in een incubator op 37 graden Celsius gedurende twee uur. Na de twee uur incubatie, begint u met tellen voor consistentie tussen gedrukte en gezaaide monsters.

Dit wordt beschouwd als het nul uur tijdstip. Bereid na 0 2, 24 en 48 uur cellen van elk van de twee methoden voor op beeldvorming door ze te kleuren met propidiumjodide, dat alleen wordt opgenomen in de kern van dode cellen. Was eerst de cellen voorzichtig drie keer met een milliliter fosfaat gebufferd zoutoplossing met calcium en magnesium om eventueel afval te verwijderen.

Voeg vervolgens een milliliter van de voorgewarmde kweekmedia toe aan elk kweekvat, en vervolgens een microliter propidiumjodide. Stockoplossing incubeer de cellen gekleurd met propidiumjodide bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten voordat u de cellen beeldt met een omgekeerde microscoop bij 10 x en 40 x vergroting. Gooi ten slotte de cellen weg in een geschikte bio