De Ondergedoken afdrukken van cellen op een gemodificeerde oppervlak met behulp van een continue stroom Microspotter

Het algemene doel van deze procedure is om drie T three fibroblasten op een serumgecoat oppervlak te printen. Dit wordt bereikt door eerst serum voor te adsorberen op een weefselkweekoppervlak. De tweede stap is het printen van een suspensie van fibroblasten op het oppervlak met behulp van een continuous flow micro spotter, gevolgd door incubatie van de cellen bij 37 °C gedurende twee uur.

Vervolgens worden zowel de geprinte cellen als cellen die via standaardcelkweek zijn uitgezaaid, gekleurd met propidiumjodide en gevisualiseerd onder een omgekeerde microscoop voor vergelijking. Uiteindelijk wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om de celviabiliteit, dichtheid en morfologie op relevante tijdstippen te beoordelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals pin-printing, is dat de printhoofd een afdichting over het oppervlak vormt, waardoor cellen kunnen worden geprint terwijl ze ondergedompeld zijn in celmedium.

Hoewel het ondergedompelde printen van cellen nuttig is voor het screenen van nieuwe kandidaat-geneesmiddelen op veiligheid en werkzaamheid, is ondergedompeld printen in het algemeen ook nuttig voor andere toepassingen. We kunnen bijvoorbeeld nieuwe kandidaat-geneesmiddelen analyseren op weefselsneden, of het gebruiken als model voor orgaansystemen. Denk hierbij aan een leverperfusiemodel.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat er tijdens het primen van de printer en het printen van cellen geen lucht in de lijnen mag komen, aangezien dit kan leiden tot celdood. Begin met het ontdooien van NIH 3T3-cellen gedurende twee tot drie minuten in een schudwaterbad bij 37 °C. Resuspendeer de cellen in 5 mL volledig medium en centrifugeer bij 1500 ×g gedurende drie minuten.

Verwijder het supernatant van de cellen zonder de celpellet te verstoren. Resuspendeer de cellen vervolgens in vijf milliliter medium en breng 10 µL van de celsuspensie over naar een microcentrifugebuisje van 0,5 milliliter. Voeg daarna 10 µL tripanblauw toe aan de celsuspensie en meng dit met de tip van de pipet. Pipetteer 10 µL van de gekleurde cellen in een telkamer van een hemocytometer.

Voordat de cellen bij een 10 x vergroting worden geteld, telt u de levende cellen die lijken op kleine witte balletjes in vier van de negen grote vakken. Tel alleen de levende cellen die niet donkerblauw kleuren door de trypaanblauw-kleuring. Bereken het gemiddelde aantal cellen per groot vak, wat resulteert in het aantal cellen vermenigvuldigd met 10.000 cellen per milliliter in de oorspronkelijke cel-suspensie.

Zaai vervolgens de cellen uit met een dichtheid van 100 000 cellen per milliliter, met een totaalvolume van vijf milliliter in elke T 25-fles. Kweek de cellen tot een confluentie van tussen de 70 en 80% voordat de experimenten worden gestart. Om het printoppervlak voor te bereiden, gebruik dan een marker om een rechthoek ter grootte van de printkop op de bodem van een weefselkweekbehandelde polystyreen 12 te markeren.

Pipetteer 50 µL kalfsserum in het rechthoekige gebied van de wellplaat en verspreid dit over de gehele regio. Laat de wellplaat met de tip in een steriele veiligheidskast voor biologische agentia een nacht staan, zodat de serumvlek volledig kan opdrogen. Spoel de printkop met gedistilleerd water om te beginnen met het ondergedompeld printen.

Vul vervolgens een Petri-schaal van 60 millimeter met gedestilleerd water en plaats de printkop op het oppervlak; laat gedurende twee minuten gedestilleerd water door elke lijn stromen met een snelheid van 150 microliters per minuut met behulp van een pneumatische pomp. Gooi daarna het water uit de Petri-schaal en vul deze opnieuw met schoon water. Beweeg de printkop vervolgens drie keer op en neer in het water.

Plaats de printkop centraal boven de met serum gecoate spot in de vooraf geprepareerde 12-well plaat. Prime vervolgens de printkop met Prewarm Complete medium aan 300 µL per kanaal.

Wanneer er meerdere prints worden uitgevoerd, voeg dan naast het spoelen met water ook een spoeling met bleekmiddel toe tussen de prints. Ga over tot het printen van de gesuspendeerde cellen op het oppervlak met een concentratie van 50.000 cellen per milliliter, tegen een snelheid van 60 µl per minuut. 100 µl per kanaal.

Plaats na het printen van de cellen de printkop links tegen het oppervlak en het collectormanifold in een celkweekincubator. Stel deze in op 5% carbon dioxide en 37 degrees Celsius voor twee uur. Verwijder na de incubatie van twee uur de printkop en plaats het deksel op de kweekschaal.

Het tijdstip waarop de printkop wordt verwijderd, wordt beschouwd als het nulpunt. Ter vergelijking wordt er ook een standaard celkweek uitgevoerd. Voeg één milliliter voorverwarmd medium toe aan een van de 12-wellplaten met serumvlekken, neem vervolgens één milliliter van de resterende celsuspensie en pipetteer deze in een enkele well van de 12-wellplaat.

Dit resulteert in een kweek met 50.000 cellen in de schaal. Plaats de celkweekplaat gedurende twee uur in een incubator bij 37 °C. Begin na de incubatie van twee uur met het timen voor consistentie tussen de geprinte en de gezaaide monsters.

Dit wordt beschouwd als het nulpunt. Na 0, 2, 24 en 48 uur worden de cellen van beide methoden klaargemaakt voor beeldvorming door kleuring met propidiumjodide, dat alleen wordt opgenomen in de nucleus van dode cellen. Spoel de cellen eerst drie keer voorzichtig met één milliliter gefosfatteerde zoutoplossing met calcium en magnesium om eventueel residu te verwijderen.

Voeg vervolgens één milliliter van het voorverwarmde kweekmedium toe aan elk kweekvat, en daarna één microliter propidiumjodide stokoplossing. Incubeer de met propidiumjodide gekleurde cellen 10 minuten bij 37 °C voordat de cellen worden gevisualiseerd met een omgekeerde microscoop bij een vergroting van 10 x en 40 x. Gooi de cellen tot slot weg in een geschikte container voor biologisch gevaarlijk afval.

De fibroblastencellijn, NIH 3T3-cellen, werd geprint of gezaaid op een ondergedompeld oppervlak. Na het printen en zaaien werden de cellen gevisualiseerd om de densiteit en morfologie op relevante tijdspunten te beoordelen. De beelden toonden aan dat de cellen op elk tijdspunt en bij elke vergroting vrijwel identieke fenotypes vertonen.

Op basis van deze cijfers werd vastgesteld dat de effectieve printopbrengst minimaal was. De cellevensvatbaarheid werd beoordeeld met een propidiumjodide-kleuring, waaruit bleek dat de levensvatbaarheid van de geprinte cellen op elk tijdstip niet significant verschilde van die van de gezaaide cellen. Het belangrijkste verschil tussen de twee methoden om de cellen aan het oppervlak te hechten, is de celdichtheid.

De geprinte celdichtheid neemt op het tijdstip van twee uur met meer dan 50% af, zowel bij de gezaaide als bij de geprinte cellen. Verder onderzoek is gerechtvaardigd om de oorzaak van deze afname vast te stellen. Echter, de algemene ratio's van de geprinte dichtheid blijven significant hoger in vergelijking met de gezaaide cellen.

De geprinte celdichtheid in de flowcel was op elk tijdstip ongeveer 10 keer zo hoog als die van de gezaaide cellen, aangezien de cellen met dezelfde dichtheid als bij het zaaien werden geprint, maar over een kleiner oppervlak. Op het laatste tijdstip is de celdichtheid gelijk, wat waarschijnlijk te wijten is aan celmotiliteit en beperkingen in het verbruik van hulpbronnen. Sinds de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van geneesmiddelenontwikkeling om de effecten van drugstoxiciteit en -werkzaamheid op cellen te bestuderen, evenals bij kanker, hartziekten en andere vakgebieden met een grote vraag.

Door ondergedompeld celprinten te combineren met andere technologieën, zoals hechting en programmeerbare celadhesie, kunnen we de reikwijdte van de techniek uitbreiden naar suspensiecellen voor uitgebreidere screening bij het ontdekken en ontwikkelen van geneesmiddelen. Na het bekijken van deze video zou u een degelijke basiskennis moeten hebben over het printen van cellen met behulp van onze ondergedompelde printtechniek.