Name: De Ondergedoken afdrukken van cellen op een gemodificeerde oppervlak met behulp van een continue stroom Microspotter (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Leer een 3D-microfluidische printtechniek om fibroblasten op ondergedompelde oppervlakken te printen voor drugscreening. Deze methode verbetert celviabiliteit en precisie bij cytotoxiciteitsbeoordeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Chris Morrow erkennen voor technische ondersteuning. De financiering werd verstrekt door NIH SBIR (R43) verlenen 1R43GM101859-01 (MPI) GRANT10940803.

1. Celcultuur Voorbereiding <ol><li> Slaan NIH/3T3 cel voorraden in vloeibare stikstof tot aan gebruik. </li><li> Bereid complete media voor NIH/3T3-cellen met Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum, 10 mM HEPES buffer, 50 eenheden / ml penicilline en 50 ug / ml streptomycine. </li><li> Ontdooi cellen gedurende 2-3 minuten in een schuddend waterbad bij 37 ° C. </li><li> Resuspendeer cellen in 5 ml compleet medium en centrifugeer bij 1500 xg gedurende 3 minuten. </li><li> De cel bovenstaande vloeistof zonder de celpellet. </li><li> Resuspendeer de cellen in 5 ml medium en cellen tellen met een hemocytometer. <ol><li> Verwijder 10 pi van de celsuspensie en plaats in een 0,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Voeg 10 ul van trypan blauw aan de celsuspensie en roer met de punt van de pipet. </li><li> Pipetteer 10 ul van de gekleurde cellen in een hemocytometer kamer. </li><li> Tellen cellen hemocytometer 10xvergroting. <ol><li> Tel de levende cellen (kleine, witte ballen) voor 4 van de 9 grote pleinen. Tellen alleen de levende cellen die niet donkerblauw van de trypaanblauw vlek lijken. </li><li> Bereken het gemiddelde aantal cellen per vierkante, waardoor het aantal cellen x 10 4 cellen / ml in de oorspronkelijke celsuspensie. </li><li> Zaad cellen bij een dichtheid van 1 x 10 5 cellen / ml met een totaal van 5 ml per T25 fles. </li></ol></li><li> Kweekcellen tussen 70% en 80% confluentie voor het begin experimenten. Vernieuwen media om de 2-3 dagen of naar vereist. </li></ol></li></ol> 2. Printing Voorbereiding van de oppervlakte <ol><li> Markeer een rechthoek met markering op de bodem van een tissue-cultuur behandeld polystyreen (TCTPS) 12 wells plaat van de grootte van de printkop (7 mm x 19 mm). </li><li> Pipetteer 50 ul foetaal runderserum in de rechthoekige stippellijn verspreiden over het gehele gebied van de punt. </li><li> Laat de petrischaalin een steriele bioveiligheid kap O / N om het serum plek volledig drogen. Deze platen worden bereid maximaal 2 dagen vóór gebruik. </li></ol> 3. Ondergedompeld Printing <ol><li> Spoel de printkop uit met gedestilleerd water. <ol><li> Vul een 60 mm petrischaal met gedestilleerd water en dock de printkop op het oppervlak. </li><li> Flow gedestilleerd water door elk van de leidingen gedurende 2 min bij 150 gl / min met behulp van een pneumatische pomp. </li><li> Gooi het water uit de petrischaal en vul het met schoon water. </li><li> Verplaats de printkop op en neer in het water 3 keer. </li></ol></li><li> Dock de printkop centrum over de serum-gecoate plek in de pre-bereid 12 well plaat. </li><li> Prime de printkop met voorverwarmd complete media, 300 ul per kanaal. </li><li> Print gesuspendeerde cellen bij een concentratie van 50.000 cellen / ml op het oppervlak en 60 pl / min, 100 ul per kanaal. </li><li> Plaats de printkop, links gedokt tegen deoppervlak en het verdeelstuk in een celkweek incubator ingesteld op 5% CO2 en 37 ° C gedurende 2 uur. </li><li> Na de 2 uur incubatie, verwijder de printkop en leg het deksel op de cultuur schotel. Het tijdstip waarop de printkop verwijderd wordt beschouwd als de 0 uur tijdstip. </li></ol> 4. Standaard Cell Culture <ol><li> Voeg 1 ml voorverwarmde media om een ​​van de serum-spotted TCTPS 12-well plaat bereid in stap 2. </li><li> Neem 1 ml van de resterende celsuspensie uit stap 2 en pipet in een enkel putje van een 12-wells plaat TCTPS. Dit zal een kweek die 50.000 cellen in de schaal te produceren. </li><li> Plaats de celkweek plaat in een incubator bij 37 ° C gedurende 2 uur. </li><li> Na de 2 uur incubatie beginnen timing; voor samenhang tussen gedrukte en zaaien monster, die wordt beschouwd als de 0 uur tijdstip. </li></ol> 5. Cultuur Visualisatie <ol><li> Na 0, 2, 24 en 48 uur nemen cellen van elk van de twee methoden described boven en afbeelding met behulp van een standaard omgekeerde microscoop. <ol><li> Vlekken op de cellen met propidiumjodide, een fluorescerende vlek die alleen wordt opgenomen in de kern van dode cellen. <ol><li> Voorzichtig Spoel de cellen 3 maal met 1 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing met calcium en magnesium (PBS + +) om vuil te verwijderen. </li><li> Voeg 1 ml voorverwarmde PBS + + aan elke kweekvat. </li><li> Voeg 1 ul propidiumjodide stockoplossing (1 mg / ml) aan elk kweekvat. </li><li> Incubeer de cellen gekleurd met propidium jodide bij 37 ° C gedurende 10 minuten. </li></ol></li><li> Beeld de cellen met behulp van een omgekeerde microscoop bij 10x en 40x vergroting. </li></ol></li><li> Gooi de cellen in een geschikte biohazard container. </li></ol>

<ol><li>Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cellular+microarray+platforms%3A+applications+in+drug+discovery%2C+toxicology+and+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research.</a> Trends in Biotechnology. 27, 342-349 (2009).</li>
<li>Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+assays%3A+fuelling+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell-based assays: fuelling drug discovery.</a> Anal Bioanal Chem. 398, 227-238 (2010).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+microfluidic+devices+for+in+vitro+cell+culture+for+cell-biology+research%5BTitle%5D)+AND+%22TrAC+Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent developments in microfluidic devices for in vitro cell culture for cell-biology research.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 35, 150-164 (2012).</li>
<li>Geysen, H. M., Schoenen, F., Wagner, D., Wagner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+compound+libraries+for+drug+discovery%3A+an+ongoing+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Combinatorial compound libraries for drug discovery: an ongoing challenge.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2, 222-230 (2003).</li>
<li>Xu, Y., Shi, Y., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+approach+to+stem-cell+biology+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A chemical approach to stem-cell biology and regenerative medicine.</a> Nature. 453, 338-344 (2008).</li>
<li>Khademhosseini, A., Langer, R., Borenstein, J., Vacanti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+technologies+for+tissue+engineering+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microscale technologies for tissue engineering and biology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2480-2487 (2006).</li>
<li>Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+cellular+microenvironments+to+improve+cell-based+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing.</a> Drug Discovery Today. 7, 612-620 (2002).</li>
<li>Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. -A., Gidrol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+microarrays+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Cell microarrays in drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).</li>
<li>Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-assisted+in+vitro+drug+screening+and+carrier+production%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. , (2013).</li>
<li>Gottwald, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chip-based+platform+for+the+in+vitro+generation+of+tissues+in+three-dimensional+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization.</a> Lab on a Chip. 7, 777-785 (2007).</li>
<li>Liu, R., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiu%2C+R+%22Integrated+Biochips+for+DNA+Analysis%22">Integrated Biochips for DNA Analysis</a>. , Springer. (2008).</li>
<li>Natarajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous-flow+microfluidic+printing+of+proteins+for+array-based+applications+including+surface+plasmon+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Continuous-flow microfluidic printing of proteins for array-based applications including surface plasmon resonance imaging.</a> Analytical Biochemistry. 373, 141-146 (2008).</li>
<li>Natarajan, S., Hatch, A., Myszka, D. G., Gale, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+Conditions+for+Protein+Array+Deposition+Using+Continuous+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Optimal Conditions for Protein Array Deposition Using Continuous Flow.</a> Anal. Chem. 80, 8561-8567 (2008).</li>
<li>Keighley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+high+throughput+kinetics+early+in+the+drug+discovery+process%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process.</a> , Summer 2011. Drug Discovery World Online at:
 
 <a target="_blank" href="http://www.ddw-online.com/p-149288">http://www.ddw-online.com/p-149288</a> (2011).</li>
<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+in+vitro+ovarian+cancer+coculture+model+using+a+high-throughput+cell+patterning+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional in vitro ovarian cancer coculture model using a high-throughput cell patterning platform.</a> Biotechnol J. 6, 204-212 (2011).</li>
<li>Tuckwell, D. S., Weston, S. A., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins%3A+a+review+of+their+structure+and+mechanisms+of+ligand+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Symposia+of+the+Society+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrins: a review of their structure and mechanisms of ligand binding.</a> Symposia of the Society for Experimental Biology. 47, 107(1993).</li>
<li>Roberts, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mixed+self-assembled+monolayers+presenting+RGD+and+%28EG%29+3OH+groups+to+characterize+long-term+attachment+of+bovine+capillary+endothelial+cells+to+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Using mixed self-assembled monolayers presenting RGD and (EG) 3OH groups to characterize long-term attachment of bovine capillary endothelial cells to surfaces.</a> Journal of the American Chemical Society. 120, 6548-6555 (1998).</li>
<li>Chandra, R. A., Douglas, E. S., Mathies, R. A., Bertozzi, C. R., Francis, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+cell+adhesion+encoded+by+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Programmable cell adhesion encoded by DNA hybridization.</a> Angewandte Chemie. 118, 910-915 (2006).</li>
<li>Hsiao, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cell+surface+modification+with+DNA+for+the+capture+of+primary+cells+and+the+investigation+of+myotube+formation+on+defined+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Direct cell surface modification with DNA for the capture of primary cells and the investigation of myotube formation on defined patterns.</a> Langmuir. 25, 6985-6991 (2009).</li>
<li>Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Based+Screening+Using+High-Throughput+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 9, 13-20 (2011).</li>
<li>Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting%3A+inkjet+printing+proteins+and+hybrid+cell-containing+materials+and+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures.</a> J. Mater. Chem. 18, 5717-5721 (2008).</li>
<li>Onoe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Microfabrication%3A+Observing+Intercellular+Interactions+Using+Lithographically-Defined+DNA+Capture+Sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Cellular Microfabrication: Observing Intercellular Interactions Using Lithographically-Defined DNA Capture Sequences.</a> Langmuir. 28, 8120-8126 (2012).</li>
<li>Hsiao, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Coated+AFM+Cantilevers+for+the+Investigation+of+Cell+Adhesion+and+the+Patterning+of+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">DNA-Coated AFM Cantilevers for the Investigation of Cell Adhesion and the Patterning of Live Cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. 47, 8473-8477 (2008).</li>
</ol>

De auteurs zijn werknemer en aandeelhouders van Wasatch Microfluidics dat reagentia en / of instrumenten die in dit manuscript produceert.

De 3D microfluïdische printtechnologie hier beschreven is uniek in staat microfluidically drukken arrays van cellen in een vloeistof goed gevuld, dat wil zeggen een verzonken oppervlak. Door drukken op oppervlakken onder water kunnen microarrays cellen worden geproduceerd die de fysiologisch relevante cellulaire fenotype van cellen en het vermogen om cellen multiplexen in de bodem van een put Figuur 4 behouden. De resultaten van deze studie tonen aan dat microfluidically druktechnieken cellen r...

Recente ontwikkelingen in de farmaceutische industrie hebben geleid tot een toegenomen belangstelling voor het gebruik van cellulaire microarrays in de drug discovery proces voor drug discovery en cytotoxicological analyse 1,2,3. De ontwikkeling van in vitro high-throughput testen en screening methoden met behulp van microarrays cel zou de snelle en kosteneffectieve ontwikkeling van kandidaat-geneesmiddelen, alsook van tevoren het fundamenteel begrip van de cel 1,4 vergemakkelijken. De traditionele benadering van screening met cellen maakt gebruik van conventionele goed plaat platforms; maar deze benadering is beperkt vanwege de hoge kosten, beperkte verwerkingscapaciteit en beperkt vermogen om kwantitatieve informatie over celfunctie 1,5. Vanwege deze beperkingen, is het onderzoek in cellulaire microarray technologie ontluikende voor moleculair biologische karakterisering, tissue engineering, en drug screening 1,6. De voordelen van cellulaire microarrays omvatten kleinere steekproef gebruik, minimale effecten vancellulaire fenotype heterogeniteit maskeren informatie, en vooral de mogelijkheid om te testen automatiseren voor meer high-throughput toepassingen 1,7,8. De farmaceutische industrie maakt gebruik momenteel high-throughput-cel-gebaseerde Screeningtesten met 2D cel monolaagculturen voor drug discovery in microtiterputje platen 9. Multiplexing cellen in putjes van microtiterplaten biedt het potentieel voor hogere doorvoer met unieke experimenten opties. Verder zijn de huidige technologieën voor cellulaire microarrays laat de cellen drogen die drastisch kunnen wijzigen fenotype van de cellen van in vivo 10,11. Om deze problemen te overwinnen, werd de MFCA ontworpen en wordt getoond in Figuur 1. Het ontwerp van de MFCA 3D fluïdica kan de printkop punt in figuur 1 worden neergelaten in een bad en samengeperst tegen een oppervlak om een afdichting te vormen. De zachte siliconen tip van de printkop zich gedraagt ​​als eenpakking en vormt een omkeerbare afdichting. De MFCA technologie is uniek geschikt om met ondergedompelde oppervlakken, die nodig is voor zowel celculturen en weefselplak systemen en moeilijk of onmogelijk met de meeste andere benaderingen. Pinnen of inkt-jet printen zal niet werken, en 2D microfluïdische apparaten zijn niet geschikt voor afzetting of interfacing met grote arrays van discrete plekken. Verder, door miniaturisering en lokaliseren van het experiment - de cellulaire microarray - de MFCA overwint de belangrijkste problemen geassocieerd met high-throughput cel-gebaseerde screeningtesten. De CFM maakt gebruik van 3D-kanaal netwerken te fietsen klein volume vloeistof monsters na microscopisch spot locaties op een oppervlak 12,13. Door druk met stroom worden biomoleculen, cellen en andere reagentia gehandhaafd in een vloeibare omgeving gedurende het printproces, waardoor de drukken van gevoelige biomoleculen en cellen zonder blootstelling aan lucht, waarbij de huidige cel druktechnieken belemmert. Het is ook mogelijk om afdrukken uit ruw materiaal zoals hybridoma supernatanten of mits er een opname mechanisme op de array oppervlak. Het doel van dit manuscript is in detail de ondergedompelde drukken van twee celtypen op een oppervlak.

<table><tbody><tr><td>Continuous flow microspotter</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIH/3T3 cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Dubbleco's Gemodificeerd Eagle Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td>Basismedium voor cellen</td></tr><tr><td>HEPES buffer</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td>Additief voor celmedium (controle pH)</td></tr><tr><td>Natriumpyrovaat</td><td>Invitrogen</td><td>11360-070</td><td>Additief voor celmedium</td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Additief voor celmedium</td></tr><tr><td>Trypanblauw</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td>Kleuren van cellen voor telling</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Fisher</td><td>267110</td><td>Cellenkamer voor het tellen van cellen</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS100</td><td>Nikon</td><td></td><td>Gebruikt om cellen te controleren</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U</td><td>Nikon</td><td></td><td>Gebruikt voor het verzamelen van afbeeldingen</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferd zout (met calcium en magnesium)</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td>Cellen spoelen voor het passeren en voor het kleuren met PI</td></tr><tr><td>TrypLE Express&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A12177-01</td><td>Gebruikt om cellen van het oppervlak te verwijderen</td></tr></tbody></table>

de ondergedoken afdrukken van cellen op een gemodificeerde oppervlak met behulp van een continue stroom microspotter

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

Het afdrukken van cellen voor microarray-toepassingen brengt aanzienlijke uitdagingen met zich mee, waaronder het probleem van het behouden van een fysiologisch relevante celfenotype na het afdrukken, slechte organisatie en verspreiding van gewenste cellen, en de onmogelijkheid om medicijnen en/of voedingsstoffen af te leveren op doelgerichte gebieden in de array. Onze 3D-microfluïdische afdruktechnologie is uniek in staat om arrays van cellen op een geautomatiseerde en multiplexe manier op ondergedompelde oppervlakken af te drukken en te verzegelen. Het ontwerp van de microfluïdische celarray (MFCA) 3D-fluidics maakt het mogelijk om de printkoppunt in een met vloeistof gevulde kuip of schaal te laten zakken en tegen een oppervlak te drukken om een afdichting te vormen. De zachte siliconen punt van de printkop gedraagt zich als een pakking en kan een omkeerbare afdichting vormen door druk uit te oefenen of terug te trekken. Andere celprinttechnologieën, zoals pen- of inkjetprinters, zijn niet in staat om in ondergedompelde toepassingen af te drukken. Ondergedompeld oppervlakteafdrukken is essentieel om fenotypen van cellen te behouden en deze cellen op een oppervlak te monitoren zonder de materiaaloppervlaktekenmerken te verstoren. Door op ondergedompelde oppervlakken af te drukken, worden celmicroarrays geproduceerd die geneesmiddelenscreening en cytotoxiciteitsbeoordeling mogelijk maken op een veelvoud van gebieden, waaronder kanker, diabetes, ontsteking, infecties en hart- en vaatziekten.

De fibroblastcellijn NIH/3T3-cellen werden afgedrukt of gezaaid op een verzonken oppervlak. De cellen werden gekweekt tot een dichtheid van 5 x 10 4 cellen per ml. Cellen werden gezaaid met behulp van traditionele celcultuur technieken. Cellen werden afgedrukt met een groot-formaat, twaalf-flow cell printkop waar de kanalen zijn groter (~ 500 micrometer) dan de CFM gebruikt voor eiwitten en andere biomoleculen. De cellen werden afgedrukt of geënt op een oppervlak serum gecoat. Het drukproces wordt getoond in ...

Deze 3D microfluïdische printtechnologie drukt arrays van cellen op ondergedompelde oppervlakken af. We beschrijven hoe arrays van cellen microfluïdisch in 3D-stroomcellen op ondergedompelde oppervlakken worden afgeleverd. Door op ondergedompelde oppervlakken te printen, werden celmicroarrays geproduceerd die geneesmiddelscreening en cytotoxiciteitsbeoordeling mogelijk maken op een veelvoud van gebieden.

De Ondergedoken afdrukken van cellen op een gemodificeerde oppervlak met behulp van een continue stroom Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

Het algemene doel van deze procedure is om drie T three fibroblasten op een serumgecoat oppervlak te printen. Dit wordt bereikt door eerst serum voor te adsorberen op een weefselkweekoppervlak. De tweede stap is het printen van een suspensie van fibroblasten op het oppervlak met behulp van een continuous flow micro spotter, gevolgd door incubatie van de cellen bij 37 °C gedurende twee uur.Vervolgens worden zowel de geprinte cellen als cellen die via standaardcelkweek zijn uitgezaaid, gekleurd met propidiumjodide en gevisualiseerd onder een omgekeerde microscoop voor vergelijking. Uiteindelijk wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om de celviabiliteit, dichtheid en morfologie op relevante tijdstippen te beoordelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals pin-printing, is dat de printhoofd een afdichting over het oppervlak vormt, waardoor cellen kunnen worden geprint terwijl ze ondergedompeld zijn in celmedium.Hoewel het ondergedompelde printen van cellen nuttig is voor het screenen van nieuwe kandidaat-geneesmiddelen op veiligheid en werkzaamheid, is ondergedompeld printen in het algemeen ook nuttig voor andere toepassingen. We kunnen bijvoorbeeld nieuwe kandidaat-geneesmiddelen analyseren op weefselsneden, of het gebruiken als model voor orgaansystemen. Denk hierbij aan een leverperfusiemodel.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat er tijdens het primen van de printer en het printen van cellen geen lucht in de lijnen mag komen, aangezien dit kan leiden tot celdood. Begin met het ontdooien van NIH 3T3-cellen gedurende twee tot drie minuten in een schudwaterbad bij 37 °C. Resuspendeer de cellen in 5 mL volledig medium en centrifugeer bij 1500 ×g gedurende drie minuten.Verwijder het supernatant van de cellen zonder de celpellet te verstoren. Resuspendeer de cellen vervolgens in vijf milliliter medium en breng 10 µL van de celsuspensie over naar een microcentrifugebuisje van 0,5 milliliter. Voeg daarna 10 µL tripanblauw toe aan de celsuspensie en meng dit met de tip van de pipet. Pipetteer 10 µL van de gekleurde cellen in een telkamer van een hemocytometer.Voordat de cellen bij een 10 x vergroting worden geteld, telt u de levende cellen die lijken op kleine witte balletjes in vier van de negen grote vakken. Tel alleen de levende cellen die niet donkerblauw kleuren door de trypaanblauw-kleuring. Bereken het gemiddelde aantal cellen per groot vak, wat resulteert in het aantal cellen vermenigvuldigd met 10.000 cellen per milliliter in de oorspronkelijke cel-suspensie.Zaai vervolgens de cellen uit met een dichtheid van 100 000 cellen per milliliter, met een totaalvolume van vijf milliliter in elke T 25-fles. Kweek de cellen tot een confluentie van tussen de 70 en 80% voordat de experimenten worden gestart. Om het printoppervlak voor te bereiden, gebruik dan een marker om een rechthoek ter grootte van de printkop op de bodem van een weefselkweekbehandelde polystyreen 12 te markeren.Pipetteer 50 µL kalfsserum in het rechthoekige gebied van de wellplaat en verspreid dit over de gehele regio. Laat de wellplaat met de tip in een steriele veiligheidskast voor biologische agentia een nacht staan, zodat de serumvlek volledig kan opdrogen. Spoel de printkop met gedistilleerd water om te beginnen met het ondergedompeld printen.Vul vervolgens een Petri-schaal van 60 millimeter met gedestilleerd water en plaats de printkop op het oppervlak; laat gedurende twee minuten gedestilleerd water door elke lijn stromen met een snelheid van 150 microliters per minuut met behulp van een pneumatische pomp. Gooi daarna het water uit de Petri-schaal en vul deze opnieuw met schoon water. Beweeg de printkop vervolgens drie keer op en neer in het water.Plaats de printkop centraal boven de met serum gecoate spot in de vooraf geprepareerde 12-well plaat. Prime vervolgens de printkop met Prewarm Complete medium aan 300 µL per kanaal.Wanneer er meerdere prints worden uitgevoerd, voeg dan naast het spoelen met water ook een spoeling met bleekmiddel toe tussen de prints. Ga over tot het printen van de gesuspendeerde cellen op het oppervlak met een concentratie van 50.000 cellen per milliliter, tegen een snelheid van 60 µl per minuut. 100 µl per kanaal.Plaats na het printen van de cellen de printkop links tegen het oppervlak en het collectormanifold in een celkweekincubator. Stel deze in op 5% carbon dioxide en 37 degrees Celsius voor twee uur. Verwijder na de incubatie van twee uur de printkop en plaats het deksel op de kweekschaal.Het tijdstip waarop de printkop wordt verwijderd, wordt beschouwd als het nulpunt. Ter vergelijking wordt er ook een standaard celkweek uitgevoerd. Voeg één milliliter voorverwarmd medium toe aan een van de 12-wellplaten met serumvlekken, neem vervolgens één milliliter van de resterende celsuspensie en pipetteer deze in een enkele well van de 12-wellplaat.Dit resulteert in een kweek met 50.000 cellen in de schaal. Plaats de celkweekplaat gedurende twee uur in een incubator bij 37 °C. Begin na de incubatie van twee uur met het timen voor consistentie tussen de geprinte en de gezaaide monsters.Dit wordt beschouwd als het nulpunt. Na 0, 2, 24 en 48 uur worden de cellen van beide methoden klaargemaakt voor beeldvorming door kleuring met propidiumjodide, dat alleen wordt opgenomen in de nucleus van dode cellen. Spoel de cellen eerst drie keer voorzichtig met één milliliter gefosfatteerde zoutoplossing met calcium en magnesium om eventueel residu te verwijderen.Voeg vervolgens één milliliter van het voorverwarmde kweekmedium toe aan elk kweekvat, en daarna één microliter propidiumjodide stokoplossing. Incubeer de met propidiumjodide gekleurde cellen 10 minuten bij 37 °C voordat de cellen worden gevisualiseerd met een omgekeerde microscoop bij een vergroting van 10 x en 40 x. Gooi de cellen tot slot weg in een geschikte container voor biologisch gevaarlijk afval.De fibroblastencellijn, NIH 3T3-cellen, werd geprint of gezaaid op een ondergedompeld oppervlak. Na het printen en zaaien werden de cellen gevisualiseerd om de densiteit en morfologie op relevante tijdspunten te beoordelen. De beelden toonden aan dat de cellen op elk tijdspunt en bij elke vergroting vrijwel identieke fenotypes vertonen.Op basis van deze cijfers werd vastgesteld dat de effectieve printopbrengst minimaal was. De cellevensvatbaarheid werd beoordeeld met een propidiumjodide-kleuring, waaruit bleek dat de levensvatbaarheid van de geprinte cellen op elk tijdstip niet significant verschilde van die van de gezaaide cellen. Het belangrijkste verschil tussen de twee methoden om de cellen aan het oppervlak te hechten, is de celdichtheid.De geprinte celdichtheid neemt op het tijdstip van twee uur met meer dan 50% af, zowel bij de gezaaide als bij de geprinte cellen. Verder onderzoek is gerechtvaardigd om de oorzaak van deze afname vast te stellen. Echter, de algemene ratio's van de geprinte dichtheid blijven significant hoger in vergelijking met de gezaaide cellen.De geprinte celdichtheid in de flowcel was op elk tijdstip ongeveer 10 keer zo hoog als die van de gezaaide cellen, aangezien de cellen met dezelfde dichtheid als bij het zaaien werden geprint, maar over een kleiner oppervlak. Op het laatste tijdstip is de celdichtheid gelijk, wat waarschijnlijk te wijten is aan celmotiliteit en beperkingen in het verbruik van hulpbronnen. Sinds de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van geneesmiddelenontwikkeling om de effecten van drugstoxiciteit en -werkzaamheid op cellen te bestuderen, evenals bij kanker, hartziekten en andere vakgebieden met een grote vraag.Door ondergedompeld celprinten te combineren met andere technologieën, zoals hechting en programmeerbare celadhesie, kunnen we de reikwijdte van de techniek uitbreiden naar suspensiecellen voor uitgebreidere screening bij het ontdekken en ontwikkelen van geneesmiddelen. Na het bekijken van deze video zou u een degelijke basiskennis moeten hebben over het printen van cellen met behulp van onze ondergedompelde printtechniek.

the-submerged-printing-cells-onto-modified-surface-using-continuous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Microcontact afdrukken wordt op grote schaal gebruikt voor het patroon eiwitten en andere moleculen op materiaal oppervlakken. Tonen we de basisstappen van dit proces, stempelen patronen van fibronectine op glas.

Microcontact afdrukken van eiwitten voor Celbiologie

Zelf-geassembleerde monolagen (SAM) gevormd uit lange keten alkaan thiolen op goud bieden goed gedefinieerde substraten voor de vorming van eiwit patronen en cel opsluiting. Microcontact printen van hexadecanethiol met behulp van een polydimethylsiloxaan (PDMS), stempel, gevolgd door opvulling met een glycol-beëindigde alkaan thiol monomeer produceert een patroon waarbij eiwitten en cellen adsorberen alleen aan de gestempelde hexadecanethiol regio.

Het creëren van twee-dimensionale Patterned Substraten voor eiwit en Cell opsluiting

Een beschrijving van de methoden die worden gebruikt om een ​​HP DeskJet 500-printer te zetten in een bioprinter. De printer kan verwerken levende cellen die transient poriën veroorzaakt in het membraan. Deze poriën kan worden gebruikt om kleine moleculen zoals fluorescerende G-actine nemen in de gedrukte cellen.

Het creëren van voorbijgaande celmembraan poriën met een standaard inkjetprinter

Werkwijze voor de montage van lijm en oplosbaar gradiënten in een kamer microscopie voor levende celmigratie studies beschreven. De kunstmatige omgeving combineert aangroeiwerende oppervlakken en lijm tracks met oplossing hellingen en daarom maakt het mogelijk om te bepalen van het relatieve belang van begeleiding cues.

Het maken van lijm en Oplosbare verlopen for Imaging Cell Migration met fluorescentie microscopie

In dit artikel presenteren we een microfluïdische chip voor single cell analyse. Het maakt de kwantificering van intracellulaire eiwitten, enzymen, cofactoren, en tweede boodschappers via fluorescentie assays of immunoassays.

Een Microfluïdische Chip voor de Versatile chemische analyse van enkele cellen

Celcultuur substraten die gefunctionaliseerd zijn met microscopische patronen van biologische liganden hebben een immense bruikbaarheid op het gebied van weefselengineering. Hier demonstreren we de veelzijdige en geautomatiseerde productie van celcultuur substraten met meerdere, microgepatteerde poly(ethyleenglycol) borstels die orthogonale chemieën presenteren die ruimtelijk nauwkeurige en locatiespecifieke immobilisatie van biologische liganden mogelijk maken.

Fabriceren Complex Cultuur Substrates behulp Robotic Microcontact Printing (R-μCP) en Sequential Nucleofiele Substitutie

We presenteren een protocol om subtractieve patterning van levende celmonolagen op een oppervlak uit te voeren. Dit wordt bereikt door lokale en selectieve lysis van adherende cellen met behulp van een microfluïdische sonde (MFP). Het cellysaat dat uit lokale gebieden wordt verkregen, kan worden gebruikt voor downstream-analyse, waardoor moleculaire profileringsstudies mogelijk worden.

Rapid Subtractieve patroonvorming van Live-Cell Lagen met een microfluïdische Probe

Dit protocol beschrijft een bioprinting-methodologie met behulp van een geautomatiseerd robotsysteem voor het afzetten dat geëtste topografische geleidingssignalen combineert met de nauwkeurige afzetting van een hydrogel bio-inkt dat cellen bevat. De gedrukte cellen worden direct afgeleverd bij de geëtste kenmerken en kunnen deze waarnemen en er zich op oriënteren.

Geautomatiseerde Robotic Dispensing Techniek voor Surface Oriëntatie- en Bioprinting van Cellen

Dit rapport beschrijft een eenvoudige, gemakkelijk uit te voeren techniek, met behulp van lagedrukvacuüm, om microfluïdische kanalen te vullen met cellen en substraten voor biologisch onderzoek.

Een veelzijdige methode van patroonvorming Eiwitten en cellen

Hier presenteren we een protocol voor de productie van hoge-resolutie geleidende patronen, gemaakt van electrohydrodynamic (EHD) jet afdrukken. Het protocol bevat twee modi van EHD jet afdrukken: het continu in de buurt van-veld-electrospinning (NFES) en de dot-gebaseerde drop-on-demand (DOD) EHD afdrukken.

Hoge resolutie elementen met behulp van twee modi van Electrohydrodynamic Jet: Drop on Demand en in de buurt van-veld Electrospinning

Deze methodologie heeft tot doel de mechanismen te illustreren waarmee extracellulaire matrixsignalen zoals substraatstijfheid, eiwitsamenstelling en celmorfologie het fenotype van Schwann-cel (SC) reguleren.

Voorbereiding van Tunable Extracellular Matrix Microenvironments om Schwann Cell Phenotype Specification te evalueren

Leer een 3D-microfluidische printtechniek om fibroblasten op ondergedompelde oppervlakken te printen voor drugscreening. Deze methode verbetert celviabiliteit en precisie bij cytotoxiciteitsbeoordeling.

De Ondergedoken afdrukken van cellen op een gemodificeerde oppervlak met behulp van een continue stroom Microspotter

Meer video's verkennen