Name: Myeline Oligodendrocyte glycoproteïne (MOG 35-55) Geïnduceerde experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) in C57BL / 6 muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-15T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Leer de inductie van experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) in C57BL/6 muizen met behulp van MOG 35-55 peptide. Dit model bootst multiple sclerose na en ondersteunt onderzoek naar neuro-immunologische mechanismen en geneesmiddelontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) Münster (SEED 12/3, SB).

1. Algemene opmerkingen voor Muis Experimenten <ol><li> Alle experimenten met muizen moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de respectieve institutionele Animal Care en gebruik Comite. </li><li> Houd de muizen onder-pathogeen-vrije omstandigheden en hen in staat om de toegang tot voedsel en water ad libitum te hebben. Opmerking: Het is belangrijk leeftijd en geslacht overeenkomstige muizen gebruiken experimentele groepen, omdat de gevoeligheid voor ziekte kan variëren met leeftijd en geslacht. </li><li> Afhankelijk van de gekozen experimentele omstandigheden, kan een sham geïmmuniseerde controlegroep beschouwd wanneer MOG 35-55 peptide wordt vervangen door PBS zonder antigeen of nonencephalitogenic peptide. </li><li> Kunt u overwegen methodologische aspecten voorafgaand aan het starten experimenten (zie ook hieronder). Wij raden aan om een ​​of twee geblindeerde waarnemers voor EAE scoren betrekken. </li></ol> 2. Bereiding van MOG 35-55 Emulsie <ol><li> 200 ui van een 1:01 verhouding MOG 35-55 peptide oplossing en CFA worden geïnjecteerd om elke muis. Er is een verlies van de viskeuze emulsie tijdens de voorbereiding en het injecteren. Daarom productie van 1.5-2x de benodigde hoeveelheid. Bereken het totale volume van de emulsie en delen door 2 voor de benodigde hoeveelheden van beide MOG 35-55 peptide oplossing en CFA. </li><li> Verdun gelyofiliseerd MOG 35-55 in DDH 2 O tot een eindconcentratie van 2 mg / ml. We gebruiken meestal 200 pg MOG 35-55 peptide per muis. Dit bedrag wordt in 100 ul van de voorraadoplossing. De peptide oplossing moet bij -20 ° C worden bewaard </li><li> Plaats de inhoud van 1 flacon van verdroogde Mycobacterium tuberculosis H37RA (100 mg) in een vijzel. <ol><li> Grond met vijzel en stamper om een ​​dunne poeder te verkrijgen. </li><li> Voeg 10 ml incomplete Freund&#39;s adjuvans een 10 mg / ml CFA voorraadoplossing die bij 4 ° C worden bewaard vinden </li><li> Voorafgaand aan de immunisatie, verdunnen CFA stockoplossing with IFA een eindconcentratie van 2 mg / ml. Meng grondig voor elk gebruik aan fijn materiaal opnieuw in suspensie en te overwegen wat volume verlies van de viskeuze oplossing tijdens de experimentele voorbereidingen. </li><li> Meng 1:1 met MOG 35-55 peptide oplossing tot de uiteindelijke concentratie van 1 mg / ml wordt bereikt. LET OP: door hitte gedode Mycobacterium tuberculosis stimuleert de aangeboren immuunrespons. Vermijd inademing, inslikken en aanraking met de huid en ogen. </li></ol></li><li> Precool oplossingen op ijs. <ol><li> Zuig 1 ml 2 mg / ml CFA en 1 ml 2 mg / ml MOG 35-55 oplossing in twee 2 ml spuiten. Bereken het aantal spuiten nodig volgens het aantal geïmmuniseerde dieren. LET OP: Strikt vermijden stikken tijdens de bereiding van adjuvante als het granulomen kunnen veroorzaken of veroorzaken auto-immuunreacties. </li><li> Gebruik een 27 G canule voor de MOG 35-55 oplossing en een 20 G canule voor CFA. Vermijd luchtbellen en verbind beide spuiten met tenrie-weg-klep. </li><li> Stuur de emulsie ve spuit aan de andere en meng gedurende ten minste 10 minuten een goed emulgeren is een kritische stap. Near-sluit de drie-weg-klep te emulgeren ondersteunen. De oplossing moet wit, stijf en viskeuze met geen scheiding van fasen. </li><li> Emulsies kunnen worden opgeslagen voor meerdere dagen voor immunisatie. Wacht tenminste 30 minuten na het bereiden van de emulsies te kijken of ze stabiel. Voorafgaand aan de immunisatie, zuig de oplossing in een van de twee spuiten en sluit een 27 G canule. </li></ol></li></ol> 3. Bereiding van Pertussis Toxine <ol><li> Verschillende hoeveelheden pertussis toxine kan worden gevonden in de literatuur die ook afhankelijk van de toedieningsweg (bijvoorbeeld intraveneus of intraperitoneaal). Onze laboratoriumtoepassingen 400 ng pertussis toxine in 200 pl PBS intraperitoneaal op de dag van immunisering en twee dagen later. LET OP: pertussistoxine heeft vele biologische effecten. Vermijd inademing, inslikken en aanraking met de huid en ogen. </li><li> Reconstitueer 50 ug pertussis toxine in 500 pl DDH 2 O 100 ug / ml voorraadoplossing. Bewaren bij 4 ° C. </li><li> Verdun 1:50 met PBS. 200 ul bevatten nu 400 ng van PBS. Bereid de benodigde hoeveelheid spuiten en beschouwen extra overmaat volume van ~ 100 ul per naaldnaaf. </li></ol> 4. Animal Immunisatie <ol><li> Raadpleeg de institutionele Animal Care en gebruik Comite voor specifieke criteria voor de vereiste korte termijn euthanasie. Ons laboratorium maakt gebruik van korte narcotizatie met isofluraan terwijl andere protocollen zoals ketamine / xylazine injectie of Halothan ook mogelijk kan zijn. Wacht anesthesie en gebruik een voorvoet teen knijpen om het niveau van anesthesie beoordelen. </li><li> Zorg ervoor dat immunisatie wordt uitgevoerd door een ervaren persoon om stress voor dieren te minimaliseren en om een ​​optimale immunisatie te garanderen. </li><li> Injecteer 100 ui antigen / CFA emulsie subcutaan in twee verschillende plaatsen op elke achterste flank. Zorg ervoor dat een bolvormige massa vormen onder de huid die moet blijven bestaan ​​gedurende het experiment. </li><li> Injecteer 200 ul pertussistoxine intraperitonelly. </li><li> Ervoor te zorgen dat individuele muizen gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd voor de dagelijkse evaluatie, bijvoorbeeld door kleur markeringen op de staart basis. </li><li> Dien een tweede dosis van pertussis toxine op dag twee na immunisatie. </li></ol> 5. EAE Monitoring <ol><li> Gewicht en de klinische score moet dagelijks worden geëvalueerd. Het begin van EAE correleert gewoonlijk met gewichtsverlies, die kan worden gebruikt als een indicator van ziekteactiviteit. Raadpleeg de institutionele Animal Care en gebruik Comite criteria vooraf definiëren wanneer individuele muizen moeten worden genomen van de experimenten. Dit moet worden overwogen bij gewichtsverlies dan 20% van het oorspronkelijke lichaamsgewicht of bij ernstige klinische symptomen (EAE score 7 of erger) optreden. Raadpleeg de rerespectievelijke richtlijnen van de respectieve institutionele Animal Care en gebruik Comite voor toegestane maximale scores. </li><li> Bij muizen hebben klinische symptomen van EAE is belangrijk dat de fles water nog kan worden bereikt en dat voedsel op de kooi geplaatst. </li><li> Verschillende scoren symptomen kunnen worden gebruikt. In ons laboratorium een ​​schaal van 0-10 is gevestigd. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Graad </td><td> Klinische </td><td> Commentaar </td></tr><tr><td> 0 </td><td> Geen klinische symptomen </td><td> Normale gang, de staart beweegt en kan worden verhoogd, staart wraps rond een rond voorwerp als de muis wordt gehouden op de basis van de staart </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Gedeeltelijk slap staart </td><td> Normale gang, puntje van de staart droops </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Verlamd staart </td><td> Normale gang, staart droops </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Achterste ledematen parese, ongecoördineerde beweging </td&gt; <td> Ongecoördineerde gang, staart hinkt, achterste ledematen reageren op knijpen </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Een achterste ledematen verlamd </td><td> Ongecoördineerde gang met een achterste ledematen slepen, staart hinkt, gaat men achterste ledematen niet reageren op knijpen </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Beide achterpoten verlamd </td><td> Ongecoördineerde gang met beide achterpoten slepen, staart hinkt, doe beide achterste ledematen niet reageren op knijpen </td></tr><tr><td> 6 </td><td> Achterpoten verlamd, zwakte in voorpoten </td><td> Ongecoördineerde gang met voorpoten worstelen om lichaam, voorpoten reflex trek na knijpen, staart hinkt </td></tr><tr><td> 7 </td><td> Achterpoten verlamd, een voorpoot verlamd </td><td> Muis kan niet bewegen, een voorpoot reageert op teen knijpen, staart hinkt </td></tr><tr><td> 8 </td><td> Achterpoten verlamd, beide voorpoten verlamd </td><td> Muis kan niet bewegen, beide voorpoten niet reageren op teen knijpen, staart hinkt </td></tr><tr><td> 9 </td&gt; <td> Zieltogende </td><td> Geen beweging, veranderde ademhaling </td></tr><tr><td> 10 </td><td> Dood </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. Klinische scoresysteem.

<ol><li>McFarland, H. F., Martin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+a+complicated+picture+of+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity.</a> Nat. Immunol. 8, 913-919 (2007).</li>
<li>Wiendl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation%3A+the+world+is+not+enough%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation: the world is not enough.</a> Curr. Opin. Neurol. 25, 302-305 (2012).</li>
<li>vander Star, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+models+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neurol.+Disord.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo models of multiple sclerosis.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 11, 570-588 (2012).</li>
<li>Pachner, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Experimental models of multiple sclerosis.</a> Curr. Opin. Neurol. 24, 291-299 (2011).</li>
<li>Bittner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TASK1+channel+inhibitor+A293+shows+efficacy+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The TASK1 channel inhibitor A293 shows efficacy in a mouse model of multiple sclerosis.</a> Exp. Neurol. 238, 149-155 (2012).</li>
<li>Handel, A. E., Lincoln, M. R., Ramagopalan, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+men%3A+experimental+autoimmune+encephalitis+and+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Of mice and men: experimental autoimmune encephalitis and multiple sclerosis.</a> Eur. J. Clin. Invest. 41, 1254-1258 (2011).</li>
<li>Krishnamoorthy, G., Wekerle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EAE%3A+an+immunologist%27s+magic+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">EAE: an immunologist's magic eye.</a> Eur. J. Immunol. 39, 2031-2035 (2009).</li>
<li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nat. Protoc. 1, 1810-1819 (2006).</li>
<li>Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+in+multiple+sclerosis+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 1-11 (2010).</li>
<li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice%3A+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> Eur. J. Immunol. 25, 1951-1959 (1995).</li>
<li>Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pertussis+toxin+modulates+the+immune+response+to+neuroantigens+injected+in+incomplete+Freund%27s+adjuvant%3A+induction+of+Th1+cells+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+presence+of+high+frequencies+of+Th2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells.</a> J. Immunol. 169, 117-125 (2002).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Een veelvoud van verschillende EAE modellen met actieve immunisatie protocollen is beschreven in de afgelopen decennia. Terwijl de rat modellen zijn op grote schaal gebruikt tot voor kort, muizen zijn nu de meest populaire modelorganisme voor EAE onderzoek. Deze ontwikkeling is onder andere door de grote en steeds toenemende repertoire beschikbare transgene muizen. Immunisatie van C57BL / 6 muizen met MOG 35-55 peptide is een van de wijdst verspreide EAE modellen en kan worden beschouwd als een betrouwbare, reproduceerbare en goed te gebruiken diermodel. In veel neuroimmunologische laboratoria wordt de MOG 35-55 geïnduceerde EAE opgericht als het model van keuze, terwijl andere EAE modellen worden gebruikt voor meer specifieke experimentele vragen. Een kritisch punt van overweging is de planning van de experimentele instellingen om ervoor te zorgen dat de EAE experimenten worden uitgevoerd methodologisch correct. Voor de interne validiteit, wordt verblind scoren van ziektesymptomen sterk aanbevolen. Experimental groepen moeten zijn leeftijd, gewicht en geslacht gematchte en muizen moeten willekeurig worden toegewezen aan behandelingsgroepen. Experimenten moeten altijd worden uitgevoerd in overeenstemming met het dierenwelzijn regelgeving. EAE studies zijn vaak underpowered en geen rekening houden met statistische type II fouten. Daarom vóór experimenten steekproefgrootte worden uitgevoerd. Noodzakelijke groepsgrootte afhankelijk van de verwachte grootte effect. Raadpleging van een deskundige voor statistische analyse zou voordat EAE experimenten worden beschouwd. Een aantal beperkingen van het protocol moet in gedachten worden gehouden. Het belangrijkste is interpretatie van aeae gegevens gecompromitteerd door de wijze van immunisatie met het gebruik van adjuvans en pertussis toxine, welke aanvullende invloed op de immunologische reactie. Ook moet worden overwogen dat de MOG 35-55 EAE model toont vooral een CD4 + T-cel gedreven immunologische respons. CD8 + T-cellen en B-cellen speleneen minder prominente rol en alternatieve protocollen moeten worden overwogen bij het aanpakken van deze celtypen. De verwachte koers ziekte is acuut, monofasisch en zelf-beperkt. Alternatief kan een recidieve ziekte uiteraard ook verwezenlijkt in alternatieve EAE modellen. Een andere belangrijke beperking van het protocol is een zekere voorkeur voor de immunologische component van de MS pathofysiologie. Gedurende de laatste jaren is het steeds duidelijker dat MS heeft een sterke neurodegeneratieve component geworden. De dood van oligodendrocyten en neuronen resulteert in een progressieve accumulatie van neurologische tekorten. Er moet rekening mee worden gehouden dat de EAE model niet volledig geschikt zijn om experiment vragen over neurodegeneratieve mechanismen van auto-ontsteking pakken. Alternatieve diermodellen met een focus op CNS pathologie kan worden beschouwd - zoals de cuprizone model dat giftige demyelination compromissen zonder betrokkenheid van het perifere immuunsysteem. De beschreven protocol worden beschouwd als een basis neuro experimenteel model en kunnen worden aangepast voor andere toepassingen. De hierboven beschreven experimentele procedure kan gemakkelijk worden toegepast op andere protocollen EAE door het variëren muizen stammen of de soort en hoeveelheid eiwit (bv gebruiken PLP 139-151 peptide en SJL muizen een relapsing remitting EAE ziekteverloop die is bijzonder geschikt voor het beoordelen van therapeutische effecten op recidieven). De beschreven protocol kan ook gebruikt worden voor adoptieve transfer experimenten (passieve EAE). In dit model worden C57BL / 6 muizen geïmmuniseerd met MOG 35-55 peptide en CFA zoals hierboven beschreven. Daarentegen wordt pertussis toxine niet vereist. Na 7-15 dagen, milt of lymfeknopen geïsoleerd en immuuncellen in vitro opnieuw gestimuleerd met MOG 35-55 peptide en diverse cytokinen vóór de overdracht in een nieuwe groep C57BL/6se muizen. Deze ontvanger muizen een paar dagen eerder dan na clas ontwikkelen EAESical immunisatie. In vitro omstandigheden kan worden gevarieerd voor specifieke immunologische vragen (bijv. polarisatie in T H 1 of T H 17 cellen). Soms kan lage incidentie van de ziekte of zwakke symptomen een experimentele uitdaging. Een aantal aanbevelingen voor het oplossen van problemen zijn: - Ernst van de ziekte kan worden gevarieerd met verschillende hoeveelheden peptide / muis. - Optimale CFA concentratie kan variëren van 1-5 mg / ml. Overweeg een titratie van CFA bij het vaststellen van de experimenten. Verwijzen wij u naar de betreffende richtlijnen van de respectieve institutionele Animal Care en gebruik Comite voor toegestane CFA concentraties zo veel regels verbieden CFA concentraties van meer dan 2 mg / ml. - Verschillende methoden worden beschreven voor het bereiden van de emulsie. Alternatieve methoden zoals vortexen gedurende 1 uur of sonicatie kan worden beschouwd als slechte emulgering wordt beschouwd als possible fout bron. - Leeftijd, geslacht, seizoen van het jaar en milieuomstandigheden in het dier faciliteit zijn belangrijke factoren die EAE gevoeligheid beïnvloeden. Er moet voor worden gezorgd dat de omstandigheden vergelijkbaar zijn tussen onafhankelijke experimenten. Zoals hierboven beschreven, kan het genoemde protocol worden gebruikt als uitgangspunt voor adoptieve EAE experimenten. Dit model is vooral geschikt voor het scheiden van perifere en centrale zenuwstelsel werkt een genetische fenotype (bijv. door overdracht encefalitogene knockout cellen in wildtype ontvangende muizen) en specifieke immunologische vragen het fenotype van de overgedragen cellen grondig gekarakteriseerd. De nieuwste ontwikkeling in EAE onderzoek gedurende de afgelopen jaren zijn T-cel-receptor transgene muizen. Deze muizen ontwikkelen EAE symptomen spontaan zonder invloed van buitenaf te omzeilen het probleem van adjuvante inenting. Echter, dit model vereist grote hoeveelheden dieren breeding tot voldoende groepsgrootte verzekeren. Evaluatie van knockout muizen vereist kruisen voor EAE experimenten in tegenstelling tot aeae. Aangezien elke muis ontwikkelt ziektesymptomen op een andere dag, kan evaluatie van nieuwe stoffen nogal ingewikkeld. Daarom is de waarde van klassieke aeae voor neuro-inflammatoire steeds onaangetast.

Multiple sclerose (MS) is een chronische demyeliniserende ontstekingsziekte van het centrale zenuwstelsel waarbij de vernietiging van oligodendrocyten en neuronen resulteert in heterogene en opslaan van klinische symptomen. MS wordt beschouwd als een prototype auto-immuunziekte van het centrale zenuwstelsel (CZS) en dierlijke modellen ontwikkeld om licht te werpen op de complexe pathogenese. Bovendien, de huidige therapieën zijn slechts gedeeltelijk effectief en doel voornamelijk de inflammatoire fase van de ziekte, terwijl de neurodegeneratieve component is waarschijnlijk de grootste uitdaging voor toekomstige therapeutische benaderingen 1,2. Hoewel de exacte etiologie van de ziekte is nog onduidelijk is een auto-immuunreactie tegen epitopen op de myelineschede van de neuronen van het CZS verondersteld om het begin van de ziekte veroorzaken. Ontregeling van het immuunsysteem, genetische kwetsbaarheid en omgevingsfactoren (zoals infecties, vitamine D) worden verondersteldinvloed centrale aspecten van de pathofysiologische mechanismen van MS. Drie verschillende types van dierlijke modellen worden momenteel vastgesteld voor de exploratie van pathologische patronen van MS: Virale modellen zoals Theiler&#39;s murine encephalomyelitis virus (TMEV), modellen veroorzaakt door giftige stoffen zoals cuprizone, en tenslotte verschillende varianten van experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) 3, 4. Hoewel ze allemaal na te bootsen kenmerken van MS, ze verschillen enorm in de onderliggende pathologische functies, zoals de betrokkenheid van het adaptieve immuunsysteem. EAE is de meest voorkomende diermodel als het bijzonder nuttig om neuro wegen onderzoeken en vaak dient als een &quot;proof-of-principle&quot; model voor de effectiviteit van nieuwe behandelingsstrategieën 5,6. EAE geïnduceerd kan worden in vele verschillende dieren (bijv. muizen, ratten, miniswine, cavia&#39;s, kippen of primaten). Echter, de meest muizen gebruiken soort die ten minste deels wordenaan de uitbreiding van het repertoire van geavanceerde transgene of knockout muizen 7. De pathofysiologie van EAE is gebaseerd op de reactie van het immuunsysteem tegen hersen-specifieke antigenen. Deze reactie induceert ontsteking en vernietiging van het antigeen dragende structuren, waardoor neurologische en pathologische kenmerken die vergelijkbaar zijn met die waargenomen in patiënten met MS. Drie verschillende benaderingen kunnen worden onderscheiden: Actief geïnduceerde EAE (aeae; actieve immunisatie), passief overgedragen EAE (peae, overdracht van encefalitogene cellen van een geïmmuniseerd dier), en meer recent spontane EAE muismodellen (SEAE) die de studie van auto mogelijk mechanismen zonder exogene manipulatie. De makkelijkste induceerbare model is aeae bij muizen waardoor in snelle en robuuste resultaten. Dit model wordt beschouwd als de &quot;gouden standaard&quot; van neuro dierlijke modellen van veel onderzoekers op het gebied 8. Voor aeae inductie, het diergeïmmuniseerd met een subcutane injectie van een emulsie bestaande uit de gekozen antigeen en compleet Freund&#39;s adjuvans (CFA) vergezeld van een intraperitoneale injectie van pertussis toxine op de dag van immunisering en twee dagen later. Bijgevolg worden myeline-specifieke T lymfocyten geactiveerd in de periferie en migreren in het CZS over de bloed-hersen-barrière. Bij binnenkomst in het CZS, worden T-cellen geactiveerd door lokale en infiltreren antigeen-presenterende cellen resulteert in de daaropvolgende inflammatoire cascades, betrokkenheid van andere cellen, zoals monocyten of macrofagen en uiteindelijk in demyelinisatie en axonale celdood 9. Afhankelijk van de immunisatie protocol en verzameling muizenstam (bijv. C57BL / 6, SJL / J, Biozzi) en antigeen (bijvoorbeeld myeline oligodendrocyt glycoproteïne (MOG), myeline basisch eiwit (MBP), proteolipide myeline-eiwit (PLP)), de ziekte Natuurlijk kan een acute, chronische progressieve of relapsing remitting ziekte cursus. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; C57BL / 6 muizen hebben de meest gebruikte soort voor transgene muizen constructie geworden en een groeiende schare van knockout of transgene muizen beschikbaar is. We beschrijven hier een protocol voor immunisatie van C57BL / 6 muizen met MOG 35-55 peptide 10 waardoor een monofasische EAE eerst symptomen na 9-14 dagen, maximaal ziekte ongeveer 3-5 dagen na ziektebegin en traag en gedeeltelijk herstel symptoom in de komende 10-20 dagen. Aangezien het immunogene potentieel van MOG 35-55 peptide alleen is niet voldoende om ziekte te induceren, adjuvantia zoals CFA noodzakelijk. Aangenomen wordt, dat de componenten van CFA activeren mononucleaire fagocyten induceren van de fagocytose van deze moleculen en secretie van cytokinen. Dit resulteert in de verlenging van de aanwezigheid van antigenen en een efficiënter transport daarvan aan het lymfestelsel. EAE inductie wordt vergemakkelijkt door toepassing van pertussis-toxine (PT), die onder meer is heeft voorgesteld om te modulerende bloed-hersenbarrière en de immunologische responsiviteit zelf 11. Na ziekte inductie, moet speciale zorg worden genomen voor de dagelijkse evaluatie van muizen voor ziektesymptomen.

<table><tbody><tr><td>Vrouwelijke C57BL/6 muizen, leeftijd 10-12 weken, ~20 g gewicht</td><td>bijv. Jackson Laboratory, Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)</td><td>bijv. Pepceuticals Ltd</td><td></td><td>Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Incomplete Freund&rsquo;s adjuvant (IFA)</td><td>bijv. Sigma-Aldrich Co.</td><td>F5506</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Spuiten, 1 ml met 26 G 3/8 inch naald&nbsp;</td><td>bijv. Becton Dickinson &amp; Co.</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>Spuiten, 2 ml</td><td>bijv. B. Braun</td><td>7389</td><td></td></tr><tr><td>Naalden, 25 G 5/8 inch en 30 G 1/2 inch&nbsp;</td><td>bijv. Becton Dickinson &amp; Co.,</td><td>305122, 305106</td><td></td></tr><tr><td>Driewegklep</td><td>bijv. B. Braun</td><td>16494 C</td><td></td></tr><tr><td>Pertussis toxine, gelyofiliseerd in buffer</td><td>Enzo Life Sciences Inc.</td><td>BML-G100</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>M. tuberculosis H37 RA</td><td>BD Difco</td><td>231141</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C</td></tr></tbody></table>

myeline oligodendrocyte glycoproteïne (mog<sub&gt; 35-55</sub&gt;) geïnduceerde experimentele autoimmuun encefalomyelitis (eae) in c57bl / 6 muizen

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Multiple sclerose is een chronische neuro-inflammatoire demyeliniserende aandoening van het centrale zenuwstelsel met een sterke neurodegeneratieve component. Hoewel de exacte etiologie van de ziekte is nog niet duidelijk zijn autoreactieve T-lymfocyten gedacht dat een centrale rol spelen in de pathofysiologie. MS therapie is slechts gedeeltelijk effectief zo ​​ver en onderzoeksinspanningen blijven onze kennis over de pathofysiologie van de ziekte uit te breiden en nieuwe behandelingsstrategieën te ontwikkelen. Experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) is de meest voorkomende diermodel voor MS delen vele klinische en pathofysiologische kenmerken. Er is een grote verscheidenheid van EAE modellen die verschillende klinische, histologische en immunologische aspecten van menselijke MS weerspiegelen. Actief-geïnduceerde EAE in muizen is de makkelijkste induceerbare model met robuuste en reproduceerbare resultaten. Het is vooral geschikt voor het onderzoeken van de effecten van drugs of van bepaalde genen met behulp van transgene muizen uitgedaagd door auto neuroinflammation. Daarom worden muizen geïmmuniseerd met homogenaten CZS of peptiden van myeline-eiwitten. Vanwege de lage immunogene potentieel van deze peptiden worden sterke adjuvantia gebruikt. EAE gevoeligheid en fenotype afhankelijk van het gekozen antigeen en knaagdieren stam. C57BL / 6 muizen zijn de meest gebruikte soort voor transgene muis bouw en reageren onder andere op myeline oligodendrocyt glycoproteïne (MOG). De immunogene epitoop MOG 35-55 gesuspendeerd in compleet Freund&#39;s adjuvans (CFA) vóór immunisatie en pertussis toxine wordt op de dag van immunisering en twee dagen later. Muizen ontwikkelen een &quot;klassieke&quot; self-limiting monofasisch EAE met oplopende slappe verlamming binnen 9-14 dagen na immunisatie. Muizen worden dagelijks geëvalueerd met behulp van een klinisch scoresysteem voor 25-50 dagen. Speciale aandachtspunten voor de zorg onttrekken van dieren met EAE evenals potentiële toepassingen en beperkingen van dit model worden besproken.

Na immunisatie, muizen dagelijks worden onderzocht op veranderingen in gewicht en klinische symptomen. Ziektebegin wordt typisch gecorreleerd met een vermindering van gewicht dat zou kunnen beginnen 1-2 dagen voor EAE-symptomen zichtbaar. Klinische verschijnselen van EAE beginnen meestal tussen dag 9 en 14 post-immunisatie. Aangezien laesies voornamelijk worden gelokaliseerd in het ruggenmerg MOG-EAE in C57BL / 6 muizen, ze meestal ontwikkelen voornamelijk motorische symptomen bij een caudaal rostrale patroon. Een voorbeeld afbeelding van een muis geïmmuniseerd met EAE symptomen (score 6) is weergegeven in figuur 1A. Sommige atypische EAE symptomen kunnen ook optreden als rollen axiaal roterende wijze gebogen uiterlijk of overgevoeligheid die niet tot uiting in de klassieke EAE score weergegeven in Tabel 1. Al motorische symptomen zijn de belangrijkste kenmerken in het model, ofwel deze score ons een goede indicatie van de ernst van de ziekte. Verschillende bewakingssystemen (bijv. score 0 -5 of 0-6) en complexere samengestelde scores beoordelen verschillende tekorten zijn ook gepubliceerd. Let muizen met ernstige symptomen moeten worden genomen van de proef volgens de respectieve institutionele Animal Care en gebruik commissie. Muizen in het algemeen gedeeltelijk herstel van de symptomen in de komende 10-20 dagen. Een vertegenwoordiger ziektebeloop wordt weergegeven in figuur 1B. Er zijn verschillende momenten tijdens EAE die van belang zijn voor de beoordeling van uitkomstmaten. Enkele typische assays die vaak te vinden zijn zeer kort beschreven. Bij maximale ziekte, kunnen muizen worden geëvalueerd voor cytokine productie of proliferatie na herstimulatie van geïsoleerde immuuncellen met MOG 35-55 peptide in vitro (MOG recall-test). Immune cellen kunnen worden geïsoleerd uit de hersenen en ruggenmerg van muizen met EAE symptomen en verder verwerkt, bijvoorbeeld door flowcytometrie. Histologische analyse van ruggemerg kan bij ziekte m worden uitgevoerdaximale voor laesies en demyelinisatie, terwijl op latere tijdstippen markers voor neurodegeneratie en neuronale celdood interessant kunnen zijn. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51275/51275fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51275/51275fig1.jpg" width="600px" /> Figuur 1. Representatieve resultaten EAE. A. representatief beeld van een geïmmuniseerd C57BL / 6 muis met EAE symptomen (EAE score 6). Ziekteverloop B. Vertegenwoordiger na immunisatie dan 30 dagen. Gegevens worden getoond als gemiddelde en de standaardafwijking van het gemiddelde (n = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51275/51275fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> .

Experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) is een gevestigde diermodel voor multiple sclerose. C57BL / 6 muizen worden geïmmuniseerd met myeline oligodendrocyt glycoproteïne (MOG) peptide 35-55 (MOG 35-55), wat resulteert in een oplopende zwakke verlamming veroorzaakt door autoreactieve immuuncellen in het centrale zenuwstelsel. Protocollen voor de ziekte van inductie en toezicht zal worden besproken.

Myeline Oligodendrocyte glycoproteïne (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Geïnduceerde experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) in C57BL / 6 muizen

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Het algemene doel van deze procedure is om een diermodel van experimentele auto-immuun encefalomyelitis te induceren dat de klinische en pathofysiologische kenmerken van multiple sclerosie nabootst. Dit wordt bereikt door eerst het antigeen, het adjuvans en de pertussistoxine voor te bereiden. De tweede stap is het subcutaan injecteren van de emulsie van het antigeen en CFA, en het intraperitoneaal injecteren van de pertussistoxine.Twee dagen later worden de muizen opnieuw intraperitoneaal geïnjecteerd met pertussistoxine. Daarna worden de dieren dagelijks gewogen en wordt hun klinische score geëvalueerd. Uiteindelijk kunnen klinische tekenen van experimentele auto-immuun encephalomyelitis gewoonlijk worden waargenomen tussen dag 9 en 14 na immunisatie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande protocollen, die bijvoorbeeld gebruikmaken van toxische agentia zoals rizone of verschillende varianten van EIE, is dat deze laatste allemaal kenmerken van MS nabootsen die enorm verschillen in onderliggende pathologische eigenschappen, zoals de betrokkenheid van het adaptieve immuunsysteem. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege de lastige behandeling van de immunisatie. Het is absoluut noodzakelijk om stress bij de dieren te verminderen en een optimale immunisatie na de ontwikkeling te waarborgen.Dit model baande de weg voor onderzoekers in het veld van de neuroimmunologie om knockout-dieren te karakteriseren. Om nieuwe moleculaire drugtargets te identificeren of om veelbelovende drugkandidaten te testen. Om de peptide-oplossing te bereiden, begint u met het verdunnen van geliofiliseerde MOG 35-55 peptide in dubbel gedestilleerd water tot een eindconcentratie van 2 mg/mL. Er is 100 µL van deze oplossing nodig per muis en er gaat een bepaald volume verloren tijdens de bereiding.Maak daarom 1,5 tot twee keer de benodigde hoeveelheid oplossing. Bewaar de peptide-oplossing bij -20 °C. Om compleet Freunds adjuvant of CFA te maken, plaatst u 100 mg gedroogde Mycobacterium tuberculosis H37Ra in een vijzel en maalt u dit met een stamper tot een fijn poeder.Voeg vervolgens 10 milliliter onvolledig frons adjuvant toe om een CFA-stamsoplossing van 10 milligram per milliliter te verkrijgen. De CFA-stam kan worden bewaard bij vier graden Celsius tot het moment van immunisatie. Verdun de CFA-stamsoplossing met onvolledig fres adjuvant tot een eindconcentratie van twee milligram per milliliter, meng dit grondig om het particulaire materiaal opnieuw te suspenderen en plaats het op ijs.Nadat een aliquot van de MOG 35 tot 55 peptide-oplossing is ontdooid, dient deze op ijs te worden geplaatst. Gebruik een spuit van twee milliliter en een canule van 27 gauge om één milliliter CFA op te zuigen.Gebruik vervolgens een tweede spuit van twee milliliter en een canule van 20 gauge om één milliliter van de MOG 35 tot 55-oplossing op te zuigen. Verwijder eventuele luchtbellen en verbind beide spuiten met een driewegkraan. Terwijl de driewegkraan bijna gesloten is, wordt de emulsie van de ene spuit naar de andere en weer terug geduwd, waarbij gedurende ten minste 10 minuten grondig wordt gemengd.Wanneer dit voltooid is, moet de oplossing wit, stijf en viskeus zijn, zonder fasescheiding. Laat de emulsie nu ten minste 30 minuten of tot enkele dagen vóór de immunisatie rusten. Controleer of de oplossing nog steeds geëmulgeerd is. Trek op de dag van de immunisatie de oplossing op in een van de twee spuiten en bevestig een 27 gauge canule.Reconstitueer 50 µg pertussistoxine in 500 µL dubbel gedestilleerd water. Bewaar de stockoplossing (100 µg/mL) bij 4 °C tot gebruik. Verdun de pertussis-stockoplossing op de dag van immunisatie 1:50.Bereid met PBS een spuit voor met 200 µL van de verdunde kinkhoestoplossing voor injectie, die 400 ng kinkhoesttoxine bevat, en trek een extra 100 µL op voor de dode ruimte van de naaldhouder. Beoordeel na het anesthetiseren van een muis met isofluraan het niveau van de anesthesie met een teenknijptest. Injecteer 100 µL van de CFA-antigeenemulsie subcutaan op twee verschillende plaatsen aan elke achterflank.Na de injectie moet er een bolvormige massa onder de huid ontstaan, die gedurende het hele experiment aanwezig moet blijven. Injecteer vervolgens de klaargemaakte spuit met 200 µL pertussistoxine intraperitoneaal. Zorg ervoor dat individuele muizen gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd voor de dagelijkse evaluatie.Bijvoorbeeld door middel van kleurmarkeringen op de staartaanzet.

myelin-oligodendrocyte-glycoprotein-mog35-55-induced-experimental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Sommige muizenstammen in staat zijn om de inductie van experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) te weerstaan ​​met myeline basisch eiwit. Hier beschreven is een eenvoudige immunisatieprotocol dat het niet-reageren omkeert en induceert verlammende ziekte in een aantal typische EAE resistent muis vlekken.

Het overwinnen van reageert niet in experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) Resistant muizenstammen door adoptieve overdracht en Antigene Challenge

The video demonstrates the induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in a mouse model by injecting a combination of myelin oligodendrocyte glycoproteins and inactivated Mycobacterium tuberculosis. The model enables researchers to study disease mechanisms and test therapeutic interventions.

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in a Mouse Model

This video demonstrates the method of inducing experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) by injecting myelin-derived peptides with an adjuvant to activate autoreactive T cells, which migrate to the brain. Pertussis toxin is administered to increase blood-brain barrier permeability, allowing these T cells and other immune cells to enter the brain. These immune cells cause demyelination, leading to impaired nerve transmission and development of EAE.

Generation of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in a Mouse Model

In this video, a mouse model of multiple sclerosis is established using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). The mouse is injected with an emulsion containing a neuronal peptide and an adjuvant, triggering an immune response that activates autoreactive T cells. This is followed by an injection of pertussis toxin (PTX) to increase blood-brain barrier permeability, allowing the autoreactive T-cells to infiltrate the brain. This infiltration initiates a signaling cascade that...

Dit manuscript beschrijft de methoden voor inductie en scoren van het experimentele auto-immuunencefalomyelitis (EAE) model, samen met de beoordeling van immuunceldistributie en mRNA-cytokineniveaus in lymfeklieren, milt, bloed en ruggenmerg met behulp van flowcytometrie en kwantitatieve PCR, respectievelijk, in verschillende fasen van de ziekte.

Inductie van experimentele auto-immune Encefalomyelitis in Muizen en evaluatie van de ziekte-afhankelijke Verdeling van immuuncellen in verschillende weefsels

We beschrijven een eenvoudig protocol met behulp van alleen basislaboratoriumapparatuur om grote hoeveelheden van een fusie-eiwit te genereren en zuiveren dat muis Myeline Oligodendrocyt Glycoproteïne bevat. Dit eiwit kan worden gebruikt om experimentele auto-immuunencefalitis te induceren die wordt aangedreven door zowel T- als B-cellen.

Eenvoudige en efficiënte productie en zuivering van de Muis myeline oligodendrocyt-glycoproteïne voor experimentele auto-immune Encephalomyelitis Studies

Kinematische ganganalyse in het sagittale vlak levert zeer nauwkeurige informatie over hoe verkeer wordt uitgevoerd. We beschrijven de toepassing van deze technieken te identificeren gait tekorten voor muizen onderworpen aan auto-immuun-gemedieerde demyelinisatie. Deze methoden kunnen ook worden gebruikt om te karakteriseren gait tekorten voor andere Muismodellen met verminderde motoriek.

Sagittale vlak kinematische ganganalyse in C57BL/6 muizen onderworpen aan MOG35-55 geïnduceerde experimentele Autoimmune encefalomyelitis

Dit manuscript presenteert een protocol om actieve experimentele auto-immuunenceomyelitis (EAE) bij muizen te induceren. Een methode voor de isolatie en karakterisering van de geïnfiltreerde lymfocyten in het centrale zenuwstelsel (CNS) wordt ook gepresenteerd om te laten zien hoe lymfocyten betrokken zijn bij de ontwikkeling van cns auto-immuunziekte.

Flow Cytometrische Analyse van lymfocyten infiltratie in het centrale zenuwstelsel tijdens experimentele auto-immuunenceomyelitis

Het huidige protocol beschrijft de inductie van experimentele auto-immune encefalomyelitis in een muismodel met behulp van myeline oligodendrocytenglycoproteïne en het monitoren van het ziekteproces met behulp van een klinisch scoresysteem. Experimentele auto-immuun encefalomyelitis-gerelateerde symptomen worden geanalyseerd met behulp van muis femur micro-computertomografie analyse en open veld test om het ziekteproces uitgebreid te beoordelen.

Inductie- en diverse beoordelingsindicatoren van experimentele auto-immuun encefalomyelitis

Experimentele auto-immuun encefalomyelitis is een van de meest gebruikte muizenmodellen van multiple sclerose. In het huidige protocol worden C57BL/6J-muizen van beide geslachten geïmmuniseerd met myeline-oligodendrocytglycoproteïnepeptide, wat voornamelijk resulteert in oplopende parese van de staart en ledematen. Hier bespreken we het protocol van EAE-inductie en -evaluatie.

Modellering van multiple sclerose bij de twee geslachten: MOG35-55-geïnduceerde experimentele auto-immuun encefalomyelitis

Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) is een diermodel van multiple sclerose (MS), dat met de menselijke ziekte een robuuste humorale auto-immuunrespons deelt. Hier rapporteren we een eenvoudig en flexibel ELISA-protocol om auto-antilichamen in het serum van EAE-geïmmuniseerde muizen te kwantificeren.

Kwantificering van autoreactieve antilichamen bij muizen bij experimentele auto-immuunencefalomyelitis

Leer de inductie van experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) in C57BL/6 muizen met behulp van MOG 35-55 peptide. Dit model bootst multiple sclerose na en ondersteunt onderzoek naar neuro-immunologische mechanismen en geneesmiddelontwikkeling.

Myeline Oligodendrocyte glycoproteïne (MOG 35-55) Geïnduceerde experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) in C57BL / 6 muizen (Video) | JoVE Journal

Myeline Oligodendrocyte glycoproteïne (MOG

Meer video's verkennen