Name: Snelle analyse en verkenning van fluorescentiemicroscopie Afbeeldingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Ontdek een snelle workflow voor fluorescentiemicroscopie-analyse met het PhenoRipper-platform. Deze methode identificeert automatisch fenotypische profielen en verkort de analyse tijd aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Adam Coster en alle andere leden van de Altschuler en Wu labs voor nuttige feedback en discussies. Dit onderzoek werd gesteund door de National Institute of Health verleent R01 GM085442 en CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW) en de Welch Stichting I-1619 (SJA) en I-1644 (LFW).

1. Voorbereiden van monsters en Imaging <ol><li> Celcultuur <ol><li> Split culturen routinematig en bij 20-70% confluentie handhaven. Een dag voor het experiment groeien HeLa cellen in DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium, zie tabel Materials) en aangevuld met 10% FBS (foetaal runderserum) en 1 x penicilline / streptomycine. </li><li> Op de dag van het experiment, split cellen groeien in cultuur (ongeveer 50% confluent). </li><li> Was de cellen met PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing), blootgesteld aan ongeveer 2 ml trypsine / EDTA (Ethyleendiaminetetra-azijnzuur) gedurende enkele seconden. Verstuif overmaat trypsine / EDTA en bewaar cellen gebaad in een dunne film van trypsine / EDTA in de kap bij KT ~ 3 minuten. </li><li> Mechanisch schudflessen tweemaal en los cellen met serum aangevuld media. Tellen cellen en verdun tot 5000 cellen/50 ul van media en direct plaat 50 ul / putje op een 384-wells glazen bodemplaat met behulp van een geautomatiseerde vloeibare handlingrobot (slechts 30 goeds van de plaat worden hier gebruikt). </li><li> Incubeer plaat bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten om randeffecten in putten 5 minimaliseren. Na RT incubatie plaats platen in een 37 ° C / 5% CO 2 incubator &#39;s nachts. </li><li> Elk geneesmiddel wordt in tweevoud onderzocht. Voeg 25 ul van geneesmiddel tot de overeenkomstige putjes van de plaat reeds media die. </li><li> Fix plaat met 4% paraformaldehyde oplossing in PBS bij 24 uur na de behandeling met geneesmiddelen. </li></ol></li><li> Kleuring De specifieke primaire antilichamen, fluorescent gelabelde secundaire antilichamen en andere fluorescerende vlekken die hier werden gebruikt zijn vermeld in Tabel Materials. <ol><li> Permeabilize gefixeerde cellen met 0,2% Triton X-100 oplossing in TBS (Tris-gebufferde zoutoplossing) gedurende 3 minuten en wassen met TBST (Tris-gebufferde zoutoplossing + Tween 20) 3x. Voeg 5% BSA (Bovine Serum Albumine) oplossing in TBST voor het blokkeren. </li><li> Incubeer plaat bij kamertemperatuur gedurende 2 uur en daarna wassen met TBST 3x. </li><li> Maak primair antilichaam verwaterdeionen in 5% BSA in TBST (zie tabel van Materialen) en voeg 10 ul / putje. Incubeer plaat bij kamertemperatuur gedurende 2 uur, en daarna wassen 3x met TBST. </li><li> Maak secundair antilichaam dilutionin 5% BSA in TBST (zie tabel van Materialen) en voeg 10 ul / putje. </li><li> Incubeer plaat in het donker bij kamertemperatuur gedurende 2 uur en vervolgens tweemaal wassen met TBST. </li><li> Bereid verdunningen van Hoechst en phalloidin (zie tabel van Materialen) in PBS en voeg 10 ul / putje. </li><li> Incubeer de plaat in het donker gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Na 2 TBST wast, afdekplaten in folie en bewaar bij 4 ° CO / N. </li></ol></li><li> Imaging Acquire beelden met behulp van een epifluorescentiemicroscoop met een 20X objectief met 1x1 camera binning. Acquire zestien beelden voor elk putje, voor een totaal van 480 beelden (x3 kanalen). </li></ol> 2. Het analyseren van afbeeldingen Download en installeer PhenoRipper uit phenoripper.org, en start PhenoRipper analyse van ima beginnenges. PhenoRipper ondersteunt momenteel TIFF, PNG en JPEG en alle andere formaten worden ondersteund door MATLAB (microscoop software te ondersteunen meestal exporteren naar TIFF). 2.1 laden van gegevens <ol><li> Geen standaard naamgeving / organisatie conventie bestaat voor microscopie beelden, die laden van afbeeldingen en het associëren van metadata kan maken (dat wil zeggen experimentele annotatie zoals type behandeling, goed nummer en ga zo maar door) de meest uitdagende deel van de workflow. Kies een van de gepresenteerde methoden (hieronder beschreven). <ol><li> PhenoLoader: Kies deze optie om semi-automatisch te laden gegevens wanneer de bestandsnaam en / of directory-structuur bevatten genoeg informatie om groepsfoto&#39;s als gewenst (bijvoorbeeld B16 HeLa_Drug5-DAPI.png kunnen wijzen dat het beeld is van goed B16, worden cellen behandeld met het geneesmiddel waarvan de id is 5, en het beeld vangt de nucleaire DAPI vlek - met deze naam conventie konden alle beelden van zowel A1 of behandeld met Drug 5 gemakkelijk worden gegroepeerd). De wizard zalbegeleiden de gebruiker stap voor stap naar metadata associëren met afbeelding groepen en definieer de markeerders als volgt: <ol><li> Klik op &quot;Bestand Structuur&quot; om toegang te krijgen tot het venster PhenoLoader. </li><li> Klik op &quot;Definieer Root Directory&quot; naar de map met de afbeelding dataset te selecteren. Vervolgens filteren de bestanden die niet worden gebruikt (ongebruikte bestanden) voor de analyse (optioneel, kan leeg gelaten worden). </li><li> Klik op &quot;Definieer Markers&quot; om de biomarkers gebruikt in het experiment specificeren en associëren ze met de beelden. Specifiek, klik op de afbeelding te selecteren vervolgens een deel van de bestandsnaam die uniek identificeert de biomarkers. Tot slot voert u een naam voor elke biomarker. </li><li> Klik op &quot;Definieer Metadata&quot; om informatie te koppelen aan elke afbeelding. Specifiek, klik op een beeldbestand en selecteer vervolgens een deel van de bestandsnaam identificeren beeldinformatie (bv. &quot;B16&quot; voor de goed naam). Een venster met de vraag voor een groepsnaam (bv &quot;Wijll &quot;) verschijnt, voert u een naam. Leden van de groep gewonnen uit de bestandsnaam wordt getoond op de groep tafel (bijvoorbeeld de volledige lijst van goed namen). Als u aanvullende informatie niet in de bestandsnaam toe te voegen, klikt u op de&quot; (optioneel) Volgende &quot;. Klik op&quot; Add Metadata Group &quot;, voer de extra groep naam (bijv.&quot; Drug &quot;) en voor elke waarde van de vooraf gedefinieerde groep (bv.&quot; Well &quot;), voert u de waarde (bv.&quot; Taxol &quot;) . Er is geen limiet aan het aantal extra groepen die kunnen worden toegevoegd. </li><li> Klik ten slotte op &quot;Create Metadatafile&quot; om de metadata bestand te genereren en voer de analyse. Als een bestand met metagegevens eerder is gegenereerd, kan de bovenstaande stappen worden voorkomen door direct laden van het bestand met de optie &quot;Metadata File&quot; (in 3 hieronder beschreven). </li></ol></li><li> Regular Expression gebaseerde sjablonen: Reguliere expressies zijn een standaard aanpak voor het matchen van patronenin tekst. Kies deze optie wanneer de bestandsnaam en / of directory-structuur bevatten genoeg informatie om groepsfoto&#39;s en de naamgeving overeenkomt met een van de reeds bestaande sjablonen. Aangepaste sjablonen op basis van reguliere expressies kan ook handmatig worden gedefinieerd en hergebruikt. Deze geavanceerde optie wordt alleen aanbevolen voor gebruikers die vertrouwd zijn met reguliere expressies. </li><li> Metadata File: Kies deze optie voor ultieme aanpasbaarheid. Definieer en plaats een door komma&#39;s gescheiden waarden bestand met bestandsnamen en metadata gekoppeld aan elke afbeelding (CSV). Een voorbeeld van het bestandsformaat is beschikbaar op de download gedeelte van de website (phenoripper.org). U laadt het bestand via de interface om de informatie die het bevat. </li></ol></li><li> Selecteer het metadata veld dat herhalingen definieert in het experiment om overbodige bemonstering te voorkomen. Voor datasets die herhalingen (bijvoorbeeld alle afbeeldingen in een goed gelijk te zijn) bevatten, ze te groeperen (bijvoorbeeld door ook) kan improve prestaties. In de meeste gevallen is het redelijk om de standaard optie &quot;Random (weet niet)&quot;, die een willekeurig setje selecteert kiezen. </li></ol> 2.2 Instellen Analyse Parameters Klik op &quot;Parameters instellen&quot; om de parameters die nodig zijn om de dataset te verwerken definiëren. De parameters te definiëren zijn op het linkerpaneel. Het rechter paneel toont een samengevoegde steekproef van de dataset. Klik op de links / rechts pijlen om te schakelen tussen verschillende beelden. <ol><li> Drempel Intensiteit: Kies een geschikte drempelwaarde ruwweg identificeren cellulaire delen (in plaats van de achtergrond, niet-cellulaire gebieden) beelden. Een drempel wordt vooraf berekend door PhenoRipper, maar kan worden aangepast om accentuering van cellulaire regio&#39;s te verbeteren met behulp van de schuifbalk beschikbaar op de top van het beeld. Als een gekozen drempel werkt niet in alle beelden, verlaagt de drempel om niet-cellulaire regio&#39;s in plaats van het laten vallen van cellulaire regio&#39;s omvatten. </li><li> Blok Size: Kies een geschikte blok grootte (in pixels) om net het beeld. Blokken van opgegeven grootte zal worden gelegd op de afbeelding. Pas blokgrootte tot gemiddeld 20-30 blokken / cel te verkrijgen. Om het raster superimpose over de afbeelding klikt u op het vakje aan de voorkant van het veld &quot;Block Size&quot;. </li><li> Optioneel Parameters: Als de auto-geschaalde afbeeldingen niet markers met de gewenste relatieve intensiteiten (bijvoorbeeld een kleur verzadigd) weergeven of als markers moeten worden geschrapt uit de analyse, gebruik dan de &quot;Adjust Channel Intensity&quot; optie. Om cellulaire gebieden op een subset van markers de &quot;Channels gebruikt voor Threshold&quot; optie. Standaard keuzes van andere parameters zijn meestal voldoende, maar indien nodig, aan te passen ze met behulp van de &quot;Advanced Analysis Options&quot;. </li><li> Voer de analyse door op &quot;PhenoRip&quot; op de belangrijkste toepassing paneel. PhenoRipper automatisch terugkerende types blok herkennen in de beelden. Fenotypische profielen worden gegenereerd voorelk beeld op de fracties van de verschillende blokken in. </li></ol> 3. Exploring Resultaten <ol><li> Bekijk de relatie tussen de fenotypische profielen van de beelden met de PhenoBrowser (figuur 1). De PhenoBrowser interface bestaat uit vier panelen: de linker bovenpaneel is een grafische weergave (spreidingsdiagram) van de relatieve gelijkenis tussen verschillende beelden / omstandigheden, de twee panelen op de rechter display steekproef beelden van geselecteerde voorwaarden, en de uiteindelijke paneel (staafdiagram ) vergelijkt hun fenotypische profielen. </li><li> &quot;Gooi Lege Frames&quot; met behulp van het menu &quot;Data Processing&quot;. </li><li> Verwijder afbeeldingen van slechte kwaliteit: Ten eerste, om te studeren individuele afbeeldingen wilt uitschakelen groepering in het menu &quot;Data Processing&quot;. Vervolgens klikt u door de uitschieter punten in de scatterplot en gooi lage kwaliteit beelden (bijvoorbeeld onscherp, kleuring artefact). </li><li> Ontdek de gegevens: Beslis welk veld definieert metadataeen basiseenheid van vergelijking (bijvoorbeeld om te vergelijken drugs, beelden met dezelfde waarde van het veld metadata &quot;drug&quot; moeten worden gegroepeerd). Alles samenvouwen beelden met dezelfde waarde van deze metadata veld een datapunt met &quot;Group By&quot;. Zo zal groeperen door middel gemiddelde van de beelden in elk geneesmiddel een punt per geneesmiddel opleveren. In de buurt (of verre) punten in de scatterplot weerspiegelen omstandigheden die vergelijkbaar (of ongelijksoortige) cellulaire fenotypes ontlokken. Kleur of etiket punten (menu data display) op basis van beschikbare metadata te helpen interpreteerbaarheid. De 3D-plot is draaibaar door te klikken op de &quot;draaibare&quot; vakje en door te klikken op de linker knop en slepen met de muis overheen. </li><li> Kies twee verschillende plaatsen om ze direct te vergelijken. Het beeld panelen zullen monster beelden weer voor elk punt, en het staafdiagram panel zal het blok soorten wier optreden frequenties zijn het meest verschillend tussen de twee punten te tonen. </li><li> Start de clustergram uit de &quot;Clustergram menu&quot; naar een meer globale visie op de relatie tussen de soorten blok en experimentele omstandigheden. Door het groeperen van beide soorten blok en voorwaarden, deze voorstelling belicht de cellulaire fenotypes die beste groepen van omstandigheden (figuur 5) te onderscheiden. </li></ol>

<ol><li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for microscopy.</a> Biotechniques. 43, 25-30 (2007).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, (2006).</li>
<li>Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+Recognition+Software+and+Techniques+for+Biological+Image+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis.</a> PLoS Comput. Biol. 6, (2010).</li>
<li>Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhenoRipper%3A+software+for+rapidly+profiling+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images.</a> Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).</li>
<li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).</li>
<li>Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+heterogeneous+cellular+responses+to+perturbations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).</li>
<li>Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+digital+microscope+images%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of digital microscope images.</a> Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).</li>
<li>Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+calibration+in+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Image calibration in fluorescence microscopy.</a> J Microsc. 216, 15-24 (2004).</li>
<li>Shamir, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wndchrm+-+an+open+source+utility+for+biological+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Source+Code+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Wndchrm - an open source utility for biological image analysis.</a> Source Code Biol. Med. 3, 13(2008).</li>
<li>Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+and+visual+differentiation+of+subcellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Statistical and visual differentiation of subcellular imaging.</a> BMC Bioinform. 10, 94(2009).</li>
<li>Huang, K., Murphy, R. F. Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells. IEEE Int. Symp. Biomed. Imag. Macro Nano, 2004 Apr 15-18, 2, 1139-1142 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier beschreven workflow zorgt voor een snelle en eenvoudige karakterisering en vergelijking van microscopie beelden. We eerst aangetoond hoe deze workflow experiment optimalisatie, bijvoorbeeld kan helpen door snel uitvoeren van kwaliteitscontrole op microscopie beelden. Vervolgens toonden we het potentieel voor het analyseren hoog-gegevens: we konden groep geneesmiddelen op basis van hun werkingsmechanisme. De groepering van geneesmiddelen was vergelijkbaar met die gevonden met complexere 6, hoewel Pheno...

In de afgelopen tien jaar hebben snelle ontwikkelingen in de imaging-technologie veel labs krijgt de mogelijkheid om high-throughput microscopie. De uitdaging is nu verschoven van een van beeldvorming om een ​​analyse. Hoe kunnen we karakteriseren, vergelijken, en verken de stortvloed van complexe maar subtiele fenotypes die door een typische high-throughput imaging scherm? Een aantal imago-analyse en informatica platforms hebben gebruikers geavanceerde gereedschapskisten gegeven 1-3 voor de extractie van biologische informatie uit grote verzamelingen van afbeeldingen. Toch blijven er nog vele belangrijke hindernissen in het analyseren van gegevens van high-throughput-image-based schermen. Problemen in verband met het kiezen van geschikte karakteriseringen van de beelden en fijnafstelling van algoritmische parameters (het systeem van rente) leiden vaak tot lange insteltijden, vooral voor gebruikers zonder beeldanalyse expertise. Vooral cel segmentatie, het identificeren individuele cellen in eenafbeelding n, is een belangrijk knelpunt in dit verband. Segmentatie kunnen zeer gevoelig zijn voor experimentele parameters zoals het type cel, dichtheid en bio-markers, en vereist vaak herhaalde aanpassing voor een grote dataset. Daarom beeldanalyse vaak een onafhankelijke terminal stap uitgevoerd door deskundigen plaats van een integraal deel van het experimentele workflow. Dit voorkomt de snelle feedback cyclus tussen analyse en experiment, een cruciaal onderdeel van assay ontwikkeling. Hier beschrijven we een alternatieve workflow die is geoptimaliseerd voor high-throughput fluorescentiemicroscopie en vermijdt vele van de bovengenoemde problemen. Hiervoor maken we gebruik van PhenoRipper 4, een open-source softwareplatform voor snelle verkenning en analyse van microscopie beelden. Aanzienlijk, PhenoRipper vermijdt veel van de uitdagingen die betrokken zijn bij cel segmentatie door niet te proberen om enkele cellen te identificeren. In plaats daarvan verdeelt PhenoRipper afbeeldingen in pixelblokken subcellulaire grootte en kenmerkt afbeeldingen in termen van de blokken die ze bevatten. Concreet PhenoRipper profielen blokken in termen van marker-colocalization gebaseerde functies en identificeert automatisch 4 de meest representatieve soorten blok in de training beelden. PhenoRipper dan toekent aan elk blok het meest vergelijkbaar type representatieve blok, en tenslotte kenmerkt Afbeeldingen op basis van de aard van de blokken die ze bevatten. Vergelijking met de meer traditionele single-cel-gebaseerde benaderingen, deze aanpak vereist een minimale fine tuning en expertise. Als zodanig, gebruikers hoeven slechts twee parameters: de blokgrootte en een drempel intensiteit (op niet-cellulaire delen van een beeld ontdoen), beide zijn ingesteld met grafische feedback. Belangrijk is dat de hier beschreven workflow aangetoond 4 gemakkelijk schalen naar veel grotere datasets, waarbij de snelheid en de minimale fine tuning biedt grote tijd en betrouwbaarheid winsten. In de praktijk zien we dat deze appvoorn reduceert de tijd die nodig is, zowel voor de installatie en actief door meerdere ordes van grootte 4. De primaire uitvoer van PhenoRipper is een visuele weergave van beeld gelijkenis, waarmee de gebruiker groepen experimentele omstandigheden die veroorzaken cellen vergelijkbare fenotypen laten identificeren. De groeperingen PhenoRipper Typisch voelt hebben vergelijkbare &quot;biologische uitlegbaarheid&quot; die gegenereerd door tijdrovender, cel-gebaseerde methoden 4. In de praktijk betekent dit dat vaak, binnen een half uur van het uitvoeren van een typische 96-well fluorescentie microscopie experiment, een experimentator zonder voorafgaande beeldanalyse ervaring kan een goede weergave over de prestaties van zijn of haar experiment te krijgen. De onderzoeker kan dan beginnen met het verkennen van de relaties tussen de verschillende experimentele condities en in verband deze relaties op de foto fenotypes. We tonen deze workflow hier door het analyseren van de effectenvan drugs in verschillende mechanistische lessen op HeLa-cellen gekleurd voor DNA en cytoskelet markers. Beelden van cellen behandeld met dezelfde klasse van drugs werden gegroepeerd, en slechte kwaliteit beelden (kleuring artefacten, onscherp cellen enzovoort) verscheen als uitschieters, waardoor ze gemakkelijk te identificeren en wellicht gooi. Hoewel deze werkstroom is nuttig voor een groot aantal beeld-gebaseerde testen zijn duidelijk veel situaties waarin een andere aanpak potentieel informatief zijn. Bijvoorbeeld, de uitvoer van PhenoRipper vooral een relatieve vergelijking van fluorescentie patronen in experimentele omstandigheden. Indien een absolute karakterisering van specifieke cel trait plaats is vereist (bijvoorbeeld het aantal spikkels in een cel), wordt een enkele-cel gebaseerde analyse vereist. Niettemin, zelfs in dergelijke situatie PhenoRipper waarschijnlijk veranderingen in deze eencellige fenotypes detecteren en daarom een ​​nuttig instrument voor analyse optimaalmization.

<table><tbody><tr><td>DMEM, High Glucose</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td>High Glucose, L-Glutamine</td></tr><tr><td>Marker Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td>DNA stain, dilution 1:2.000 van 5 mg/ml stock</td></tr><tr><td>Marker phalloidin-Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>Geconjugeerd phallotoxoïne, verdunning 1:200</td></tr><tr><td>Primary Antibody &alpha;-tubulin</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>Primaire Ab, monoklonaal muis, verdunning 1:200</td></tr><tr><td>Secondary Antibody anti-Mouse TRITC</td><td>Jackson</td><td>115-025-166</td><td>Geconjugeerd secundair Ab, 0,5 mg in 1 ml PBS + 1 ml glycerol</td></tr><tr><td>Aldosterone</td><td></td><td></td><td>Gebruikte concentratie: 0,2 &mu;M</td></tr><tr><td>Apicidin</td><td></td><td></td><td>Gebruikte concentratie: 20 &mu;M</td></tr><tr><td>Colchicine</td><td></td><td></td><td>Gebruikte concentratie: 0,16 &mu;M</td></tr><tr><td>Cortisol</td><td></td><td></td><td>Gebruikte concentratie: 0,2 &mu;M</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td></td><td></td><td>Gebruikte concentratie: 0,2 &mu;M</td></tr><tr><td>Docetaxel</td><td></td><td></td><td>Gebruikte concentratie: 0,2 &mu;M</td></tr><tr><td>M344</td><td></td><td></td><td>Gebruikte concentratie: 20 &mu;M</td></tr><tr><td>MS-275</td><td></td><td></td><td>Gebruikte concentratie: 5 &mu;M</td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td></td><td></td><td>Gebruikte concentratie: 0,3 &mu;M</td></tr><tr><td>Prednisolone</td><td></td><td></td><td>Gebruikte concentratie: 0,2 &mu;M</td></tr><tr><td>RU486</td><td></td><td></td><td>Gebruikte concentratie: 0,2 &mu;M</td></tr><tr><td>Scriptaid</td><td></td><td></td><td>Gebruikte concentratie: 70 &mu;M</td></tr><tr><td>Taxol</td><td></td><td></td><td>Gebruikte concentratie: 0,3 &mu;M</td></tr><tr><td>Trichostatin A</td><td></td><td></td><td>Gebruikte concentratie: 0,2 &mu;M</td></tr><tr><td>Vinorelbine</td><td></td><td></td><td>Gebruikte concentratie: 0,3 &mu;M</td></tr></tbody></table>

snelle analyse en verkenning van fluorescentiemicroscopie afbeeldingen

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Ondanks de snelle ontwikkelingen in de high-throughput microscopie, kwantitatieve-image-gebaseerde testen vormen nog steeds belangrijke uitdagingen. Terwijl een verscheidenheid aan gespecialiseerde beeldanalyse tools zijn beschikbaar, de meeste traditionele beeld-analyse-gebaseerde workflows hebben steile leercurve (voor fijnafstelling van analyse parameters) en leiden tot lange doorlooptijden tussen beeldvorming en analyse. In het bijzonder cel segmentatie, het proces van identificatie van afzonderlijke cellen in een beeld, is een belangrijk knelpunt in dit verband. Hier presenteren we een alternatieve, cel-segmentatieloze workflow op basis van PhenoRipper, een open-source software platform dat is ontworpen voor de snelle analyse en verkenning van microscopie beelden. De hier gepresenteerde pijpleiding is geoptimaliseerd voor immunofluorescentie microscopie beelden van celculturen en vereist een minimale tussenkomst van de gebruiker. Binnen een half uur, kan PhenoRipper analyseren van een typische 96-well experiment en het genereren afbeelding profielen. Gebruikers kunnenvervolgens visueel hun gegevens te verkennen, uit te voeren kwaliteitscontrole op hun experiment, verzekeren reactie op verstoringen en check reproduceerbaarheid van herhalingen. Dit vergemakkelijkt een snelle feedback cyclus tussen analyse en experiment, wat cruciaal is tijdens test optimalisatie. Dit protocol is niet alleen nuttig als een eerste doorgang analyse kwaliteitscontrole, maar ook kan worden gebruikt als een end-to-end oplossing, vooral voor screening. De hier beschreven workflow schalen naar grote datasets zoals die gegenereerd worden door high-throughput-schermen, en is aan de groep experimentele omstandigheden aangetoond door fenotype nauwkeurig over een breed scala van biologische systemen. De PhenoBrowser interface biedt een intuïtieve kader om de fenotypische ruimte te verkennen en hebben betrekking beeld eigenschappen aan biologische annotaties. Samen genomen, zal de hier beschreven protocol verlagen de barrières op de aanneming van een kwantitatieve analyse van image-based schermen.

Hier testten we de mogelijkheid van deze werkstroom groep geneesmiddelen op basis van hun werkingsmechanisme. HeLa-cellen werden uitgezaaid in 30 putjes van een 384-wells plaat en gekleurd voor DNA / actine / α-tubuline. De specifieke primaire antilichamen, fluorescent gelabelde secundaire antilichamen, en andere fluorescerende vlekken die werden gebruikt zijn vermeld in Tabel Materials. Putjes werden behandeld met 15 geneesmiddelen behoren tot drie klassen mechanistische (histon deacetylase remmende, microtubuli target...

Hier beschrijven we een workflow voor het snel analyseren en verkennen van collecties van fluorescentie microscopie beelden met behulp PhenoRipper, een recent ontwikkelde beeldanalyse platform.

Snelle analyse en verkenning van fluorescentiemicroscopie Afbeeldingen

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Het algemene doel van deze procedure is om een platform voor beeldanalyse te gebruiken om fluorescentiemicroscopiebeelden snel te analyseren en te verkennen. Dit wordt bereikt door eerst cellen in een plaat uit te zaaien, perturbaties aan elke put toe te voegen en de plaat te incuberen. Vervolgens worden de beelden vastgelegd met een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop, waarna de beelden semi-automatisch op het pheno ripper-beeldanalyseplatform worden geladen met behulp van de pheno loader-tool.Na het instellen van de analyseparameters identificeert pheno ripper automatisch recurrente bloktypen in de beelden en genereert fenotypische profielen voor elk beeld, die kunnen worden verkend met de pheno browser. Uiteindelijk laat het definitieve clustergram de relaties tussen verschillende condities en beeldkenmerken zien, waardoor de vergelijking van complexe maar subtiele fenotypen die door de high-throughput imaging screen zijn gegenereerd, mogelijk wordt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden die een geautomatiseerde identificatie van individuele cellen vereisen, is dat deze veel sneller en gemakkelijker in gebruik is.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het biomedische veld, zoals de manier waarop verschillende geneesmiddelen cellulaire processen beïnvloeden. Deze procedure begint met celkweek en celfixatie zoals beschreven in het tekstprotocol; kleur de gefixeerde cellen vervolgens met de specifieke primaire antilichamen, fluorescentielabel secondary antilichamen en andere fluorescente kleurstoffen die in het tekstprotocol worden vermeld. Neem na het kleuren van de cellen beelden op met een epifluorescentiemicroscoop.In dit voorbeeld hebben we een 20x vergroting gebruikt met een camera van Benning. We hebben 16 beelden per well vastgelegd, wat neerkomt op in totaal 480 beelden. Om de beelden te analyseren, downloadt en installeert u eerst PhenoRipper van PhenoRipper.org en start pheno ripper. Om te beginnen met de analyse van afbeeldingen en om afbeeldingen en de bijbehorende metadata semi-automatisch te laden, klikt u op file structure om toegang te krijgen tot pheno loader in pheno loader. Selecteer de map die de dataset met afbeeldingen bevat en specificeer indien nodig de bestandsextensie van de afbeeldingen.Filter de bestanden die niet voor de analyse worden gebruikt. Klik op 'define markers' om de in het experiment gebruikte biomarkers te specificeren en deze aan de afbeeldingen te koppelen. Klik specifiek op een afbeeldingsbestand en selecteer vervolgens een deel van het bestandspad dat de biomarkers uniek identificeert.Voer tot slot een naam in voor elke biomarker. De volgende stap is om op 'define metadata' te klikken. Om informatie aan elke afbeelding te koppelen, klikt u op een afbeeldingsbestand en selecteert u vervolgens een deel van het bestandspad dat de afbeeldingsinformatie identificeert.Er verschijnt een venster waarin wordt gevraagd om een groepsnaam. Voer een naam in. De leden van de groep die uit de bestandsnaam zijn geëxtraheerd, worden in de groepstabel weergegeven.Deze informatie kan worden gebruikt bij de visualisatie van de analyseresultaten. Om aanvullende informatie toe te voegen die niet in de bestandsnaam staat, klikt u op de knop voor het toevoegen van aanvullende informatie, selecteert u vervolgens 'Metadatagroep toevoegen' en voert u de naam van de aanvullende groep in. Voer daarna elke waarde voor de vooraf gedefinieerde groep in; er is geen limiet aan het aantal aanvullende groepen dat kan worden toegevoegd.Klik ten slotte op create metadata file om een door pheno ripper leesbare annotatie van de gegevens te genereren, en selecteer het metadataveld dat de replicates in het experiment definieert om redundante bemonstering te voorkomen. Voor een dataset die replicates bevat, kan het samenvoegen ervan de prestaties verbeteren. Klik vervolgens op set parameters om de parameters te definiëren die nodig zijn om de dataset te verwerken.De te definiëren parameters bevinden zich in het linkerpaneel. Het rechterpaneel toont een voorbeeld van de dataset.Klik op de linker- of rechterpijl om tussen verschillende afbeeldingen te schakelen en kies een geschikte drempelwaarde om de cellulaire delen van de afbeeldingen ruwweg te identificeren. Een drempelwaarde wordt vooraf berekend door pheno ripper, maar kan worden aangepast met de schuifbalk boven de afbeelding om de markering van cellulaire regio's te verbeteren.Als een gekozen drempelwaarde niet voor alle afbeeldingen werkt, verlaag de drempelwaarde dan zodanig dat niet-cellulaire regio's worden opgenomen in plaats van cellulaire regio's weg te laten. Kies vervolgens een geschikte blokgrootte in pixels om de afbeelding onder te verdelen in een raster van blokken. Pas de blokgrootte aan om een gemiddelde van 20 tot 30 blokken per cel te verkrijgen bij het over het beeld leggen van het raster.Klik op het selectievakje voor het veld blokgrootte. Als de automatisch geschaalde afbeeldingen geen markers vertonen met de gewenste relatieve intensiteiten of als markers uit de analyse moeten worden verwijderd, gebruik dan de optie kanaalintensiteit aanpassen om cellulaire regio's op een subset van markers te identificeren. Selecteer de standaardoptie voor de gebruikte kanalen voor drempelwaarde.Keuzes voor andere parameters zijn gewoonlijk adequaat, maar pas deze indien nodig aan. Voer de analyse uit via de geavanceerde analyse-opties door op pheno rip in het hoofdapplicatiepaneel te klikken. Pheno ripper zal automatisch recurrente bloktypen in de afbeeldingen identificeren.Voor elke afbeelding worden fenotypische profielen gegenereerd op basis van de fracties van de verschillende bloktypen daarin. Verken de relaties tussen de fenotypische profielen van de afbeeldingen met behulp van de pheno-browser. De interface van de pheno-browser bestaat uit vier panelen.Het paneel linksboven is een grafische weergave van de relatieve overeenkomst tussen verschillende afbeeldingen en experimentele condities. De twee panelen aan de rechterkant tonen voorbeeldafbeeldingen van de geselecteerde condities. Het laatste paneel vergelijkt de fenotypische profielen van de geselecteerde condities.Zet eerst de groepering uit in het menu voor gegevensverwerking om individuele afbeeldingen te kunnen bekijken. Klik vervolgens op de uitschieters in het spreidingsdiagram en verwijder afbeeldingen van lage kwaliteit. Bepaal welk metadata-veld de basisunit voor vergelijking definieert.Om bijvoorbeeld geneesmiddelen te vergelijken, worden afbeeldingen met dezelfde waarde in het metadataveld drug gegroepeerd. Elk punt representeert nu een enkel geneesmiddel; gebruik het menu voor datavisualisatie om punten te kleuren of te labelen op basis van beschikbare metadata om de interpreteerbaarheid te vergroten. De afstand tussen de punten weerspiegelt de relatieve fenotypische gelijkenis van de overeenkomstige experimentele condities.Punten die dichter bij elkaar liggen, duiden op een grotere gelijkenis. De driedimensionale plot kan worden gedraaid door het selectievakje 'rotatable' aan te vinken. Sleep de muis over de grafiek terwijl u de linkermuisknop ingedrukt houdt.Selecteer twee verschillende punten om deze direct met elkaar te vergelijken. De afbeeldingspanelen tonen voorbeeldbeelden voor elk punt en het staafdiagrampaneel toont de bloktypen die de twee punten het beste van elkaar onderscheiden. Start het clustergram vanuit het clustergrammenu om een globaler overzicht te krijgen van de relatie tussen bloktypen en experimentele condities door zowel de bloktypen als de condities te groeperen.Deze weergave benadrukt de cellulaire fenotypes die groepen condities het beste onderscheiden. Pheno ripper werd gebruikt om HeLa-cellen te analyseren die fluorescent gekleurd waren voor DNA, actine en alfa-tubuline, en die werden afgebeeld na behandeling met histondeacetylase-remmers, microtubuli-doelgerichte geneesmiddelen en DNA-beschadigende geneesmiddelen. De voorgronddrempel van deze afbeeldingen werd ingesteld op 5% en de blokgrootte op 20 pixels; de analyse van deze dataset nam ongeveer 10 minuten in beslag op een standaard desktopcomputer.De interface van de pheno browser werd gebruikt om de resultaten te verkennen. De relatieve fenotypische overeenkomsten tussen afbeeldingen worden gevisualiseerd met behulp van multidimensionale schaling. Elk punt vertegenwoordigt een enkele afbeelding, gekleurd op basis van het werkingsmechanisme van het betreffende geneesmiddel.Deze grafiek laat zien dat fenotypische profielen kunnen worden gebruikt om geneesmiddelen te groeperen op basis van hun werkingsmechanisme. Beeldvormingsartefacten, zoals porievleaving en lege frames, waren eenvoudig te identificeren omdat ze duidelijk opvielen als uitschieters. Een clustrogram van de gegevens koppelt deze groepering aan de hier getoonde fenotypische profielen.Elke rij vertegenwoordigt een enkel geneesmiddel en elke kolom een bloktype. De grijswaarden weerspiegelen de fenotypische profielen. Een lichtere waarde duidt op een hoger aandeel van dat bloktype; hiërarchische clustering scheidt de verschillende geneesmiddelen grotendeels naar geneesmiddelenklasse.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in 10 minuten worden uitgevoerd mits deze correct wordt toegepast. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals IRA-profilering, worden uitgevoerd. Dit helpt bij het beantwoorden van aanvullende vragen, zoals hoe verschillende genen vergelijkbare pathways beïnvloeden.

rapid-analysis-and-exploration-of-fluorescence-microscopy-images

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wij ontwikkelden een software platform dat Imaris Neuroscience, ImarisXT en MATLAB om de veranderingen in morfologie van een ongedefinieerde vorm uit driedimensionale confocale fluorescentie van afzonderlijke cellen te meten gebruikt. Deze nieuwe benadering kan worden gebruikt om veranderingen in celvorm na receptor activatie kwantificeren en dus een mogelijke extra hulpmiddel voor drug discovery.

Een analytisch instrument dat cellulaire morfologie Veranderingen van Drie-dimensionale Fluorescentie afbeeldingen kwantificeert

Autofagie is een alomtegenwoordige proces waarmee cellen om eiwitten en organellen degraderen en te recyclen. We passen geavanceerde fluorescentie microscopie te visualiseren en kwantificeren van de kleine, maar essentiële, fysieke veranderingen geassocieerd met de inductie van autofagie, waaronder de vorming en verspreiding van autofagosomen en lysosomen, en hun fusie in autolysosomes.

Kwantitatieve analyse van Autophagy met Advanced 3D Fluorescentiemicroscopie

We presenteren een eenvoudig protocol voor fluorescentie microscopie films van groeiende gistcellen, en een GUI-gebaseerde software pakket om eencellige tijdreeks gegevens te extraheren verkrijgen. De analyse omvat geautomatiseerde afstamming en verdeeldheid tijd opdracht geïntegreerd met visuele inspectie en handmatige curatie van bijgehouden gegevens.

Het verwerven Fluorescentie Time-lapse films van Budding gist en analyseren van Single-cell Dynamics behulp enten

Gepresenteerd is een flexibele informatica workflow waardoor multiplex-image-based analyse van fluorescent gelabelde cellen. De workflow kwantificeert nucleaire en cytoplasmatische markers en berekent marker translocatie tussen deze compartimenten. Procedures zijn voorzien verstoring van cellen met siRNA en betrouwbare methode voor het merkerdetectie door indirecte immunofluorescentie in 96-well formaat.

Workflow voor High-inhoud, individuele cel Kwantificering van fluorescente merkers van Universal Microscoop gegevens, Ondersteund door Open Source Software

Accurate kwantificering van vesiculaire transportgebeurtenissen levert vaak sleutelinzichten op in de rol van specifieke eiwitten en de effecten van mutaties. Dit artikel presenteert methoden voor het gebruik van superecliptic pHluorin, een pH-gevoelige GFP-variant, als een hulpmiddel voor kwantificering van endocytische gebeurtenissen in levende cellen met behulp van kwantitatieve fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie.

Toepassingen van pHluorin voor Quantitative, Kinetic en High-throughput analyse van de Humor in gist

We presenteren een open source hoog gehalte analyse (HCA) instrument gebruik te maken van geautomatiseerde fluorescentie lifetime imaging (FLIM) voor het testen van eiwit interacties met behulp van Förster resonance energy transfer (FRET) op basis van uitlezingen. Data-acquisitie voor deze openFLIM-HCA instrument wordt bestuurd door software geschreven in μManager en data-analyse wordt uitgevoerd in FLIMfit.

Open Source High Content Analysis Door gebruik te maken van de automaten Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Hier beschrijven we een protocol voor de automatische segmentatie van fluorescently geëtiketteerde weefsels op dia's met behulp van een widefield high-inhoudsanalyse systeem (WHCAS). Dit protocol heeft brede toepassingen op elk gebied waarbij de kwantificatie van fluorescente markeringen in biologische weefsels waaronder de biologische wetenschappen, medische techniek en Gezondheidswetenschappen.

Geautomatiseerde dia scannen en segmentatie in Fluorescently-geëtiketteerden weefsels met behulp van een analysesysteem Widefield High-inhoud

Spectrale beeldvorming is uitgegroeid tot een betrouwbare oplossing voor de identificatie en scheiding van meerdere fluorescentie signalen in een enkel monster en kan gemakkelijk signalen van belang onderscheiden van achtergrond of auto fluorescentie. Excitatie-Scanning Hyperspectrale beeldvorming verbetert deze techniek door de benodigde beeldverzamelings tijd te verlagen en tegelijkertijd de signaal-ruis verhouding te verhogen.

Excitatie-Scanning hyperspectrale beeld microscopie om fluorescentie signalen efficiënt te discrimineren

We presenteren een vrij beschikbare workflow gebouwd voor snelle verkenning en nauwkeurige analyse van cellulaire lichamen in specifieke celcompartimenten in fluorescentiemicroscopie beelden. Deze gebruiksvriendelijke workflow is ontworpen op de open-source software Icy en maakt ook gebruik van ImageJ functionaliteiten. De pijplijn is betaalbaar zonder kennis van beeldanalyse.

Substructuur Analyzer: Een gebruiksvriendelijke workflow voor snelle verkenning en nauwkeurige analyse van cellulaire lichamen in fluorescentiemicroscopie beelden

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het optisch extraheren en catalogiseren van aangeboren cellulaire fluorescentiehandtekeningen (d.w.z. cellulaire autofluorescentie) van elke individuele levende cel verdeeld in een driedimensionale ruimte. Deze methode is geschikt voor het bestuderen van de aangeboren fluorescentiesignatuur van diverse biologische systemen met een eencellige resolutie, waaronder cellen van bacteriën, schimmels, gisten, planten en dieren.

Reconstructie van eencellige aangeboren fluorescentiehandtekeningen door confocale microscopie

Een toegankelijke, open-source microfluïdische workflow wordt gepresenteerd voor de geparallelliseerde analyse van plasmideretentie in bacteriën. Door fluorescentiemicroscopie toe te passen om de aanwezigheid van plasmide in eencellige microkolonies in gelmicrodruppels te kwantificeren, biedt deze methode een nauwkeurig, toegankelijk en schaalbaar alternatief voor traditionele plaattelling.

Plasmidestabiliteitsanalyse met open-source druppelmicrofluïdica

Ontdek een snelle workflow voor fluorescentiemicroscopie-analyse met het PhenoRipper-platform. Deze methode identificeert automatisch fenotypische profielen en verkort de analyse tijd aanzienlijk.

Snelle analyse en verkenning van fluorescentiemicroscopie Afbeeldingen

Meer video's verkennen