Activering en waardering van NLRP3 inflammasome activiteit met behulp van IL-1β in Human Monocyt-afgeleide dendritische cellen
May 22nd, 2014
Dendritische cellen (DCs) scheiden IL-1β reactie op TLR8 erkenning van synthetische purine, R848, gevolgd door NLRP3 inflammasome activering met nigericine derhalve IL-1β kunnen worden gebruikt om NLRP3 inflammasome te meten. Intracellulaire cytokine kleuring, immunoblotting en ELISA worden gebruikt om NLRP3 inflammasome priming en activering van IL-1β expressie nauwkeurig te meten.
Het algemene doel van de volgende experimenten is om inflammasoomactiviteit in humane dendritische cellen in vitro te observeren met behulp van eenvoudige IL een bèta meetmethoden. Voeg eerst R 8 48 toe aan de cellen om intracellulaire pro IL een bèta expressie te induceren. Voeg vervolgens nige toe om NLRP drie inflammasoomvorming te activeren.
Dat leidt op zijn beurt tot de splitsing van pro IL een bèta in volwassen IL een bèta vóór secretie. Verzamel vervolgens de monsters en meet de intracellulaire pro IL een bèta en de extracellulaire volwassen IL een bèta resultaten verkregen door de secretie van IL een bèta te meten uit geprimede en geactiveerde cellen door immunofluorescentie, western blot en eli. A detectie toont aan dat het primen van humane DCS resulteert in de intracellulaire pro IL een bèta productie in R 8 48 geprimede cellen en secretie van IL een bèta uit cellen die zowel geprimed als geactiveerd zijn met Nigeriaanse juris.
Deze methode kan inzicht geven in de rol van het NLRP drie inflammasoom in de humane dendritische celrespons op synthetische liganden. Het kan ook worden toegepast op andere systemen die zijn ontworpen om fysiologische triggers zoals bacteriën, virussen en auto-inflammatoire ziekten te testen. Verdeel 200 microliter vers geïsoleerde monocyt-afgeleide dendritische cellen in hun rusttoestand in een 96-well ronde bodemplaat.
Begin met de vier standaardvoorwaarden van niet-geprimeerde negatieve controle, alleen priming, alleen activering en priming gevolgd door activering. Neem vervolgens volgens het experimentele ontwerp verdunningscontroles op voor R 8 48 en nissin voor downstream intracellulaire cytokinekleuringsassays. Voeg duplicaten toe voor de isotype-controles om het inflammasoom te primen. Voeg R 8 48 toe, voeg een 10 micromolar eindconcentratie toe aan de juiste putjes.
Plaats de cellen in een incubator bij 37 graden Celsius en 5%CO2 gedurende 18 uur. Voeg vervolgens nige toe bij een 20 micromolar eindconcentratie om het NLRP drie inflammasoom te activeren. Breng de culturen terug in de incubator gedurende nog eens zes uur om de monsters te oogsten, centrifugeer de kweekplaat bij 974 keer G gedurende drie minuten zonder de cellagepelletjes te verstoren.
Breng elk supernatant over naar een afzonderlijke ronde bodemplaat om cytokinesecretie te meten door EISA. Was vervolgens de cellulaire pelletjes drie keer met 200 microliter van een XPBS om alle extracellulaire IL een bèta uit de cellulaire monsters te verwijderen voor verdere analyse door een verscheidenheid aan technieken voor western blot detectie van pro IL een bèta lyce de cellen direct in 10 microliter denaturerend lysisbuffer. Na het overbrengen van de lysaten naar 1,5 milliliter einorbuizen, verwarm de monsters gedurende 10 minuten bij 100 graden Celsius voor fluorescerende detectie door middel van flowcytometrie van IL een bèta.
Voeg 100 microliter van 5%PHS-medium toe aan de cellulaire monsters en één microliter van fluorescent gelabelde antilichamen voor de fenotypemarkers of isotypecontrole, incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Na drie PBS-washes, fixeer de cellen met 100 microliter van 4%PFA gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Voeg vervolgens 100 microliter permeabele buffer toe gedurende 30 minuten, gevolgd door 62 nanogram anti IL een bèta FSE-antilichaam of isotypecontrole, incubeer monsters gedurende twee uur bij 37 graden Celsius.
Was de cellen drie keer met 200 microliter permeabele buffer en suspendeer ze in één XPBS. Wikkel de monsters in folie en bewaar ze bij vier graden Celsius. Als u IL een bèta detecteert door microscopie, kleurt u de cellen met dappy, voegt u berg toe en plaatst u een dekglas voorzichtig op een glasplaat.
Laat de berg overnacht drogen voordat u microscoopbeelden vastlegt voor fluorescerende detectie door flowcytometrie. Verzamel gegevens één monster per keer. Stel de voorwaartse en zijwaartse verstrooiingsgaten in op de levende cellen. Volgende poort op de CD 11 C positieve CD 14 negatieve cellen.
Analyseer tenslotte de MODC populatie op basis van pro IL een bèta kleuring in microscopie gegevensverwerving. Stel de belichtingstijd in met de positief gekleurde R 8 48 behandelde steekproef. Bepaal vervolgens het percentage pro IL een bèta expresserende MO dcs ease voor western blot detectie.
Laad het totale monstervolume op de polyacrylamidegel. Draai bij 140 volt tot de die voorkant de gel verlaat. Breng het eiwit van de polyacrylamidegel over op A-P-V-D-F immo op FL-membraan.
Blok het membraan met 5%BSA in TBST gedurende één uur. Incubeer met het primaire antilichaam onder het schudden bij vier graden Celsius voor een nacht. Na drie vijf minuten TBST-washes, incubeer met het secundaire antilichaam bij kamertemperatuur gedurende één uur na nog eens drie TBST-washes, beeld het membraan af bij het meten van gesecreteerde cytokinen door ELI SA. Equilibreer de monsters bij kamertemperatuur.
Centrifugeer de monsters om de supernatantcondensatie te consolideren en volg de instructies van de fabrikant voor de meting van IL een bèta intracellulaire cytokinekleuring voor pro IL een bèta, wat microscopie en feiten-uitlezingen van CD 11 C positieve CD 14 negatieve monocyt-afgeleide dendritische cellen mogelijk maakt. Beide technieken kunnen worden gekwantificeerd ten opzichte van een niet-geprimeerde of rustende celcontrole, evenals een isotypecontrole. Het percentage pro IL een bèta gekleurde cellen wordt vermenigvuldigd met de geometrische mediane van deze populatie om de mediaan van de fluorescerende intensiteit te verkrijgen.
De MFI is vergelijkbaar met de hoeveelheid pro IL een bèta die aanwezig is in de positief gekleurde cellen. Hierbij worden immunoblottechnieken gebruikt om pro IL een bèta uit de cellysaten te meten. Kwantitatieve gegevens worden uitgedrukt ten opzichte van een interne cellulaire controle, zoals bèta-tubuline, zoals verwacht.
Immunoblotting voor pro IL een bèta in NI Nigeriaanse behandelde cellen geeft een afname van pro IL een bèta. Dit wordt aangevuld door een gelijktijdige toename van IL een bèta in supernatanten, gemeten door E ELI a alleen een R 8 48
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie onderzoekt de activiteit van de NLRP3 inflammasoom in humane dendritische cellen door de meting van IL-1尾 secretie. Door R848 te gebruiken om pro-IL-1尾 expressie te induceren en nigericine voor inflammasoom activering, kunnen onderzoekers de priming en activering van dendritische cellen beoordelen.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Ontsteking
- Biologie van dendritische cellen
Achtergrond
- Dendritische cellen spelen een cruciale rol in de immuunrespons.
- IL-1尾 is een belangrijk cytokine dat betrokken is bij ontsteking.
- De NLRP3 inflammasoom is een sleutelcomponent in de activering van IL-1尾.
- Begrip van inflammasoom activiteit kan inzichten geven in immuunresponsen.
Doel van het onderzoek
- Om inflammasoom activiteit in humane dendritische cellen te observeren.
- Om een methode te ontwikkelen voor het meten van IL-1尾 als uitlezing voor inflammasoom activering.
- Om het begrip van de mechanismen achter dendritische cellen activering te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Inductie van pro-IL-1尾 expressie met behulp van R848.
- Activering van NLRP3 inflammasoom met nigericine.
- Meting van intracellulaire en extracellulaire IL-1尾 niveaus.
- Gebruik van immunofluorescence, western blot, en ELISA technieken.
Belangrijkste resultaten
- R848 priming leidt tot verhoogde intracellulaire pro-IL-1尾 productie.
- Nigericine activering resulteert in de secretie van volwassen IL-1尾.
- Zowel geprimede als geactiveerde dendritische cellen vertonen significante IL-1尾 expressie.
- De assays meten effectief de NLRP3 inflammasoom activiteit.
Conclusies
- IL-1尾 dient als een betrouwbare marker voor NLRP3 inflammasoom activiteit.
- De gebruikte methoden bieden een eenvoudige benadering om dendritische cellen activering te beoordelen.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van immuunresponsen gemedieerd door dendritische cellen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Measuring NLRP3 inflammasome activity via IL-1β secretion in human monocyte-derived dendritic cells provides a physiologically relevant system for target validation in immunomodulatory drug discovery. This approach enables mechanistic de-risking by linking compound effects to a key innate immune pathway, supporting predictive confidence in early-stage programs targeting inflammatory diseases. The use of human-derived cells enhances translational continuity and reduces species-specific bias in preclinical assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of NLRP3 as a therapeutic target by measuring functional inflammasome activation in human dendritic cells.
- Operational Value: Provides a quantitative readout (IL-1β secretion) to distinguish specific NLRP3 activation from off-target inflammatory effects.
- Predictive Value: Supports target hypothesis testing through dose- and time-dependent priming with R848 and activation with nigericin.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes a standardized workflow using immunofluorescence, western blot, and ELISA for IL-1β detection across intracellular and extracellular compartments.
- Reproducibility: Defines priming (R848) and activation (nigericin) conditions with defined concentrations and timing to enable consistent inflammasome triggering.
- Scalability: Utilizes 96-well plate format with duplicate controls and isotype controls for high-throughput compatible screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly models human inflammasome biology, avoiding murine system limitations in studying autoinflammatory or infectious disease pathways.
- Translational Continuity: Measures both pro-IL-1β (intracellular) and mature IL-1β (secreted) to capture full inflammasome signaling from transcription to cytokine release.
- Mechanistic De-risking: Confirms NLRP3 specificity by showing IL-1β secretion only in primed-plus-activated conditions, not with agonists alone.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, where functional confirmation of NLRP3 modulation informs go/no-go decisions before preclinical investment.
- Discovery Biology: Tests therapeutic hypotheses by measuring inflammasome-dependent IL-1β release as a downstream readout of NLRP3 engagement.
- Screening: Delivers assay-ready dendritic cells with standardized priming and activation steps for compound screening campaigns.
- Analytics: Provides multiplexable readouts (IF, WB, ELISA) enabling quantification of pro- and mature IL-1β for mechanism-of-action profiling.
- Translational Research: Uses human monocyte-derived dendritic cells to improve relevance to human immune responses in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable inflammasome activity platform applicable to diverse immunomodulators and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by anchoring compound effects to NLRP3-dependent IL-1β maturation and secretion.
- Operational Value: Delivers standardized, quantitative cytokine measurements across multiple detection platforms for cross-site consistency.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by validating target engagement in a human immune context prior to preclinical development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of NLRP3 modulators based on functional activity in human dendritic cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human cell culture and differentiation of monocytes to dendritic cells.
- Depends on access to immunofluorescence, western blot, and ELISA instrumentation for IL-1β detection.
- Necessitates standardization of R848 (10 μM, 18 hr) and nigericin (20 μM, 6 hr) dosing across laboratories.
- Involves adaptation considerations when extending to other stimuli (e.g., pathogens, crystals) or disease-relevant dendritic cell states.
- Limited by donor variability in primary monocyte-derived dendritic cells, requiring internal controls for normalization.
