Name: Activering en waardering van NLRP3 inflammasome activiteit met behulp van IL-1β in Human Monocyt-afgeleide dendritische cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Leer NLRP3-inflammasoomactiviteit meten in humane dendritische cellen via IL-1β-aflezingen. Deze methode gebruikt R848 en nigericine om priming en activering te beoordelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Olivier Manches, Ph.D., Davor Frleta, Ph.D., en Meagan O&#39;Brien, MD erkennen voor hun steun en feedback. Dit onderzoek werd gesteund door het Nationale Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekte en aangevuld met financiering van NIH verleent Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards voor Individuele predoctorale beurzen (F31) om diversiteit in Health-Related Research (AI089030) en RO1 (AI081848 bevorderen ).

Ethiek Verklaring: Onderzoek monsters worden verkregen en opgeslagen voor onderzoek met toestemming van donoren. Alle monsters worden gecodeerd of geanonimiseerd vóór gebruik. Dit protocol volgt de richtlijnen van onze Institutional Review Board. 1. Differentiatie van de humane perifere bloed monocyten in monocyten afgeleide dendritische cellen. Opmerking: menselijke buffy coats dienen als bron van menselijke perifere bloedcellen (PBMC) en werden verkregen van New York Blood Center (New York, NY). Bloeddonoren zijn gezonde vrijwilligers. De 5 dagen procedure begint met de beplating van humane perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) op weefselkweek kolven 35,36. Opmerkelijke verschillen van de gepubliceerde protocollen zijn: <ol><li> Gebruik 225 cm 2 pyrogeenvrij polystyreen weefselkweekflessen met een filter dop tot een totaal van 2x10 8 PBMC per fles houden in plaats van 10 cm polystyreen weefselkweekplaats (58 cm2) (stap 1). </li><li> Bereid medium met 5% gemengd menselijk serum (PHS, 30 ml) in 500 ml RPMI-1640 + L-glutamine, 5 ml 1 M HEPES buffer en 1,4 ml 50 mg / ml Gentamicine (5% PHS media) gevolgd door filtratie door een 20 um filter. Voeg een totaal van 50 ml 5% PHS media per 225 cm 2 weefselkweek kolf. </li><li> Was gehandeld cellen drie keer met 25 ml vers RPMI-1640. Schud krachtig gedurende 5 seconden tijdens elke wasbeurt en zuig niet hechtende cellen (stap 4). </li><li> Voeg 190 ul van 400 IE / ul IL-4 en 380 pl van 100 IE / ul GM-CSF per fles (stap 3) op dag 0, 2 en 4. Dag 0 wordt gedefinieerd als de dag PBMC&#39;s eerst worden uitgeplaat in stap 1 (stap 8). </li><li> Harvest dag 5 moDCs bij een concentratie van 1x10 6 cellen / ml (stap 15). </li><li> Gebruik moDCs onmiddellijk in hun rusttoestand. Stappen 17-22 zijn nooit uitgevoerd. Opmerking: De monsters moeten zo snel mogelijk na afname worden verwerkt voor de beste resultaten. </li><li> Aliquot moDCs bij een concentratietie van 2x10 5 cellen / putje (200 ul / putje van de 1x10 6 cellen / ml) in een 96 putjes met ronde bodem plaat (Western blot, ELISA, FACS) of op een poly-L-lysine behandelde chamberslide (microscopie) voor experimenten . Let op: Er zijn dan minstens 4 voorwaarden: Geheel gestimuleerde (negatieve controle), priming, alleen op de activering en priming gevolgd door activering. Voorwaarden kan worden uitgebreid tot verdunner controles voor R848 en nigericine omvatten indien gewenst. Als de stroomafwaartse assay ICS, duplicaten nodig voor isotype controles. </li></ol> . 2 Het voorbereiden van de inflammasome - Signaal 1 <ol><li> Reconstitueer gevriesdroogd R848 in DMSO volgens de instructies van de fabrikant. Verdunnen werkvoorraad bij RT met RPMI-1640. </li><li> Voeg R848 bij een 10 uM uiteindelijke concentratie te putten voor 18 hr eigenen. Plaats cellen in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2. </li></ol> 3 activeren NLRP3 inflammasome -. Signal2 <ol><li> Reconstitueer gevriesdroogd nigericine in ethanol volgens de instructies van de fabrikant. Verdun werkvoorraad bij KT met RPMI-1640 voor het toevoegen aan de passende voorwaarden. </li><li> Voeg nigericine op 20 uM eindconcentratie en terug naar de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 6 uur. Geen wasstappen plaatsvinden tussen priming en tijdens de activering. Opmerking: Afscheiding van IL-1β wordt verhoogd door de aanwezigheid van calcium ionoforen, brefeldine A, monensine, dinitrofenol of carbonyl cyanide chlorophenylhydrazone 37, 38. Derhalve wordt toevoeging van deze secretoire remmers niet aanbevolen bij het analyseren inflammasome priming of activiteit omdat afscheiding van IL-1β zal veranderen. </li></ol> 4. IL-1ß Sample Collection <ol><li> Centrifugeer de plaat met cellen en bovenstaande vloeistoffen bij 974 xg gedurende 3 minuten. </li><li> Zonder de celpellet, zuig de supernatant en transfer alseparate ronde bodem plaat om cytokineafscheiding meten van de bovenstaande vloeistoffen. Opmerking: Supernatanten tijdelijk bij -20 ° C worden opgeslagen of -80 ° C voor lange termijn opslag. </li><li> Was de cellulaire pellets driemaal met 200 ul van 1 x PBS bij 974 xg gedurende 3 min elk extracellulair IL-1β van de cellulaire monsters te verwijderen. Opmerking: Bij het wassen cel pellets uit een 96 wells plaat, verwijder de was door een snelle plaat inversie in een opvangbak, zodat het monster niet storen. </li></ol> 5. Meten IL-1ß Van cellulaire en Supernatantmosters <ol><li> Intracellulaire Cytokine kleuring (ICS): De ICS-protocol is onder 39, 40 beschreven. Let op: niet de cellen niet op te schorten indien de downstream-test is microscopie. Alle wassingen en wensen moet gebeuren zonder de cellaag / pellet (afhankelijk van de stroomafwaartse assay). <ol><li> Voeg 100 ul van 5% PHS media in geschikte putjes. Toevoegengeschikte (ongeveer 1 μl/2x10 5 cellen of 1 gl / putje) van fluorescent gelabelde α-CD11c en α-CD14 (fenotype markers, kloon B-Ly6 en MφP9, respectievelijk) of isotype controle met betrekking tot de cellen gedurende 10 minuten bij RT in het donker. </li><li> Was driemaal met 1 x PBS bij 974 xg gedurende 3 minuten. </li><li> Fixeer de cellen door toevoeging van 100 pl 4% PFA gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Pauze Point: Wassen met 100 ul 1x PBS bij 974 xg gedurende 3 min en bewaar bij 4 ° CO / N in 1x PBS. </li><li> Voeg 100 ul permeabilisatie buffer cellen gedurende 30 minuten. Opmerking: permeabilisatie buffer bestaat uit 1x PBS met 0,3% Triton X-100 en 1% runderserumalbumine (BSA) voor permeabilisatie. Niet storen hechtende cellen als downstream test is microscopie. </li><li> Voeg het juiste volume (ongeveer 62 ng antibody/2x10 5 cellen, of ongeveer 2,5 gl / putje) van α-IL-1β-FITC (kloon 8516) of isotype controle voor2 uur in een incubator bij 37 ° C. </li><li> Was de cellen drie maal met 200 ul permeabilisatie buffer bij 974 xg gedurende 3 minuten in het donker. </li><li> Optioneel: Vlek met DAPI, voeg inbedmiddel en plaats dekglaasje voorzichtig op een glasplaatje. Laat inbedmiddel te genezen O / N voor het vastleggen van microscopie beelden. </li><li> Het verwerven van de gegevens door FACS of microscopie. Opmerking: Vergelijk de isotype voor elke voorwaarde om de juiste vlekken bij het analyseren door FACS of microscopie. <ol><li> FACs: Bemachtig een monster per keer. Stel de FSC / SSC hek aan de levende cellen, gevolgd door gating op CD11c + CD14 - cellen voor het analyseren van de MoDC bevolking pro-IL-1β kleuring. </li><li> Microscopie: Stel de belichtingstijd met behulp van de positieve kleuring monster - R848 behandeld. Gebruik DAPI + pro-IL-1β + en DAPI + pro-IL-1β - het percentage pro-IL-1β + expressie moDCs bepalen. </li></ol></li></ol></li><li> SDS-Pagina: immunoblotting uitgevoerd pro-IL-1β detecteren. Opmerking: De hieronder beschreven techniek is samengesteld uit standaard immunoblotting techniek, gradiënt 4-20% polyacrylamide gel, en fluorescente of chemiluminescente detectie 41, 42. <ol><li> Lyse cellen direct in 10 pl denaturerende lysis buffer (5 ul β-mercaptoethanol/950 pl Laemmli monsterbuffer, gevolgd door verdunning 1:1 met cellysis buffer). Transfer lysaat 1,5 ml Eppendorf buisjes. </li><li> Warmte lysaat op een droge plaat gedurende 10 minuten bij 100 ° C. </li><li> Spin lysaat bij 20.800 xg een minicentrifuge gedurende 1 min naar het vloeistofvolume concentreren. Pauze punt: monsters bij -20 ° C worden ingevroren voor korte termijn opslag. </li><li> Laad het totale volume op de polyacrylamidegel. Ren 140 V door de gel doos voor ongeveer 1 uur, of totdat de kleurstof voorkant loopt uit de bodem van de gel. </li><li> Breng het eiwit uit de polyacrylamidegel op een PVDF Immobilon-FL membrane gedurende 90 minuten bij 100 V. Blok het membraan met 5% BSA in Tris gebufferde zoutoplossing / 0,1% Tween-20 (TBS-T) gedurende 1 uur. Opmerking: PVDF Immobilon-FL is het beste voor gebruik met fluorescerende detectie. Een membraan met een andere samenstelling wordt aanbevolen voor andere detectietechnieken om het signaal te verhogen tot achtergrond verhouding. </li><li> Verdun primaire en secundaire antilichamen in 10 ml van 5% BSA / TBS-T. Voer primair antilichaam incubatie bij 4 ° CO / N onder schudden en secundair antilichaam bij kamertemperatuur gedurende 1 uur onder schudden. </li><li> Was het membraan 3 maal met TBS-T gedurende 5 minuten onder schudden tussen primaire en secundaire antilichaam incubatie en weer tussen secundaire incubatie en beeldvorming. Opmerking: Banden kunnen worden gedetecteerd met fluorescente of chemiluminescente detectie. Volg de instructies van de fabrikant voor de detectie. </li></ol></li><li> ELISA: Monsters die voor opslag worden ingevroren moeten in evenwicht te RT voor de analyse. Spin down monsters in een centrifuge om supernatant condens consoliderenatie. De instructies van de fabrikant voor het meten van IL-1β. Opmerking: In dit protocol IL-1β wordt specifiek gemeten; Gelijktijdige meting van TNFa, IL-6, en immuunmodulerende cytokine IL-10 waarborgen de juiste voorwaarden worden gevuld. </li></ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Inflammatoire cytokines zijn integraal in het sturen van het aangeboren en adaptieve immuunrespons tegen virale infecties te bestrijden. Afgescheiden IL-1β is aangetoond verhogen tijdens Influenza infectie 3, 43, 44. Het precieze mechanisme waardoor deze cytokinen worden verwerkt in reactie op virale erkenning humane dendritische cellen niet volledig begrepen. Myeloïde DC isolatie kits zijn duur en tijdrovend. Isolatie kits en FAC sortering kan onbedoeld stress of activeren van de cellen. Daarnaast is er vaak...

Activering van aangeboren immuunsysteem moet adaptieve immuunreacties sturen tijdens infectie, ziekte en vaccinatie 7. Dendritische cellen zijn de meest krachtige antigeen-presenterende cellen van het aangeboren immuunsysteem; Zij zijn gespecialiseerd voor de opname van antigenen, migratie naar lymfeklieren en activatie van naïeve CD4 + en CD8 + cytolytische T-cellen 8-10. Om een ​​snelle detectie van pathogenen in staat het aangeboren immuunsysteem maakt gebruik van tal van kiembaan gecodeerde patroonherkenning receptoren (PRR) dat geconserveerde pathogeen afgeleide motieven of gastheer afgeleide markers van cel stress en schade te herkennen. Toll like receptoren (TLR&#39;s) zijn membraangebonden patroonherkenning receptoren die bepaalde extracellulaire phagocytized pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) en gevaar geassocieerde moleculaire patronen (dempt) herkennen. Daarentegen knipoog like receptoren (NLRs) zijn cytosolische en reageren op een breed scala van PAMPs en DAMPs. Knikken like receptoren opnieuwpresenteren een tweede verdedigingslinie tegen pathogenen die celoppervlak en endocytische PRRs ontwijken. De interactie van pathogeen afgeleide of &quot;gevaar&quot; verbonden factoren TLR-liganden en NLR leidt tot een toestand van DC rijping leidt tot een verhoogde DC interactie met andere cellen en stimulering van T-cellen en natuurlijke killer cel activatie 11. Interleukine-1β is een cruciaal onderdeel van de afweer tegen infecties. Bij herkenning van een micro-organisme, de zeer pro-inflammatoire cytokine IL-1β, wordt uitgescheiden en functioneert als een chemo attractant en activator van aangeboren en adaptieve immuunsysteem cellen. In vivo IL-1β is grotendeels verantwoordelijk voor de acute fase respons waaronder koorts en inflammatoire cytokine synthese 12. De meeste NLRs bevatten C-terminale leucine rich repeat domein waarvan wordt gedacht dat functioneert ligand detectie, een centrale nucleotide bindend domein (NACHT) die important voor NLRP3 oligomerization, en een N-klem effector domein (PYD in NLRP3) dat signaaltransductie bemiddelt naar stroomafwaartse doelwitten via eiwit-eiwit interacties. De NLRP3 eiwit bepaalt de meest intensief bestudeerde inflammasome complex. Dit eiwit is een lid van de familie NLR en heeft de mogelijkheid om een ​​multi moleculaire eiwitcomplex samengesteld NLRP3, de adaptor eiwit PYCARD (ook bekend als ASC) en ICE vormen. Bij inflammasoom activering PYCARD bindt aan NLRP3 N terminale domeinen en werft ICE via caspaseactivering en werving domein (CARD) domeinen. Interleukine-1 omzettend enzym wordt aanvankelijk geproduceerd als een zymogeen dat een CARD motief aan zijn N-terminus. Inflammasoom formatie resultaten in het brengen van twee ICE moleculen dicht genoeg bij hun autokatalytisch activering induceren. Inflammasome complex is noodzakelijk voor het activeren ICE waardoor deze cytoplasmatische pro-IL-1β omzetten cytokine rijpen. Succesvolle secretie van IL-1β in DCs vereist sensing van twee verschillende en onafhankelijke gevaar signalen. Eerste, TLR sensing van PAMPs, DAMPs of cytokine signaling (TNF of IL-1β) veroorzaakt een verhoogde expressie van cytoplasma pro-IL-1β eiwit expressie. Een tweede, vaak verschillend, signaal nodig inflammasome complexvorming vóór ICE rijping. Enkele inflammasoom stimulerende signalen omvatten bacteriële porie vormende toxinen (zoals nigericine), lysosomale verstoren kristallen (zoals monosodium uraat kristallen, MSU) en extracellulair ATP. De upstream-mechanisme dat leidt tot inflammasome activering NLRP3 door deze diverse activatoren is onduidelijk. Onderzoeken naar signalering stroomopwaarts van inflammasome formatie stelt dat intracellulaire gebeurtenissen, zoals inductie van hypokaliëmie of reactive oxygen species (ROS) indirect activeren inflammasome 13-28. Onder de verschillende virale activatoren van de NLRP3 inflammasome is influenza, waarbij b voorzietOTH de primaire en secundaire signaal dat nodig is voor IL-1β secretie 3, 29-33. Gebruik makend van muis NLRP3 knockout modellen werd gevonden dat IL-1β secretie DCs NLRP3 afhankelijk 32. Bovendien NLRP3 knockout muizen minder aangetrokken leukocyten naar de plaats van infectie en ervaren hogere mortaliteit 2, 5. Twee recente papers suggereren een mechanisme voor NLRP3 inflammasome activatie tijdens Influenza virus infectie; eerste, priming door herkenning van viraal RNA door TLR7 en TLR8 (afhankelijk TLR expressie van de reagerende cel) of door detectie van commensale bacteriën door andere TLRs cytoplasmatische pro-IL-1β expressie te induceren, gevolgd door een tweede signaal, activering van NLRP3 inflammasoom vorming door virale ionkanaal eiwit M2 op het trans Golgi netwerk 33, 34. In de laatste stap, activering van de NLRP3 inflammasome wordt bewerkstelligd door verstoring van de intracellulaire ionische &lt;em&gt; milieu leidt tot ROS productie, die eenvoudig, gedetecteerd door NLPR3 als signaal naar de inflammasome vormen. De precieze mechanisme van activatie inflammasome stroomopwaarts van ICE activiteit gedurende Influenza infectie nog steeds onduidelijk. Dit werk beschrijft een techniek voor het bestuderen van de waardevolle NLRP3 inflammasome in menselijke moDCs die kan worden gebruikt als een basis voor verder onderzoek van de pathway DC gebaseerd IL-1β secretie in reactie op TLR8 ligatie met R848 gevolgd door activering van de inflammasome door een goed bekende activator van NLRP3, nigericine. Variaties van deze werkwijze kan worden gebruikt met andere celtypen waaronder, maar niet beperkt tot: monocyten, macrofagen, andere DC subsets en epitheelcellen.

<table><tbody><tr><td>IL-4</td><td>R&amp;D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Genzyme</td><td>NDC 58468-0180-2</td><td>We verwerven dit artikel via onze plaatselijke apotheek met een recept</td></tr><tr><td>RPMI 1640 met L-glutamine</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Perifere bloedmononucleaire cellen</td><td>New York Blood Center</td><td></td><td>PBMC's werden geïsoleerd uit het bloed van gezonde donoren</td></tr><tr><td>12 putjes weefselkweekplaten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>96 putjes ronde bodem weefselkweekplaten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-IL-1&beta;-FITC</td><td>R&amp;D</td><td>IC201F</td><td></td></tr><tr><td>FITC isotype controle</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-213</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-&beta;-Tubulin</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9014</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-IL-1&beta;</td><td>R&amp;D</td><td>mab201</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Immobilon-FL membraan</td><td>Millipore</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>gradient 4-12% polyacrylamide gel</td><td>Bio Rad</td><td>161-1159</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli monster buffer</td><td>Bio Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Equitech Bio Inc</td><td></td><td>30% oplossing steriel/gefilterd</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>16% oplossing</td></tr><tr><td>Human inflammatoire cytokine bead array kit</td><td>BD</td><td>551811</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-nig</td><td></td></tr><tr><td>R848</td><td>3M Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-CD14</td><td>BD</td><td>340436</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td>Op locatie stockroom</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287-100mL</td><td></td></tr><tr><td><a>Nunc EasYFlask 225 cm2, Filter Cap, 70 ml werkvolume, 30/Cs</a></td><td>Thermo Scientific</td><td>159933</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu;M Steriele wegwerpfiltereenheden</td><td>Thermo Scientific</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Geit &alpha;-muis IRDye 800CW</td><td>Licor</td><td>926-32210</td><td></td></tr><tr><td>Ezel &alpha;-konijn IRDye 680RD</td><td>Licor</td><td>926-68073</td><td></td></tr><tr><td>Spectra multicolor brede bereik eiwitladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>26634</td><td></td></tr><tr><td>Tris Glycine SDS 10x</td><td>Bio Rad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>Tris Glycine 10x</td><td>Bio Rad</td><td>161-0734</td><td></td></tr><tr><td>Methanol - 4 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>A433P-4</td><td></td></tr><tr><td>8 kamer polystyreen vat weefselkweek behandelde glazen plaat</td><td>BD Falcon</td><td>354108</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr></tbody></table>

activering en waardering van nlrp3 inflammasome activiteit met behulp van il-1β in human monocyt-afgeleide dendritische cellen

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Ontstekingsprocessen gevolg van de secretie van interleukine (IL) -1 familie cytokinen door immuuncellen tot lokale of systemische inflammatie, weefselremodellering en reparatie en virologische controle 1, 2. Interleukine-1β is een essentieel onderdeel van de aangeboren immuunrespons en draagt ​​bij aan elimineren binnendringende ziekteverwekkers terwijl het voorkomen van de oprichting van persisterende infectie 1-5. Inflammasoom zijn de belangrijkste signalerende platform voor de activering van interleukine 1 omzettend enzym (ICE of Caspase-1). De NLRP3 inflammasoom vereist ten minste twee signalen in DCs tot IL-1β secretie 6 veroorzaken. Pro-IL-1β eiwitexpressie wordt beperkt in rustende cellen; dus een priming signaal vereist voor IL-1β transcriptie en eiwitexpressie. Een tweede signaal gedetecteerd door NLRP3 resulteert in de vorming van multi-eiwit NLRP3 inflammasome. Het vermogen van dendritische cellen om verantwoordelijkheidd de signalen vereist voor IL-1β secretie kan worden getest met behulp van een synthetisch purine, R848, die wordt waargenomen door TLR8 in menselijke monocyten afgeleide dendritische cellen (moDCs) prime cellen, gevolgd door activering van de NLRP3 inflammasome de bacteriële toxine en kalium ionofoor, nigericine. Monocyten afgeleide DCs zijn gemakkelijk geproduceerd in cultuur en geven significant meer cellen dan gezuiverde humane myeloïde DCs. De hier gepresenteerde methode verschilt van andere inflammasome assays die het gebruikt in vitro humane plaats van muizen afgeleide DCs waardoor voor de studie van de inflammasome in humane ziekten en infecties.

Deze technieken meten TLR8 priming met R848. Intracellulaire cytokine kleuring voor pro-IL-1β zorgt voor microscopie en FACS uitlezingen van CD14 - CD11c + moDCs. Beide technieken kunnen worden gekwantificeerd ten opzichte van een niet-geprimede of rusten, celcontrole en een isotype controle (figuren 1 en 2). Percentage van pro-IL-1β + kleuring cellen wordt vermenigvuldigd met het geometrische gemiddelde van de populatie het gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) te ...

Dendritische cellen (DCs) scheiden IL-1β reactie op TLR8 erkenning van synthetische purine, R848, gevolgd door NLRP3 inflammasome activering met nigericine derhalve IL-1β kunnen worden gebruikt om NLRP3 inflammasome te meten. Intracellulaire cytokine kleuring, immunoblotting en ELISA worden gebruikt om NLRP3 inflammasome priming en activering van IL-1β expressie nauwkeurig te meten.

Activering en waardering van NLRP3 inflammasome activiteit met behulp van IL-1β in Human Monocyt-afgeleide dendritische cellen

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Het algemene doel van de volgende experimenten is om de inflammasoomactiviteit in in vitro menselijke dendritische cellen waar te nemen met behulp van eenvoudige IL-1β-readout-assays. Voeg eerst R848 toe aan de cellen om de intracellulaire expressie van pro-IL-1β te induceren. Voeg vervolgens nigericine toe om de vorming van het NLRP3-inflammasoom te activeren.Dit triggert op zijn beurt de splitsing van pro-IL-1β tot matuur IL-1β vóór de secretie. Verzamel vervolgens de monsters en meet de intracellulaire pro-IL-1β en de extracellulaire mature IL-1β resultaten, verkregen door de secretie van IL-1β uit geprimde en geactiveerde cellen te meten via immunofluorescentie, western blot en ELISA. Een detectie toont aan dat priming van menselijke DC's leidt tot de intracellulaire productie van pro-IL-1β in R849-geprimde cellen en secretie van IL-1β uit cellen die zowel geprimd als geactiveerd zijn met nigericine.Deze methode kan inzicht verschaffen in de rol van het NLRP3-inflammasoom bij de respons van menselijke dendritische cellen op synthetische liganden. Het kan ook worden toegepast op andere systemen die zijn ontworpen om fysiologische triggers te testen, zoals bacteriën, virussen en auto-inflammatoire ziekten. Pipetteer aliquots van 200 µL vers geïsoleerde monocyt-afgeleide dendritische cellen in rusttoestand in een 96-well plaat met ronde bodem.Begin met de vier standaardcondities van een ongestimuleerde negatieve controle, enkel priming, enkel activatie en priming gevolgd door activatie. Voeg vervolgens, volgens het experimentele ontwerp, verdunningscontroles voor R 8 48 en nissin toe voor downstream intracellulaire cytokine-kleuringsassays; voeg duplicaten toe voor de isotype-controles om het inflammasoom te primen. Voeg R 8 48 toe, met een uiteindelijke concentratie van 10 micromolar in de betreffende wells.Plaats de cellen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 18 uur. Voeg vervolgens nigericine toe tot een uiteindelijke concentratie van 20 µM om het NLRP3-inflammasoom te activeren. Plaats de culturen voor nog eens zes uur terug in de incubator. Centrifugeer de cultuurplaat om de monsters te oogsten bij 974 ×g gedurende drie minuten, zonder de celpellets te verstoren.Overbreng elk supernatant naar een aparte ronde bodemplaat om de cytokinesecretie via EISA te meten. Was nu de celpellets drie keer met 200 µL XPBS om eventuele extracellulaire IL-1β uit de celmonsters te verwijderen voor verdere analyse met diverse technieken; voor western blot-detectie van pro-IL-1β lyseren de cellen direct in 10 µL denaturerende lysisbuffer. Nadat de lysaten zijn overgebracht naar 1,5 mL Eppendorf-buisjes, worden de monsters 10 minuten verhit op 100 °C voor fluorescentiedetectie van IL-1β via flowcytometrie.Voeg 100 µL 5% PHS-medium toe aan de celmonsters en één µL fluorescent gelabelde antilichamen tegen de fenotype-markers of de isotypescontrole; incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Fixeer na drie wasbeurten met PBS de cellen met 100 µL 4% PFA gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Voeg vervolgens 100 µL permeabilisatiebuffer toe voor 30 minuten, gevolgd door 62 ng anti-IL-1β FSE-antilichaam of isotypescontrole; incubeer de monsters gedurende twee uur bij 37 °C.Was de cellen drie keer met 200 µL permeabele buffer en resuspendeer ze in één XPBS. Wikkel de monsters in folie en bewaar deze bij 4 °C. Indien IL-1β via microscopie wordt gedetecteerd, kleur de cellen dan met DAPI, voeg monteermedium toe en plaats voorzichtig een dekglas op een objectglas.Laat de mount een nacht uitharden voordat er microscopiebeelden worden gemaakt voor fluorescentiedetectie via flowcytometrie. Verzamel de gegevens per monster. Stel de gates voor forward scatter en side scatter in op de levende cellen. Stel vervolgens de gate in op de CD 11 C-positieve CD 14-negatieve cellen.Analyseer ten slotte de MODC-populatie op basis van pro IL-1β-kleuring in de microscopische data-acquisitie. Stel de belichtingstijd in met het monster behandeld met positieve kleuring R 8 48. Bepaal vervolgens het percentage pro IL-1β-expresserende MO-dc's voor detectie via western blot.Laad het totale samplevolume op de polyacrylamidegel. Voer de elektroforese uit bij 140 volt totdat het kleurfront van de gel af is gelledere. Transfer het eiwit van de polyacrylamidegel naar een A-P-V-D-F immo on FL membraan.Blokkeer het membraan met 5% BSA in TBST gedurende één uur. Incubeer het membraan onder shaking bij vier graden Celsius gedurende de nacht met het primaire antilichaam. Na drie wasbeurten van vijf minuten met TBST volgt incubatie met het secundaire antilichaam bij kamertemperatuur gedurende één uur. Na nog drie TBST-wasbeurten wordt het membraan geïmageerd. Wanneer gesecreteerde cytokinen via ELISA worden gemeten, moeten de monsters worden geëquilibreerd bij kamertemperatuur.Centrifuge de monsters om de condensatie van het supernatant te consolideren en volg de instructies van de fabrikant voor de meting van IL-1β. Intracellulaire cytokinestaining voor pro-IL-1β maakt microscopie en flowcytometrie-uitlezingen mogelijk van CD11c-positieve CD14-negatieve monocyten-afgeleide dendritische cellen. Beide technieken kunnen worden gekwantificeerd ten opzichte van een niet-geactiveerde of rustende celcontrole, evenals een isotypecontrole. Het percentage pro-IL-1β-gekleurde cellen wordt vermenigvuldigd met de geometrische mediaan van deze populatie om de mediane fluorescentie-intensiteit te bepalen.De MFI is vergelijkbaar met de hoeveelheid pro IL one beta aanwezig in de positief gekleurde cellen. Hier worden immunoblottingtechnieken gebruikt om pro IL one beta uit de cellysaten te meten. Kwantitatieve gegevens worden, zoals verwacht, uitgedrukt relatief ten opzichte van een interne cellulaire controle zoals beta tubulin.Immunoblotting voor pro-IL-1β in behandelde NI Nigerian-cellen onthult een afname van pro-IL-1β. Dit wordt aangevuld door een gelijktijdige toename van IL-1β in supernatanten, gemeten met ELISA uitsluitend voor R 8 48, gevolgd door NI Nigerian-condities. Simultane meting van andere inflammatoire cytokinen zoals TNF-α, IL-10 en IL-6 bevestigt dat Niger specifiek de secretie van IL-1β veroorzaakt.De mate van priming is tijds- en dosisafhankelijk. Verdere experimenten, zoals het meten van de extracellulaire proteïneconcentratie, chemiluminescentiedetectie van rijpe IL-1β-generatie of het blokkeren van het inflammasoom, zouden helpen bepalen of extracellulaire IL-1β de rijpe gespleten vorm is en of de secretie van IL-1β afhankelijk is van de activiteit van het NLRP3-inflammasoom.

activation-measurement-nlrp3-inflammasome-activity-using-il-1-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Beschrijven we een simpele immunoassay om de productie van pro-inflammatoire cytokines, zoals IL-1 bèta productie, bij patiënten met autoinflammatory fenotypes te meten. Door het activeren van cellen in volbloed culturen met pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen, in het bijzonder met lipopolysaccharide, kan cytokine secretie gemakkelijk worden geëvalueerd in volbloed supernatants.

Nauwkeurige en eenvoudige meting van de pro-inflammatoire cytokine IL-1β met behulp van een volbloed stimulatie Assay

We beschrijven het gebruik van ImageStream technologie...

Quantitative Imaging van Lineage-specifieke Toll-like receptor-gemedieerde signalisatie in monocyten en dendritische cellen van de kleine monsters van menselijk bloed

This video demonstrates a method to detect NLRP3 inflammasome activation in macrophages using fluorescent reporter probes. The cells are treated with potassium ionophores and glycine to induce inflammasome assembly and caspase-1 activation. Fluorescent reporter probes visualize activated caspase-1, and cells are stained with a fluorescent dye for nuclei visualization.

Detection of Inflammasome Activation via Fluorescence Microscopy

This video demonstrates a technique to study NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3 (NLRP3) inflammasome formation in primary macrophages via immunofluorescence. The macrophages are first primed with bacterial lipopolysaccharide (LPS) to upregulate NLRP3 protein expression. Exposing the macrophages to nigericin—a potassium ionophore—leads to the activation of NLRP3 and the formation of inflammasomes, which are visualized via immunofluorescence.

An In Vitro Technique to Study Inflammasome Complex Formation in Macrophages

Dit protocol geeft een efficiënte en betrouwbare methode voor de menselijke THP-1 macrofagen met siRNA of plasmide-DNA te transfecteren door elektroporatie met hoge transfectie efficiëntie met behoud van hoge cel vitaliteit en volledige capaciteit macrofaag differentiatie en polarisatie.

Zeer efficiënte transfectie van Human THP-1 macrofagen door Nucleofection

Dit huidige protocol maakt gebruik van fluorescente reporters, in vivo labeling en intravitale beeldvormingstechnieken om het dynamische proces van neutrofiel priming in levende dieren te kunnen monitoren.

Intravitale Imaging van neutrofielen Priming gebruik van IL-1β-Promoter gedreven DsRed Reporter Muizen

Monocyt-afgeleide DC (MoDC) kleine hoeveelheden gevaar-geassocieerde moleculen kunnen voelen en zijn daarom gemakkelijk primer. Wij bieden een gedetailleerd protocol voor de isolatie van de MoDC uit bloed, tumoren en hun activering met immuuncomplexen terwijl het benadrukken van belangrijke voorzorgsmaatregelen die moeten worden overwogen om te voorkomen dat hun voortijdige activering.

Protocol van de isolatie van muis monocyt-afgeleide dendritische cellen en hun latere In Vitro activatie met Tumor immuuncomplexen

We beschrijven de detectie van NLRP3 inflammasome activering op cellulaire basis met behulp van fluorescentie microscopie en kleuring voor actieve caspase-1 en de adapter, ASC. Een lactaat dehydrogenase release assay wordt gepresenteerd voor het detecteren van lysis van de pyroptotic op basis van de bevolking. Deze technieken kunnen worden aangepast om te bestuderen van vele aspecten van inflammasome biologie.

Detectie van Inflammasome-activering en Pyroptotic celdood in lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen

MALT1 regelt aangeboren immuniteit, maar hoe dit gebeurt blijft vaag. We gebruikten de selectieve MALT1 paracaspase remmer MLT-827 te ontrafelen van de bijdrage van MALT1 aan het aangeboren signalering stroomafwaarts van Toll-like of C-type lectine-achtige receptoren, aan te tonen dat MALT1 de productie van myeloïde cytokines regelt, en "downstream" C-type lectine-achtige receptoren, selectief.

Myeloïde aangeboren signalering Pathway regelgeving door MALT1 Paracaspase activiteit

Dit protocol biedt onderzoekers een snelle, indirecte methode voor het meten van TLR-afhankelijke NF-кB/AP-1 transcriptiefactor-activiteit in een muriene macrofaag cellijn in reactie op een verscheidenheid aan polymere oppervlakken en geadsorbeende eiwit lagen die de micro omgeving van het biomateriaal implantaat modelleren.

Een macrophage reporter Celassay om Tolachtige receptor-gemedieerde NF-kB/AP-1-signalering op geadsorbeerde proteïne lagen op polymere oppervlakken te onderzoeken

Dit protocol beschrijft de workflow om monocyten-afgeleide macrofagen (MDM) te verkrijgen uit menselijke bloedmonsters, een eenvoudige methode om inflammatoire caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) -verslaggevers efficiënt in menselijke MDM te introduceren zonder de levensvatbaarheid en het gedrag van cellen in gevaar te brengen, en een op beeldvorming gebaseerde benadering om inflammatoire caspase-activering in levende cellen te meten.

Visualisatie van inflammatoire caspasen geïnduceerde nabijheid in menselijke monocyt-afgeleide macrofagen

Leer NLRP3-inflammasoomactiviteit meten in humane dendritische cellen via IL-1β-aflezingen. Deze methode gebruikt R848 en nigericine om priming en activering te beoordelen.

Activering en waardering van NLRP3 inflammasome activiteit met behulp van IL-1β in Human Monocyt-afgeleide dendritische cellen

Meer video's verkennen