Gebruik van Label-free Optische biosensoren om Modulatie van kaliumkanalen Detect door G-proteïne gekoppelde receptoren

Het algemene doel van het volgende experiment is het detecteren van modulatie van G-eiwitgekoppelde receptoren door kaliumkanalen, waarbij labelvrije resonantie-golflengte-graderende optische biosensoren worden gebruikt om dit te bereiken. Hiervoor worden HEK 293-cellen en HEK 293-cellen die stabiel de rat-natriumgeactiveerde kaliumkanaal slack B tot expressie brengen, geplaatst op een optische biosensorplaat met 384 putjes en gedurende de nacht geïncubeerd. Vervolgens wordt een nulmeting uitgevoerd van de massa nabij het plasmamembraan en worden agonisten van endogene G-eiwitgekoppelde receptoren of GPCR's toegevoegd. Als laatste stap wordt de signaalverandering als gevolg van GPCR-activatie gemeten en wordt de modulatie van deze respons door het kaliumkanaal berekend.

Uiteindelijk kan deze methode helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de velden van neurowetenschappen en cellulaire signalering door signaleringsmechanismen tussen G-eiwitgekoppelde receptoren en kaliumkanalen kwantitatief te meten. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van de huidige methoden om interacties tussen kanalen en eiwitten te bestuderen, zoals CO- en precipitatie-assays, zijn dat de assay kan worden uitgevoerd met levende cellen. Er is geen gebruik van exogene labels nodig, die de structuur van het interagerende eiwit zouden kunnen veranderen.

En tenslotte kunt u binnen levende cellen de interacties daadwerkelijk in realtime volgen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de signalering tussen GPCR's en kaliumkanalen, kan deze ook worden gebruikt om cellulaire responsen te bestuderen die voortkomen uit ligand-geïnduceerde veranderingen in celadhesie en spreiding, toxiciteit, proliferatie, migratie en eventuele veranderingen in de nabijheid van het plasmamembraan tot de optische biosensor.

De techniek heeft bovendien het potentieel om te worden ingezet bij de ontdekking van nieuwe therapeutische benaderingen voor ziekten die worden veroorzaakt door ionkanaal- of receptorafwijkingen, zoals veel channelopathieën, omdat het kan worden gebruikt als een high-throughput methode om de effecten van farmacologische agentia op kanaaleiwitinteracties te testen. We kregen voor het eerst het idee om deze methode te gebruiken toen we beseften dat het noodzakelijk was om een assay te ontwikkelen waarmee kanaaleiwitinteracties in levende cellen konden worden bestudeerd.

Begin de coating van een 384-wells optische biosensorplaat door een titaandioxideplaat 15 minuten te hydrateren met 20 µL steriel water van weefselkweekkwaliteit per well. Gebruik vervolgens een 16-kanaals pipetteerapparaat om de plaat één keer te wassen met 50 µL fosfaatgebufferde saline of PBS per well.

Voeg vervolgens 20 µL van een bereide fibronectine-werkoplossing toe aan elke put voordat u twee uur bij kamertemperatuur incubeert om de extracellulaire matrix of ECM te creëren na incubatie. Was de plaat één keer met 50 µL PBS per put; voeg daarna 40 µL van een bereide ovalbumine-werkoplossing toe aan elke put.

Incubeer de plaat vervolgens gedurende de nacht bij 4 °C om de plaat te blokkeren na binding van ovalbumine. Was de plaat drie keer met 50 µL PBS per well. Met ECM gecoate platen kunnen tot 48 uur worden bewaard bij 4 °C.

Verwijder het groeimedium van zowel de niet-gereseceerde HEK 2 93-cellen als de HEK 2 93-cellen die slack B stabiel tot expressie brengen en zijn gekweekt zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg vervolgens tripsine toe om de cellen van de plaat los te maken. Verzamel de cellen door middel van centrifugatie bij 1000 ×g gedurende één minuut.

Verwijder het tripsinmedium en resuspendeer de cellen in groeimedium. Bepaal met een hemocytometer of een automatische celteller de concentratie van de cellen en verdun de cellen tot het gewenste aantal cellen per putje om de effecten van verdamping tijdens de incubatie te minimaliseren. Voor deze experimenten is dat 1000 cellen per putje in een volume van 50 µL groeimedium.

De cellen werden op de biosensor geplaatst door 50 µL van de verdunde cellen in elke put te pipetteren; laat de aangehechte cellen vervolgens gedurende de nacht incuberen in groeimedium bij 37 °C en 5% CO2. Om de assay voor de resonance wavelength grading (RWG) optische biosensor voor te bereiden, wordt het groeimedium na de incubatie van de cellen verwijderd.

Was de cellen één keer met Hank's gebalanceerde zoutoplossing en voeg vervolgens 25 µL van de oplossing aan elke well toe. Plaats de biosensorplaat op de bind-scanner en laat de cellen één tot twee uur equilibreren op kamertemperatuur. Bereid ondertussen een aparte compoundplaat voor, waarvan de liganden van belang tijdens de assay aan de biosensorplaat zullen worden toegevoegd.

Voor deze assays werden 25 microliter van de oplossing met de verbinding toegevoegd aan elke put op de biosensorplaat, voor een totaalvolume van 50 microliter. Om de RWG optische biosensorassay uit te voeren, wordt met het scannersysteem een baselinemeting gedaan voor de putten A1 tot en met P12, wat de helft van de 384-puts plaat vertegenwoordigt. Gebruik een maximale resolutie van 3,75 microns per pixel voor de centrale 1,5 millimeter van elke put met de Bind Scan-software; deze baselinescan zal ongeveer 30 minuten duren.

Voeg vervolgens 25 µL van de verbinding-oplossingen toe aan elke well voor de wells A 1 tot en met P 12. Voer daarna een nulmeting uit voor de wells A 13 tot en met P 24. Nadat de nulmeting van deze wells is voltooid, voegt u 25 µL van de verbinding-oplossingen toe aan elke well van A 13 tot en met P 24.

Voer als laatste stap een meting uit na toevoeging van het compound voor wells A1 tot en met P12 en herhaal dit voor wells A13 tot en met P24. Om de assaygegevens te analyseren, opent u de bind assay-gegevens voor de baselinemeting in Windows en klikt u op de knop grid editor om celselectie mogelijk te maken. De software berekent de door de gebruiker gedefinieerde relevante metrieken; open de plug-ins, waaronder de cell finder en baseline, of stel de parameters in de function set in de cell finder in, zodat de cellen onderscheiden kunnen worden van de achtergrond van de biosensor.

Exporteer het celkaartbestand, dat de celvindersgegevens voor de baselinemeting bevat. Herhaal deze stappen voor de gegevens na toevoeging van de verbinding. Open vervolgens de baseline of plugin en importeer de celkaart van de baselinemeting.

De software berekent de verschuiving in de piekgolflengtewaarde of PWV tussen de achtergrond- en de data na toevoeging van de verbinding. Selecteer 'delta cell mean' voor de output van de gemiddelde verschuiving in PWV voor cellen. De gegevens kunnen vervolgens worden geëxporteerd naar Microsoft Excel voor verdere analyse.

Stabiel getransfecteerde Slack b HEK 2 93-cellen en controle-ongetransfecteerde HEK 2 93-cellen werden geplaatst met 1000 cellen per putje op 384-puts, ECM-gecoate RWG-biosensorplaten; dichtheidsgradiëntkaarten van de massa werden gegenereerd voorafgaand aan en 30 minuten na toevoeging van de verbinding met de bindscan.

Softwaregebieden die in rood worden weergegeven, representeren pixels die zijn geïdentificeerd als behorend tot cellen en gele lijnen onderscheiden de cellen van de grijze achtergrond van de plaat. De bind view-software werd gebruikt om de verschuiving in PWV na toevoeging van een GPCR-agonist te bepalen door de PWV na toevoeging van de verbinding af te trekken van de baseline PWV. Dit wordt weergegeven door een kleurovergang waarbij rood een positieve verschuiving in de piekgolflengtewaarde representeert en blauw geen verandering.

De endogene M1 muscarinereceptor tegen carbachol werd toegepast op zowel niet-getransfecteerde controle HEK 2 93-cellen als HEK 2 93-cellen die slack B stabiel tot expressie brachten, wat resulteerde in een positieve toename van de piekgolangtelengte vergeleken met de controlecellen. De slack B-getransfecteerde cellen vertoonden een grotere toename in de piekgolangtelengte. S-F-L-L-R NH twee, trifluoracetaatzout en het C-terminale trombinereceptor-activerend peptide pentapeptide, dat agonistische activiteit vertoont tegen de endogene GPCR protease-geactiveerde receptor één, vertoonden eveneens differentiële responsen in niet-getransfecteerde en slack B-getransfecteerde cellen.

Deze resultaten tonen aan dat de aanwezigheid van het Slack B-kanaal de verschuiving in PWV die optreedt bij activering van endogene G PCR in he K-cellen significant verhoogt, en demonstreeren de haalbaarheid van het gebruik van deze assay om interacties tussen kanaaleiwitten te bestuderen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een labelvrije optische biosensor-assay ontwikkelt en uitvoert. Zodra deze techniek beheerst is, kan deze in twee dagen worden uitgevoerd, mits de cellen en reagentia zorgvuldig zijn voorbereid tijdens het uitvoeren van deze procedure.

Het is belangrijk om te onthouden dat assayparameters, zoals het aantal uit te zaaien cellen, de incubatietijd van liganden, enzovoort, moeten worden geoptimaliseerd voor verschillende cellijnen. Zodra u deze procedure heeft uitgevoerd, kunt u andere methoden zoals R en AI gebruiken om te proberen vast te stellen welke specifieke eiwitten vereist zijn voor de waargenomen verandering in het signaal. Vergeet niet dat werken met menselijke celculturen extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het werken in een biologische veiligheidskabinet, altijd moeten worden getroffen tijdens het uitvoeren van deze procedure.