Name: Gebruik van Label-free Optische biosensoren om Modulatie van kaliumkanalen Detect door G-proteïne gekoppelde receptoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-10T19:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Leer hoe je labelvrije optische biosensoren gebruikt om modulatie van kaliumkanalen door G-proteïne gekoppelde receptoren te detecteren in HEK 293-cellen. Deze methode biedt inzicht in neurobiologische signaaloverdracht.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs zijn dank aan Dr Yangyang Yan in het laboratorium van Dr Fred Sigworth aan de Yale University voor de gulle donatie van HEK293 cellen die stabiel tot expressie rat Slack-B-eiwit. Daarnaast zijn de auteurs zijn dank aan Dr Sigworth voor cryo-elektronenmicroscopie homologiemodel van Slack getoond in de video-introductie. Dit onderzoek werd ondersteund door NIH Grants DH067517 en NS073943 te LKK

1. Cell Culture (Aangepast van Fleming en Kaczmarek 18) <ol><li> Kweekcellen in geschikte media groter dan 2 en kleiner dan 10 passages voor gebruik in deze test. Getransfecteerde HEK-293-cellen en HEK-293-cellen stabiel tot expressie rat Slack-B eiwit gekweekt in een helft Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle medium en een half Leibovitz&#39;s L-15 medium aangevuld met 10% hitte geïnactiveerd foetaal runderserum en antibiotica. 500 ug / ml Geneticine (G418) wordt toegevoegd aan HEK-293-cellen stabiel tot expressie Slack-B te selecteren op expressie van het Slack kanaal. Passage cellen bij 70-90% confluentie door dissociatie van gerechten met een 0,25% trypsine-EDTA-oplossing. </li></ol> 2. Extracellulaire matrix (ECM) Coating van de TiO 2 384-wells Optische Biosensor Plaat met fibronectine en Ovalbumine <ol><li> Bereiding van de fibronectine ECM mengsel en ovalbumine blokkeeroplossing <ol><li> Bereid een werkende oplossing van fibronectin in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met een eindconcentratie van 5 ug / ml fibronectine in 20,0 ml PBS. Van een 1,0 mg / ml stock-concentratie, voeg 100 ul 20,0 ml PBS gedurende een 200-voudige verdunning. De werkoplossing van fibronectine kan worden hoeveelheden verdeeld en opgeslagen bij -20 ° C na de bereiding. </li><li> Bereid een 5% voorraad oplossing van hitte-geïnactiveerd ovalbumine in steriel water. Verdun ovalbumine in steriele weefselkweek water een oplossing 5% en hitte-geïnactiveerd gedurende 30 minuten bij 60 ° C. Koel de oplossing tot kamertemperatuur en steriele filter oplossing. Aliquot de 5% ovalbumine-oplossing en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Bereid een 2% werkende oplossing van ovalbumine door verdunning van de 5% stock oplossing in PBS. Bijvoorbeeld, voeg 12,0 ml 5% ovalbumine stockoplossing aan 18,0 ml PBS gedurende een eindvolume van 30,0 ml. </li></ol></li><li> 384-wells optische biosensor plaat coating <ol><li> Hydrateren de TiO 2 plaat met 20,0 ul / putjevan steriele weefselkweek kwaliteit water gedurende 15 minuten. De volgende stappen moeten worden uitgevoerd met een 16-kanaals pipet. </li><li> Wassen plaat 1x met 50,0 ul PBS per well. </li><li> Voeg 20,0 ul van de fibronectine werkoplossing in elk putje en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur om de ECM te maken. </li><li> Wassen plaat 1x met 50,0 ul PBS per well. </li><li> Voeg 40,0 ul van het ovalbumine werkoplossing in elk putje en incubeer overnacht bij 4 ° C aan de plaat te blokkeren. </li><li> Was plaat 3x met 50,0 ul PBS per well. ECM beklede platen kunnen worden bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal 48 uur. </li></ol></li></ol> 3. Zaaien van cellen op de 384-wells Optische Biosensor Plate <ol><li> Verwijder kweekmedium van de cellen en voeg trypsine om de cellen los van de plaat. Verzamel de cellen en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 1 minuut. Verwijder de trypsine media en resuspendeer cellen in kweekmedia. </li><li> Met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerdecelgetalmeter Bepaal de concentratie van de cellen. </li><li> Om de effecten van verdamping tijdens de incubatie minimaliseren, wordt 50,0 ul groeimedium per putje gebruikt. De cellen worden verdund tot het gewenste aantal cellen per putje in een volume van 50,0 pl groeimedium realiseren. Voor deze experimenten werden 1000 cellen / putje uitgeplaat op de biosensor. </li><li> Laat de gezaaide cellen overnacht geïncubeerd in kweekmedium bij 37 ° C onder lucht / 5% CO2. </li></ol> 4. Voorbereiding van de biosensor en Compound Platen voor de RWG Optical biosensortest <ol><li> Neem de plaat uit de incubator en verwijder de groei media uit de cellen. Was de cellen 1x met Hanks Balanced Salt Solution (HBSS). Voeg 25,0 ul HBSS aan elk putje. </li><li> Plaats de biosensor plaat op de BIND scanner en laat de cellen om op kamertemperatuur gedurende 1-2 uur. </li><li> Bereid een aparte verbinding plaat uit die liganden van rente ad wordended de biosensor plaat gedurende de test. Om deze testen werd 25,0 pi oplossing bevattende verbinding aan elk putje toegevoegd op de biosensor dienblad een totaal volume van 50,0 pl. Als zodanig werden verbindingen bereid in 2x de gewenste eindconcentratie. </li></ol> 5. Voer de RWG Optical biosensortest <ol><li> Neem een ​​nulmeting de scanner voor putten A1-P12 (de helft van de SBS 384-wells plaat) met een maximale resolutie van 3,75 micrometer / pixel voor de centrale 1,5 mm van elk putje met de binding Scan software. Deze basislijn scan zal ongeveer 30 minuten duren. </li><li> Voeg 25,0 ul van de samengestelde oplossing in elk putje voor putten A1-P12. </li><li> Neem een ​​nulmeting van putten A13-P24. </li><li> Voeg 25,0 ul van de samengestelde oplossing in elk putje voor putten A13-P24. </li><li> Neem een ​​bericht compound toevoeging meting voor putten A1-P12, en herhaal voor putten A13-P24. </li></ol> 6. Eenbestudeert de analyse van analysegegevens met BIND View <ol><li> Open de BIND test gegevens voor de nulmeting in Windows, en klik op de &quot;Grid Editor&quot; knop naar cel te kunnen selecteren. De software zal metrics van belang gedefinieerd door de gebruiker te berekenen. </li><li> Open het &quot;Plug-ins&quot;, die de &quot;Cell Finder&quot; en de functie &quot;Baseliner&quot; omvatten. Parameters in &quot;Cell Finder&quot; zodat cellen te onderscheiden van de achtergrond van de biosensor. </li><li> Exporteer de cel kaart bestand dat de &quot;Cell Finder&quot; gegevens voor de nulmeting bevat. </li><li> Herhaal de stappen 6,1-6,2 voor post verbinding toevoeging gegevens. </li><li> Open de &quot;Baseliner&quot; plug-in en importeer de cel kaart van de nulmeting. De software zal de verschuiving in PWV tussen de achtergrond en post samengestelde gegevens te berekenen. </li><li> Selecteer &quot;Δ celgemiddelde&quot; voor de output van de gemiddelde verschuiving PWV voor cellen. De gegevens kunnen vervolgens worden geëxporteerd naar Microsoft Excel voor verdere analyse. </li></ol>

<ol><li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHille%2C+B+%22Ion+Channels+of+Excitable+Membranes%22">Ion Channels of Excitable Membranes</a>. , Sinauer Associates. (1992).</li>
<li>Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-conducting+functions+of+voltage-gated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Non-conducting functions of voltage-gated ion channels.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).</li>
<li>Levitan, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+protein+complexes+associated+with+neuronal+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels.</a> Nat. Neurosci. 9, 305-310 (2006).</li>
<li>Shamah, S. M., Cunningham, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+cell-based+assays+using+photonic+crystal+optical+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Label-free cell-based assays using photonic crystal optical biosensors.</a> Analyst. 136, 1090-1102 (2011).</li>
<li>Cunningham, B. T., Laing, L. M. icroplate-based <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((label-free+detection+of+biomolecular+interactions%3A+applications+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">label-free detection of biomolecular interactions: applications in proteomics.</a> Expert Rev. Proteomics. 3, 271-281 (2006).</li>
<li>Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+label-free+biosensors+for+pharmacological+screening+with+cell-based+functional+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev%22%5BJournal%5D)">Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays.</a> Assay Drug Dev. 8, 219-227 (2010).</li>
<li>Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resonant+waveguide+grating+biosensor+for+living+cell+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing.</a> Biophys. J. 91, 1925-1940 (2006).</li>
<li>Cunningham, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+assays+on+the+BIND+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Label-free assays on the BIND system.</a> J. Biomol. Screen. 9, 481-490 (2004).</li>
<li>Hessel, A. aO., A, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Theory+of+Wood%27s+Anomalies+on+Optical+Gratings%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Optics%22%5BJournal%5D)">A New Theory of Wood's Anomalies on Optical Gratings.</a> Appl. Optics. 4, 1275-1297 (1965).</li>
<li>Cunningham, B. T., Laing, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+application+of+label-free+detection+assays+in+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Advantages and application of label-free detection assays in drug screening.</a> Expert Opin. Drug Discov. 3, 891-901 (2008).</li>
<li>Lee, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+optical+biosensor%3A+a+tool+for+G+protein-coupled+receptors+pharmacology+profiling+and+inverse+agonists+identification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Recept.+Signal+Transduct.+Res%22%5BJournal%5D)">Label-free optical biosensor: a tool for G protein-coupled receptors pharmacology profiling and inverse agonists identification.</a> J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 146-153 (2009).</li>
<li>Bhattacharjee, A., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+K%2B+channels%2C+Na%2B+is+the+new+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">For K+ channels, Na+ is the new Ca2.</a> Trends Neurosci. 28, 422-428 (2005).</li>
<li>Santi, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+regulation+of+Slick+and+Slack+K%2B+channels+by+neuromodulators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Opposite regulation of Slick and Slack K+ channels by neuromodulators.</a> J. Neurosci. 26, 5059-5068 (2006).</li>
<li>Yang, B., Desai, R., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slack+and+Slick+K%28Na%29+channels+regulate+the+accuracy+of+timing+of+auditory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Slack and Slick K(Na) channels regulate the accuracy of timing of auditory neurons.</a> J. Neurosci. 27, 2617-2627 (2007).</li>
<li>Brown, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragile+X+mental+retardation+protein+controls+gating+of+the+sodium-activated+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel.</a> 13, 819-821 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neuronal+excitability+by+interaction+of+fragile+X+mental+retardation+protein+with+slack+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels.</a> J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).</li>
<li>Barcia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+gain-of-function+KCNT1+channel+mutations+cause+malignant+migrating+partial+seizures+of+infancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy.</a> Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).</li>
<li>Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+optical+biosensors+to+detect+modulation+of+Slack+potassium+channels+by+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Recept.+Signal+Transduct.+Res%22%5BJournal%5D)">Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors.</a> J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).</li>
<li>Nelson, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+diacylglycerol+degradation+to+M1+muscarinic+receptors+by+beta-arrestins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins.</a> Science. 315, 663-666 (2007).</li>
<li>Zhang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Gribbon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+real-life+high-throughput+screening+data%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Evaluating real-life high-throughput screening data.</a> J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).</li>
</ol>

Steven M. Shamah is een medewerker van X-BODY Biosciences.

De prime Z (Z &#39;) factor een gemeenschappelijke statistische methode om de kwaliteit van een high-throughput screening assay 20 kwantificeren, en omdat de screening van de GPCR agonisten in deze test vond plaats in een SBS compatibele 384-well assay, een uitstekende maat voor de robuustheid en de geldigheid van deze test 21. AZ &#39;waarde 1 geeft een theoretisch ideaal assay met een oneindig aantal gegevenspunten met onbestaande standaardafwijkingen. AZ &#39;waarde tussen 0,5-1 wordt beschouwd ...

Onderzoeken levende cellen in hun fysiologisch relevante context is cruciaal voor het begrijpen van de biologische functies van cellulaire doelwitten. Echter, assays onderzocht de interactie tussen kanalen en regulerende cytoplasmatische eiwitten, zoals co-immunoprecipitatie assays algemeen weinig informatie over het tijdsverloop van interacties in levende cellen. De meerderheid van de huidige cel-gebaseerde testen meten een specifieke cellulaire gebeurtenis, zoals de translocatie van een fluorescent gelabeld eiwit van belang. Deze testen vereisen modificaties van de eiwitten van belang, die mogelijk kan veranderen gedrag van de proteïne en de fysiologische relevantie van het doel verminderen. Invasieve cel-gebaseerde testen, die geen manipulatie van het systeem vereisen, vormen een continue meting van cellulaire activiteit en maken studies van cellen in hun meest fysiologisch relevante stand 4. Optische biosensoren kunnen een ruimteeen meetbare verandering in een eigenschap van het licht dat is gekoppeld aan het sensoroppervlak. Optische biosensoren die verdwijnende golven gebruiken, welk oppervlak plasmon resonantie (SPR) en resonantiegolflengte rooster (RWG) technieken omvatten, zijn voornamelijk gebruikt om de affiniteit en kinetiek van moleculen binden aan hun biologische receptoren geïmmobiliseerd op het sensoroppervlak detecteren. Recenter zijn commercieel verkrijgbaar RWG biosensoren ontwikkeld voor de detectie van de relatieve verandering in massa in het onderste gedeelte van de cellen aanhanger van het sensoroppervlak met hoge ruimtelijke resolutie (tot 3,75 micrometer / pixel) 5 mogelijk. Deze biosensoren kunnen veranderingen in de massa sporen nabij het ​​plasmamembraan van levende cellen als gevolg van stimulatie, zoals celadhesie en spreiding, toxiciteit, proliferatie en signaalwegen opgewekt door verschillende celoppervlak receptoren zoals G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCRs) 6 . RWG biosensoren detecteren de relatieve change in de brekingsindex als functie van de relatieve verandering in massa binnen 150 nm van de biosensor 7. Wanneer cellen worden uitgeplaat op de biosensor, deze verandering in de brekingsindex weerspiegelt de verandering in massa nabij de plasmamembraan van de cel als gevolg van een verandering in cellulaire hechting aan de biosensor. Dit protocol zal de detectie van kanaal-eiwit interacties met behulp van RWG biosensoren te bespreken. RWG data acquisitie systemen bestaan ​​uit verschillende componenten. Omdat de X-BODY Biosciences BIND Scanner werd gebruikt voor deze experimenten, zullen we verwijzen naar de onderdelen van dit systeem, dat bestaat uit een plaatlezer, verbonden biosensoren, BIND Scan acquisitie software en BIND weergeven analysesoftware 8. De fotonische kristallen biosensoren, aangeduid als optische biosensoren hierna, bestaan ​​uit een periodieke rangschikking van een diëlektrisch materiaal en in 2 of 3 dimensies die de voortplanting van licht voorkomt op specifiekegolflengten en een routebeschrijving. Fotonisch kristal gebaseerd worden op een fenomeen genaamd Wood anomalie. Eerst ontdekt in 1902 door Wood, deze afwijkingen zijn waargenomen in het spectrum van het licht gereflecteerd door de optische buigingsroosters waar snelle fluctuaties in de intensiteit van bepaalde diffraktie-ordes ontstaan ​​in bepaalde smalle frequentiebanden. In 1962, Hessel en Oliner presenteerde een nieuwe theorie van Wood&#39;s afwijkingen waarin eindige periode rooster genereert een staande resonantiegolflengte 9. In de optische biosensoren hier beschreven, worden Wood anomalieën gebruikt om een ​​RWG biosensor produceren dat wanneer gestimuleerd met wit licht reflecteert slechts zeer smalle band van golflengten (meestal tussen 850-855 nm). Individuele biosensoren bestaan ​​uit een lage-brekingsindex kunststof met een periodieke oppervlaktestructuur die is bekleed met een dunne laag van hoge brekingsindex diëlektrisch materiaal titaniumdioxide (TiO2). Wanneer de Biosensof verlicht met een brede golflengte lichtbron, het optische raster van fotonische kristallen weerspiegelt een smal bereik van golflengten van licht die wordt gemeten met een spectrofotometer in het BIND scanner. De piekintensiteit van de gereflecteerde golflengten (Piekgolflengte waarde of PWV) wordt dan berekend uit het signaal. De PWV licht verschuift op een verandering in de brekingsindex tengevolge van een toename of afname in massa in de nabijheid (~ 150 nm) van de biosensor oppervlak. Optische biosensoren worden opgenomen in een standaard Society for Biomolecular Sciences (SBS) 384 microplaat voor de testen die in deze experimenten. RWV biosensoren worden gebruikt om veranderingen te detecteren na toevoeging van exogene signalen in levende cellen 10. Cellen worden gekweekt direct op het oppervlak van een biosensor RWG en de verandering in de plaatselijke brekingsindex wordt gecontroleerd bij behandeling met specifieke stimuli. De richting van de verandering in belasting van het biosensor kanbepaald, omdat een toename van de plaatselijke brekingsindex gevolg van een toename van de massa nabij de biosensor en wordt gemeten als een toename van PWV. Daarentegen een afname in massa wordt verlaging van PWV. De verandering in gedetecteerd PWV kunnen voortvloeien uit tal van cellulaire gebeurtenissen, met inbegrip van veranderingen in cel adhesie, eiwit werving / release, endocytose en recycling, exocytose, apoptose, en het cytoskelet omlegging. Bijvoorbeeld, kan de test worden gedetecteerd veranderingen in kanaal-eiwitinteracties tussen kaliumkanalen en andere cytoplasmatische of cytoskelet componenten. De gebeurtenis moet echter plaatsvinden binnen de ~ 150 nm detectiezone nabij de biosensor, en bij een aangesloten cel, bij plasmamembraan. Verwerving van cellulaire reacties wordt uitgevoerd met BIND software scannen en een beeldweergave van elk van de 384 putjes in de plaat SBS gegenereerd. Dit systeem heeft een resolutie van 3,75 um / pixel, waardoor detectie van gebeurtenissen in enkele cellen enkan worden gebruikt met cellijnen (zoals HEK293-of CHO-cellen) of meer fysiologisch relevante primaire cellen. Beeldanalyse met BIND View software maakt het mogelijk de detectie van cellulaire reacties in zowel individuele als populaties van cellen. Als biosensoren 384 putjes opgenomen in standaard microtiterplaten SBS, het systeem gemakkelijk kan worden aangepast aan high-throughput screening (HTS). Resonantie-golflengte raster optische biosensoren zijn eerder gebruikt om veranderingen in de massa nabij de plasmamembraan van cellen te detecteren na activering van GPCR 11. Ons laboratorium heeft gekloond twee-natrium geactiveerd (K Na) kalium kanalen, Slack-B Slick 12. De activiteit van zowel slappe B Gladde kanalen is aangetoond dat het zeer sterk beïnvloed door directe activatie van proteïne kinase C (PKC) 13 zijn. Activering van q Ga-proteïne gekoppelde receptoren, zoals de muscarine M1 receptor en mGluR1 metabotrope glutamaat receptor, krachtig regelt kanaal activiteit door middel van PKC activering. Deze K Na kanalen bijdragen aan neuronale aanpassing tijdens langdurige stimulatie en reguleren van de nauwkeurigheid van de timing van actiepotentialen 14. Slack kanalen zijn bekend om te interageren met een verscheidenheid aan cytoplasmatische signaalmoleculen, waaronder FMRP, het Fragiele X mentale retardatie eiwit 15,16. Mutaties in Slack resultaat in meerdere Migreren partiële aanvallen van Kindertijd (MMPSI), een vroeg begin vorm van epilepsie die leidt tot ernstige vertraging in de ontwikkeling 17.

<table><tbody><tr><td>DMEM, High Glucose</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin G-418 Sulfate</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB05057</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin van humaan plasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>Albumine uit kippeneiwitje</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5378</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Carbamoylcholine chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4382</td><td></td></tr><tr><td>SFLLR-NH2 trifluoroacetaat zout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8701</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette (5-50 &micro;l)</td><td>Thermo Scientific</td><td>4662090</td><td></td></tr><tr><td>BIND Scanner System</td><td>X-BODY Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>384-well TiO2 gecoate platen</td><td>X-BODY Biosciences</td><td>TiO-96-CM</td><td></td></tr></tbody></table>

gebruik van label-free optische biosensoren om modulatie van kaliumkanalen detect door g-proteïne gekoppelde receptoren

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Ion kanalen van de elektrische eigenschappen van neuronen en andere exciteerbare celtypes selectief toestaan ​​ionen stromen door het plasmamembraan 1. Neuronale exciteerbaarheid reguleren, worden de biofysische eigenschappen van ionenkanalen gemodificeerd door signalerende proteïnen en moleculen, die vaak binden aan de kanalen zelf een heteromere kanaalcomplex 2,3 vormen. Traditionele assays onderzoeken van de interactie tussen kanalen en regulerende proteïnen vereisen exogene labels die mogelijk kunnen veranderen gedrag van de proteïne en de fysiologische relevantie van het doel af, terwijl weinig gegevens over het tijdsverloop van interacties in levende cellen. Optische biosensoren, zoals de X-BODY Biosciences BIND Scanner systeem, gebruik maken van een nieuw label-free technologie, resonantiegolflengte raspen (RWG) optische biosensoren, om veranderingen te detecteren in resonante gereflecteerde licht in de buurt van de biosensor. Deze test maakt de detectie van de relatieveverandering in massa in het onderste gedeelte van levende cellen aanhanger van de biosensor oppervlak verkregen door ligand geïnduceerde veranderingen in celhechting en spreiding, toxiciteit, proliferatie, en veranderingen in eiwit-eiwit interacties bij de plasmamembraan. RWG optische biosensoren zijn gebruikt om veranderingen in de massa nabij de plasmamembraan van cellen te detecteren na activatie van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs), receptor tyrosine kinases en andere celoppervlak receptoren. Ligand-geïnduceerde veranderingen van ionkanaal-eiwit interacties kunnen worden onderzocht door deze test. In dit artikel zullen we de experimentele procedure die wordt gebruikt om de modulatie van Slack-B-natrium geactiveerd kalium (K Na) kanalen door GPCR&#39;s detecteren beschrijven.

Slack-B stabiel getransfecteerde HEK-293-cellen en controle getransfecteerde HEK-293-cellen werden uitgezaaid met 1000 cellen / putje op 384-goed, ECM beklede RWG biosensor platen. Beelden uit de centrale 1,5 mm 2 van de biosensor werden opgenomen bij een resolutie van 3,75 micrometer / pixel (figuur 1). Dichtheid gradiënt kaarten van de massa werden vooraf gegenereerd en 30 min na verbinding aanvulling met de BIND-Scan-software. De BIND View software werd gebruikt om de verschuiving in PWV o...

Optische biosensor technieken kunnen detecteren veranderingen in de massa in de buurt van het plasmamembraan van levende cellen en laten ons toe om cellulaire reacties in zowel individuele cellen en populaties van cellen te volgen. Dit protocol detectie van de modulatie van kaliumkanalen door G-proteïne gekoppelde receptoren in intacte cellen die deze benadering beschreven.

Gebruik van Label-free Optische biosensoren om Modulatie van kaliumkanalen Detect door G-proteïne gekoppelde receptoren

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het detecteren van modulatie van G-eiwitgekoppelde receptoren door kaliumkanalen, waarbij labelvrije resonantie-golflengte-graderende optische biosensoren worden gebruikt om dit te bereiken. Hiervoor worden HEK 293-cellen en HEK 293-cellen die stabiel de rat-natriumgeactiveerde kaliumkanaal slack B tot expressie brengen, geplaatst op een optische biosensorplaat met 384 putjes en gedurende de nacht geïncubeerd. Vervolgens wordt een nulmeting uitgevoerd van de massa nabij het plasmamembraan en worden agonisten van endogene G-eiwitgekoppelde receptoren of GPCR's toegevoegd. Als laatste stap wordt de signaalverandering als gevolg van GPCR-activatie gemeten en wordt de modulatie van deze respons door het kaliumkanaal berekend.Uiteindelijk kan deze methode helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de velden van neurowetenschappen en cellulaire signalering door signaleringsmechanismen tussen G-eiwitgekoppelde receptoren en kaliumkanalen kwantitatief te meten. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van de huidige methoden om interacties tussen kanalen en eiwitten te bestuderen, zoals CO- en precipitatie-assays, zijn da

use-label-free-optical-biosensors-to-detect-modulation-potassium

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een real-time screening procedure voor het identificeren van geneesmiddelen die een interactie met G-eiwit-gated naar binnen gelijkrichter...

Een TL-screeningstest voor het vaststellen van Modulators van GIRK kanalen

Source: Josiah, S. S., et al. Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting. J. Vis. Exp. (2022).The video demonstrates the steps for detecting and quantifying phosphorylated potassium-chloride cotransporter 2 (KCC2) protein in a cell lysate. This process involves immunoprecipitation to isolate phosphorylated KCC2 and chemiluminescence to quantify the isolated protein.

Detection of Phosphorylated Neuronal Potassium-Chloride Cotransporter 2 via Western Blotting

Intercellulaire communicatie kritisch om diverse fysiologische activiteiten binnen en buiten de cel. Dit document beschrijft een protocol voor het meten van de ruimtelijke en temporele karakter van enkele cel afscheidingen. Om dit te bereiken, is een multidisciplinaire aanpak waarin label-free nanoplasmonic sensing met live-cell imaging integreert.

A-Label gratis Techniek voor de ruimte en tijd Imaging van Single Cell afscheiding

Erfelijke hartritmestoornissen worden vaak veroorzaakt door mutaties die de oppervlakte levering van één of meer ionkanalen wijzigen. Hier passen we flowcytometrie assays een kwantificering van de relatieve totale en celoppervlak-eiwit expressie van recombinant ionenkanalen tot expressie gebracht in TSA-201 cellen.

Bepaling van de Relatieve celoppervlak en Total Expressie van recombinant Ion kanalen met flowcytometrie

De beschreven cellulaire assay is ontworpen voor de identificatie van CXC chemokine receptor 4 (CXCR4)-interagerende agenten die remmen of deze te stimuleren, concurrerend of allosterically, de intracellulaire Ca2 + release geïnitieerd door CXCR4 activering.

Een kinetische fluorescentie gebaseerde Ca2 + mobilisatie Assay te identificeren van G eiwit-gekoppelde Receptor agonisten en antagonisten Allosteric modulatoren

Het protocol hier beschrijft de interacties van gezuiverde hEAG1 ion kanaal eiwit met de kleine molecuul lipide ligand phosphatidylinositol 4, 5-difosfaat (PIP2). De meting toont aan dat BLI zou een mogelijke methode voor nieuwe kleine-molecuul ion kanaal ligand screening.

Vastleggen van de kinetiek van de interactie van een ionkanaal eiwit met kleine moleculen door de Bio-laag interferometrie Assay

Dit protocol toont real-time registratie van volledige dosis-respons relaties voor agonist-geïnduceerde GPCR activering van een eencellige laag geteeld op een enkele micro-elektrode met behulp van label-vrije impedantie metingen. De nieuwe dosing regeling verhoogt aanzienlijk doorvoer zonder verlies in de tijd resolutie.

Stepwise Dosing Protocol voor verhoogde doorvoer in label-vrije impedance-based GPCR-tests

Dit protocol presenteert een methode voor het meten van adenine nucleotide binding aan receptoren in real time in een cellulaire omgeving. Binding wordt gemeten als Förster resonantie energieoverdracht (FRET) tussen trinitrofenylnucleotidederivaten en eiwit gelabeld met een niet-canoniek, fluorescerend aminozuur.

Het meten van nucleotidebinding aan intacte, functionele membraaneiwitten in realtime

In dit werk wordt een high-throughput, intracellulaire calciumfluorescentietest voor 384-well platen beschreven om kleine molecuulbibliotheken te screenen op recombinante G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR's). Het doelwit, de kininereceptor van de runderkoortsteek, Rhipicephalus microplus, komt tot expressie in CHO-K1-cellen. Deze test identificeert agonisten en antagonisten die dezelfde cellen gebruiken in één "dual-addition" assay.

Een "Dual-Addition" Calcium Fluorescentie Assay voor de High-Throughput Screening van Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Dit protocol beschrijft het gebruik van op BRET gebaseerde biosensoren voor real-time meting van G-eiwitactivering in levende HEK293-cellen bij G-eiwitgekoppelde receptorligandstimulatie. Hier dienen de β2-adrenerge receptor en cannabinoïde type 1-receptor als voorbeeld om de efficiëntie van sensoren voor verschillende G-eiwitsubtypes en voor verschillende GPCR's aan te tonen.

Op BRET gebaseerde G-eiwitbiosensoren voor het meten van G-eiwitgekoppelde receptoractiviteit in levende cellen

Leer hoe je labelvrije optische biosensoren gebruikt om modulatie van kaliumkanalen door G-proteïne gekoppelde receptoren te detecteren in HEK 293-cellen. Deze methode biedt inzicht in neurobiologische signaaloverdracht.

Gebruik van Label-free Optische biosensoren om Modulatie van kaliumkanalen Detect door G-proteïne gekoppelde receptoren

Meer video's verkennen