Een High Throughput MHC II Bindingsassay voor de kwantitatieve analyse van peptide-epitopen

Het algemene doel van deze procedure is om de binding van korte peptiden met menselijke MHC twee immuuneiwitten te kwantificeren met behulp van een high throughput 3 84 well plate assay. Dit wordt bereikt door eerst oplossingsfase concurrentiebindende assays uit te voeren met de peptiden van belang. In de tweede stap worden de geëquilibreerde peptide MHC twee complexen gevangen met een anti MHC twee antilichaam geïmmobiliseerd op hoge binding ELIZA platen.

Vervolgens worden de gevangen complexen geïncubeerd met het opium gelabelde streptavidin en vervolgens wordt het ongebonden streptavidin weggewassen en wordt het gevangen opium geactiveerd. Uiteindelijk kan tijdsafhankelijke fluorometrie worden gebruikt om de niveaus van MHC twee gevangen controle peptide te kwantificeren. Deze methode kan voorlopige inzichten bieden in het immunogene potentieel van doeleiwitten.

Het is bijzonder nuttig voor het valideren van de output van in silico voorspellers, Begin de procedure door 25 microliter van vers verdunde L 2 43 antilichaam oplossing toe te voegen aan elke well van een 3 84. Well hoge binding witte ELIZA plaat, verzegel de plaat met een polyester film en incubeer deze een nacht bij vier graden Celsius. Begin dan met een 10 millimolair voorraad van elk test.

Peptide en DMSO maak de volgende verdunningsreeks en citraat fosfaat buffer met behulp van 3 84 well polypropyleen platen. Merk op dat een volledige 3 84 well polypropyleen plaat drie afzonderlijke EIA platen vereist zoals geïllustreerd. Verdun vervolgens de geselecteerde MHC twee voorraadoplossingen tot een 101 nanomolair concentratie in reactiebuffer met behulp van een 15 milliliter conische buis.

Verdun vervolgens het controle peptide van 20 micromolair naar een verhouding van één tot 100 in de vers bereide MHC twee master mix en voeg 21,5 microliter van de MHC twee master mix met controle peptide toe aan de positieve controle. Well van de 3 84 well polypropyleen plaat, voeg de MHC twee master mix met controle peptide toe aan elk van de test peptide verdunningen in een verhouding van één-op-één om de bindingsreactie op dit moment ook te creëren. Ten slotte verzegel de bindingsreactie met een polyester film en incubeer de plaat gedurende 12 tot 24 uur in een niet-kooldioxide gecontroleerde incubator bij 37 graden Celsius zonder te schudden.

De volgende dag verdun de bindingsreactie wells in de 3 84. Well plaat in een verhouding van één op één met neutralisatiebuffer. Was vervolgens de Eliza plaat drie keer met 60 microliter per well van PBS 0,05%tussen 20 volgende overdracht, 25 microliter van elke geneutraliseerde bindingsreactie oplossing van de 3 84 well plaat in drievoudige uitvoering naar de antilichaam gecoate 3 84.

Well Eliza plaat, incubeer vervolgens de ELIZA plaat bedekt met polyester film bij vier graden Celsius een nacht na de incubatie. Was de ELIZA plaat drie keer zoals zojuist aangetoond, en voeg vervolgens 25 microliter vers verdund strep din opium toe aan elke. Well. Incubeer de plaat bedekt met een polyester film in het donker bij kamertemperatuur gedurende één uur.

Tijdens de incubatie, breng 10 milliliter versterkingsoplossing per plaat naar kamertemperatuur, ook in het donker na één uur, was de ELIZA plaat zoals gedemonstreerd, en voeg vervolgens 25 microliter versterkingsoplossing toe aan elke well en incubeer de plaat bedekt met polyester film gedurende 10 tot 15 minuten in het donker. Lees tenslotte de fluorescentie met een tijdsafhankelijke fluorescentie plate reader met opium instellingen. In dit representatieve experiment werd een volwassen peptidesequentie van enterobacter Cloe P negen negen beta-lactamase geanalyseerd op putatieve peptide binders voor het MHC twee allel.

DRB één vijftien oh één honderd zeventien non of peptiden werden geïdentificeerd met een verplichte P één ankerresidu op positie één die vereist is voor MHC twee binding bij een 5%drempel alleen. Peptiden met scores groter dan of gelijk aan 2,6 zijn waarschijnlijk binders. Dus bij de 5%drempel worden alleen de top 11 peptiden voorspeld om MHC twee DRB 1 15 0 1 te binden.

Een representatief paneel van voorspelde epitopen werd geselecteerd voor analyse in deze MHC twee bindingsassay. Beta-lactamase peptidefragmenten van deze 15 residuen werden chemisch gesynthetiseerd zodat putatieve nonamer MHC twee epitopen ingebed waren in hun synthetische eiwitfragmenten. De capaciteit van deze synthetische peptiden om te concurreren met een gebiotinyleerd myeline basiseiwit B controle peptide voor binding aan MHC twee DRB 1 15 0 1 werd vervolgens geanalyseerd zoals zojuist aangetoond.

Competitieve bindingscurven voor de synthetische peptiden zijn hier geïllustreerd. IC 50 waarden werden berekend door de log transformatiegegevens aan te passen met behulp van de één site competitieve binding niet-lineaire fitfunctie van prisma. Zoals gedemonstreerd in de tabel zoals te zien in de grafiek, verdeelden de peptiden zich natuurlijk in drie groepen, sterke binders met een IC 50 van minder dan één micromolair, matige binders met een IC 50 groter dan of gelijk aan één micromolair, maar minder dan 100 micromolair en zwakke binders met een IC 50 van groter dan of gelijk aan 100 micromolair Na de ontwikkeling.

Deze techniek heeft het pad geëffend voor onderzoekers op het gebied van moleculaire immunologie en biotherapeutisch ontwerp om de belangrijkste moleculaire herkenningsgebeurtenissen die ten grondslag liggen aan anti-eiwit immuunresponsen bij menselijke patiënten, volledig te verkennen.