Name: Een High Throughput MHC II Bindingsassay voor de kwantitatieve analyse van peptide-epitopen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-25T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Leer een high-throughput MHC II bindingsassay voor de kwantitatieve analyse van peptide-epitopen met 384-well platen. Deze methode versnelt de identificatie van immunogene epitopen voor vaccinontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​R01-GM-098977 en R21-AI-098122 naar CBK en KEG. RSS werd mede ondersteund door een Luce Foundation Fellowship en voor een deel door een Thayer Innovation Program Fellowship van de Thayer School of Engineering.

Vier belangrijkste activiteiten bestaan ​​uit het peptide-MHC II bindingtest: 1-Binding: Test peptiden concurreren met gelabelde controle peptiden voor oplossing fase binding van oplosbare MHC II-eiwitten. Binding wordt gemeten over een breed scala van testpeptide concentraties. 2-Capture: Na de binding reactie benaderingen evenwicht, zijn peptide-MHC II-complexen opgevangen en gescheiden van niet-gebonden peptide en proteïne door conformatieafhankelijke erkenning met een geïmmobiliseerd antilichaam. 3-Detectie: Gevangen controle peptide wordt kwantitatief gedetecteerd met behulp van time-resolved fluorescentie. 4-Analyse: spectroscopische gegevens worden verwerkt, uitgezet en geanalyseerd dosisafhankelijk bindingseigenschappen van testpeptide en MHC II-eiwitten bepalen. Op verschillende stappen in de onderstaande procedure wordt de toepassing van een vloeibare handlingrobot aanbevolen indien beschikbaar. Vooral in een 384-well formaat, geautomatiseerde doseer-en verdunning van vloeistoffen minimaliseert gebruikersfouten, leidt tot meerconsistente well-to-well volumes en levert smaller 95% betrouwbaarheidsintervallen voor IC50 waarden vergeleken met handmatige 96-well assays (gegevens niet getoond). Als een vloeistof handlingrobot niet beschikbaar is, de stappen geannoteerde met &quot;(liquid handling robot)&quot; kan worden met de hand gedaan. Evenzo, indien mogelijk, een geautomatiseerde plaatwasser die met de 384-well formaat is aanbevolen. Dit effectief standaardiseert de plaat wasproces. Als een plaatwasser niet beschikbaar is, de stappen geannoteerde met &quot;(plaatwasser)&quot; kan worden met de hand gedaan. 1. Coat de ELISA-plaat (dag 1) <ol><li> Verdun L243 antilichaam voorraad (0,5 mg / ml) in boraatbuffer een werkende concentratie van 10 ug / ml. <ol><li> Het coaten van een 384-wells plaat, voeg 200 ul van voorraad antilichaam tot 9,8 ml boraatbuffer. (Zie aanvullende spreadsheet rekenmachine voor alternatieve scaling). </li></ol></li><li> Voeg 25 ul van het L243 antilichaam oplossing in elk putje van een 384-well high-bindend witte ELISA-plaat. (Liquid handling robot) </li><li> Sluit de plaat met een polyester film en incubeer overnacht bij 4 ° C. Opmerking: Elke 384-wells ELISA-plaat is geschikt voor maximaal 15 testpeptiden op acht verdunningen voor een MHC II allel, evenals de positieve en negatieve controles. Dit zal uiteindelijk opleveren drievoud metingen. </li></ol> 2. Maak de Test Peptide Verdunningen (dag 1) <ol><li> Beginnend met een 10 mM voorraadoplossing van elke test peptide in DMSO, de volgende verdunningsreeks in citraat fosfaatbuffer met 384-well polypropyleen platen (Tabel 1). (Liquid handling robot) Opmerking: Een volledige 384-well polypropyleen plaat vereist drie afzonderlijke ELISA platen. Een derde van een polypropyleen plaat slechts een ELISA plaat (Figuur 1) vereist. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody align="center"><tr><td rowspan="2"> Verwatering Nummer </td><td> Volume to te nemen van voorafgaande verdunning / voorraad </td><td> Volume citraat buffer toe te voegen </td><td> Conc. van Verwatering </td><td> Conc. in bindingsreactie </td><td> Conc. in geneutraliseerd ELISA </td></tr><tr><td> (Pl) </td><td> (Pl) </td><td> (UM) </td><td> (UM) </td><td> (UM) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0.7 </td><td> 35.1 </td><td> 195,531 </td><td> 97,765 </td><td> 48,883 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 97,765 </td><td> 48,883 </td><td> 24,441 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 7.1 </td><td> 28.7 </td><td> 19,389 </td><td> 9,695 </td><td> 4,847 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 9,695 </td><td> 4,847 </td><td> 2.424 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 7.1 </td><td> 28.7 </td><td> 1.923 </td><td> 0.961 </td><td> 0.481 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 0.961 </td><td> 0.481 </td><td> 0.24 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 7.1 </td><td> 28.7 </td><td> 0.191 </td><td> 0.095 </td><td> 0.048 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 0.095 </td><td> 0.048 </td><td> 0.024 </td></tr><tr><td colspan="6"> Verwijder en gooi 7,1 ul van peptide-oplossing van verdunning nummer 8. </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Bereiding van testpeptide verdunningsreeks. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51308/51308fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51308/51308fig1.jpg" /> Figuur 1. Plaat Kaart van peptide bindingsassay. (A) Kaart van de peptide verdunningen polypropyleen platen met 384 putjes. Elke polypropyleen plaat is geschikt voor drie groepen van 15 peptiden in concurrentie bindingsreacties tegen een zingen<html> le MHC allel. (B) Na de bindingsreactie zal evenwicht wordt elke peptide fractie overgebracht in drievoud een afzonderlijke 384-wells ELISA plaat die is tevoren met anti-MHC II-antilichaam. 3. Bereid de MHC II Master Mix (dag 1) <ol><li> Maak de Reaction Buffer <ol><li> Voeg 80 ul van 1 mM Pefa Blok en 60 mg octyl-β-D-glucopyranaside tot 3.920 gl citraat fosfaatbuffer. (Zie aanvullende spreadsheet rekenmachine voor alternatieve scaling). </li></ol></li><li> Verdun geselecteerd MHC II voorraadoplossingen tot 101 nM in Reaction Buffer met een 15 ml conische buis (Tabel 2). Opmerking: zal MHC II concentratie uiteindelijk 50 nM in de bindingsreactie en 25 nM in de geneutraliseerde ELISA assay. De MHC II voorraad concentraties zullen variëren afhankelijk van de fabrikant lotnummer. (Zie aanvullende spreadsheet rekenmachine). </li></ol>&quot;&gt; <tbody><tr><td> MHC II Allele DRB1 *: </td><td> 1501 </td></tr><tr><td> MHC II Stock Concentratie (mg / ml) </td><td> 1.3 </td></tr><tr><td> MHC II Stock Concentratie (mm) </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Vol. MHC II Stock toevoegen aan (ml) </td><td> 14.65 </td></tr><tr><td> Vol. Reaction Buffer aan toevoegen (ml): </td><td> 2.885,35 </td></tr><tr><td> MHC II Master Mix Concentratie (nM) </td><td> 101 </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Voorbereiding van MHC II master mix. 4. Bereid de negatieve en positieve controles (dag 1) <ol><li> Voeg 21,5 ul van citraatfosfaatbuffer om de &quot;negatieve controle&quot; putje van de 384-well polypropyleen plaat uit stap 2.1 (Figuur 1A). </li><li> Voeg 21,5 ul van citraatfosfaatbuffer aan de &quot;controle&quot; en van het 384-well polypropyleen plaat. Opmerking: de &quot;positietieve controle &quot;zal in hoofdstuk 5 worden afgerond, hieronder. </li><li> Verwijder 49,5 ul van de MHC II Master Mix uit stap 3.2 en pipet in een 1,5 ml Eppendorf buis. </li><li> Voeg 0,5 ul van citraat buffer om de 49,5 ul van de MHC II Master Mix vanaf stap 4.3. </li><li> Voeg 21,5 ul van de concentratie aangepast MHC II Master Mix van stap 4.4 naar de &quot;negatieve controle&quot; putje van de 384-well polypropyleen plaat (Figuur 1A). Opmerking: deze steekproef de nul-signaal negatieve controle met MHC II eiwit, GEEN controle peptide, en NO testpeptide vertegenwoordigt. </li></ol> 5. Voeg de juiste controle peptide aan de MHC II Master Mix (dag 1) <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> MHC II Allele DRB1 * </td><td> Gebiotinyleerd Controle Peptide </td><td> (Residuen) </td><td> Sequentie </td></tr><tr><td> 0101 </td><td> Griep-HA-B </td><td> (306-318) </td><td> Biotine-(Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-amide </td></tr><tr><td> 0301 </td><td> Myoglobine </td><td> (137-148) </td><td> Biotine-(Ahx) - (Ahx)-LFRKDIAAKYKE-OH </td></tr><tr><td> 0401 </td><td> YAR-B </td><td> (1-14) </td><td> Biotine-(Ahx) (Ahx) YARFQSQTTLKQKT-OH </td></tr><tr><td> 0701 </td><td> TetTox-B </td><td> (830-843) </td><td> Biotine-(Ahx) (Ahx) QYIKANSKFIGITE-OH </td></tr><tr><td> 1101 </td><td> Griep-HA-B </td><td> (306-318) </td><td> Biotine-(Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-amide </td></tr><tr><td> 1501 </td><td> MBP-B </td><td> (84-102) </td><td> Biotine-(Ahx) (Ahx) NPVVHFFKNIVTPRTPPPS-OH </td></tr></tbody></table> * Wij raden het bestellen van 10 mg schaal voor de economie. Tabel 3. Controle Peptiden voor verschillende MHC II allelen. * <ol><li> Verdun de controle peptide (opgeslagen bij 400 uM in DMSO) 1:20 in vers DMSO een verdunde voorraad leveren bij 20 uM. <ol><li> Voeg 25 ul 400 uM controle peptide475 ul DMSO. Let op: dit is een groot risico, maar maakt nauwkeurige afhandeling van viskeuze DMSO oplossingen. </li></ol></li><li> Verder te verdunnen de controle peptide van stap 5.1 (20 mm) 1:100 in de MHC II Master Mix vanaf stap 3.2. <ol><li> Voeg 28,8 ul van controle peptide verdund in stap 5.2 om de resterende 2,850.5 ul van de MHC II Master Mix. </li></ol></li><li> Voeg 21,5 ul van de MHC II Master Mix met controle peptide (stap 5.2) naar de positieve controle en van het 384-well polypropyleen plaat (stap 4.2) (Figuur 1A). Opmerking: deze steekproef de high-signaal positieve controle met MHC II eiwit, controle peptide, en NO testpeptide vertegenwoordigt. </li></ol> 6. Maak de Binding Reactie (dag 1) <ol><li> Voeg de MHC II Master Mix met controle peptide (stap 5.2) aan elk van de test Peptide verdunningen (stap 2.1) in een 1:1 verhouding aan de bindingsreactie te maken. <ol><li> Voeg 21,5 ul van MHC II Master Mix met Control Peptide van stap 5,2-21,5 pi van elke Test Peptide verdunning vanaf stap 2.1. (Liquid handling robot) </li></ol></li><li> Dicht de bindingsreactie met een polyester film en incubeer 12-24 uur in een niet-gecontroleerde CO 2 incubator bij 37 ° C zonder schudden. </li></ol> 7. Neutraliseren en Breng de Binding Reactie (Dag 2) <ol><li> Verwijder de 384-well polypropyleen plaat met de bindingsreactie (stap 6.2) van de 37 ° C incubator. </li><li> Verdun de bindingsreactie 1:1 met Neutralization Buffer. (Liquid handling robot) <ol><li> Voeg 43 ul van de neutralisatiebuffer aan elk Binding Reaction goed. </li></ol></li><li> Verwijder de ELISA-plaat (stap 1.3) bij 4 ° C en wassen 3x met 60 ml / putje van PBS-0,05% Tween 20. (Plaatwasser) </li><li> Overdracht 25 ul van elke geneutraliseerd Binding Reactie van stap 7.2 in drievoud putjes van de antilichaam-gecoate 384-wells ELISA-plaat uit stap 7.3. (Figuur 1 </strong&gt;) (liquid handling robot) </li><li> Bedek de ELISA-plaat met een polyester film en plaats in een 37 ° C incubator gedurende 2,5 uur of in een 4 ° C koelkast &#39;s nachts. </li></ol> 8. ELISA Ontwikkeling (dag 2 of 3) <ol><li> Verwijder de ELISA-plaat uit stap 7.5, was 3 keer met 60 ul / putje van PBS-0,05% Tween. (Plaatwasser) </li><li> Verdun Streptavidine-Europium voorraadoplossing (0,1 mg / ml streptavidine, 7 Eu 3 + / streptavidine) 1000-voudig in de DELFIA assaybuffer. <ol><li> Voor een 384-wells plaat, verdunnen 10 ul Streptavidine-Europium in 10 ml Assay Buffer. </li></ol></li><li> Voeg 25 ul van de verdunde streptavidine-Europium aan elk putje van de 384-well ELISA plaat uit stap 8.1. (Liquid handling robot) </li><li> Bedek de plaat met een polyesterfilm en donkere plaats bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Opmerking: Tijdens de 1 uur incubatie, verwijder de Enhancement Solution uit de koelkast en zet opzij 10 ml / plaat in het donker bij roOM temperatuur. </li><li> Na de 1-uur incubatie, was de 384-well ELISA-plaat uit stap 8.3 3x met 60 ul / putje van PBS-0,05% Tween. (Plaatwasser) </li><li> Voeg 25 ul van Enhancement oplossing aan elk putje van de 384-well ELISA plaat uit stap 8.5. (Liquid handling robot) </li><li> Bedek de 384-well ELISA-plaat met een polyesterfilm en laat de plaat te zitten in het donker bij kamertemperatuur gedurende 10-15 minuten. </li><li> Na de 10-15 min incubatie, lees de fluorescentie van de 384-wells ELISA-plaat uit stap 8.7 het gebruik van een time-resolved fluorescerende plaat reader met Europium instellingen (bijvoorbeeld Start Int: 200, Stop Int:. 1000, Ex 340, Em . 615, Cutoff: Geen, PMT: Auto, Leest / Well: 50). </li></ol> 9. Data Analysis <ol><li> Gegevens invoeren in XY-formaat grafiek met 3 repliceren waarden in de side-by-side kolommen (X = testpeptide concentratie; Y = fluorescentie meting). </li><li> Log transformeren de X-waarden voor alle gegevens: X = log (X) </li><li> Plaats de log transformed gegevens met een competitieve binding-plaats model om de IC50 waarde te halen. </li><li> Beperk de onderste waarde naar de gemiddelde negatieve controlewaarde. </li><li> Wereldwijd passen bij de top waarde en verzekeren dat de wereldwijde fit parameter is dan of gelijk aan de positieve controle. </li></ol>

<ol><li>Steere, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic-refractory+Lyme+arthritis+is+associated+with+HLA-DR+molecules+that+bind+a+Borrelia+burgdorferi+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide.</a> J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).</li>
<li>Raddrizzani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+modes+of+peptide+interaction+enable+HLA-DQ+and+HLA-DR+molecules+to+bind+diverse+peptide+repertoires%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Different modes of peptide interaction enable HLA-DQ and HLA-DR molecules to bind diverse peptide repertoires.</a> J. Immunol. 159, 703-711 (1997).</li>
<li>Osipovitch, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+immune-evading+enzymes+for+ADEPT+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng.+Design%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of immune-evading enzymes for ADEPT therapy.</a> Protein Eng. Design. 25, 613-623 (2012).</li>
<li>Moise, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico-accelerated+identification+of+conserved+and+immunogenic+variola%2Fvaccinia+T-cell+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">In silico-accelerated identification of conserved and immunogenic variola/vaccinia T-cell epitopes.</a> Vaccine. 27, 6471-6479 (2009).</li>
<li>Moise, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+HLA+DR+epitope+de-immunization+of+Factor+VIII+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and in vivo.</a> Clin. Immunol. 142, 320-331 (2012).</li>
<li>Aggarwal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What%27s+fueling+the+biotech+engine-2011+to+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">What's fueling the biotech engine-2011 to 2012.</a> Nat. Biotechnol. 30, 1191-1197 (2012).</li>
<li>Trombetta, E. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+antigen+processing+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo.</a> Ann. Rev. Immunol. 23, 975-1028 (2005).</li>
<li>Warmerdam, P. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+a+human+T-cell+region+in+staphylokinase+by+T-cell+screening+and+computer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Elimination of a human T-cell region in staphylokinase by T-cell screening and computer modeling.</a> Thrombosis Haemostasis. 87, 666-673 (2002).</li>
<li>Jones, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+removal+of+a+promiscuous+CD4%2BT+cell+epitope+from+the+C1+domain+of+factor+VIII%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thrombosis+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Identification and removal of a promiscuous CD4+T cell epitope from the C1 domain of factor VIII.</a> J. Thrombosis Haemostasis. 3, 991-1000 (2005).</li>
<li>Harding, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beta-lactamase+with+reduced+immunogenicity+for+the+targeted+delivery+of+chemotherapeutics+using+antibody-directed+enzyme+prodrug+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer%22%5BJournal%5D)">A beta-lactamase with reduced immunogenicity for the targeted delivery of chemotherapeutics using antibody-directed enzyme prodrug therapy.</a> Mol. Cancer. 4, 1791-1800 (2005).</li>
<li>Mazor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+elimination+of+an+immunodominant+T-cell+epitope+in+recombinant+immunotoxins+based+on+Pseudomonas+exotoxin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification and elimination of an immunodominant T-cell epitope in recombinant immunotoxins based on Pseudomonas exotoxin A.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E3597-E3603 (2012).</li>
<li>Cantor, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+enzyme+deimmunization+by+combinatorial+T-cell+epitope+removal+using+neutral+drift%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Therapeutic enzyme deimmunization by combinatorial T-cell epitope removal using neutral drift.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1272-1277 (2011).</li>
<li>Kern, F., LiPira, G., Gratama, J. W., Manca, F., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Ag-specific+immune+responses%3A+understanding+immunopathogenesis+and+improving+diagnostics+in+infectious+disease%2C+autoimmunity+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Measuring Ag-specific immune responses: understanding immunopathogenesis and improving diagnostics in infectious disease, autoimmunity and cancer.</a> Trends Immunol. 26, 477-484 (2005).</li>
<li>Li Pira, G., Ivaldi, F., Moretti, P., Manca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+T+epitope+mapping+and+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High throughput T epitope mapping and vaccine development.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2010, 325720(2010).</li>
<li>Hoffmeister, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+T+cell+epitopes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping T cell epitopes by flow cytometry.</a> Methods. 29, 270-281 (2003).</li>
<li>Singh, H., Raghava, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProPred%3A+prediction+of+HLA-DR+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ProPred: prediction of HLA-DR binding sites.</a> Bioinformatics. 17, 1236-1237 (2001).</li>
<li>Guan, P., Doytchinova, I. A., Zygouri, C., Flower, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHCPred%3A+bringing+a+quantitative+dimension+to+the+online+prediction+of+MHC+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MHCPred: bringing a quantitative dimension to the online prediction of MHC binding.</a> Appl. Bioinformatics. 2, 63-66 (2003).</li>
<li>Wan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SVRMHC+prediction+server+for+MHC-binding+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SVRMHC prediction server for MHC-binding peptides.</a> BMC Bioinformatics. 7, 463(2006).</li>
<li>Bui, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+generation+and+evaluation+of+specific+MHC+binding+predictive+tools%3A+ARB+matrix+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications.</a> Immunogenetics. 57, 304-314 (2005).</li>
<li>Nielsen, M., Lundegaard, C., Lund, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+MHC+class+II+binding+affinity+using+SMM-align%2C+a+novel+stabilization+matrix+alignment+method%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method.</a> BMC Bioinformatics. 8, 238(2007).</li>
<li>Nielsen, M., Justesen, S., Lund, O., Lundegaard, C., Buus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NetMHCIIpan-2.0+-+Improved+pan-specific+HLA-DR+predictions+using+a+novel+concurrent+alignment+and+weight+optimization+training+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Immun.+Res%22%5BJournal%5D)">NetMHCIIpan-2.0 - Improved pan-specific HLA-DR predictions using a novel concurrent alignment and weight optimization training procedure.</a> Immun. Res. 6, 9(2010).</li>
<li>De Groot, A. S., Knopp, P. M., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De-immunization+of+therapeutic+proteins+by+T-cell+epitope+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">De-immunization of therapeutic proteins by T-cell epitope modification.</a> Dev. Biol. 122, 171-194 (2005).</li>
<li>Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+redesign+of+proteins+for+minimal+T-cell+epitope+content%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-based redesign of proteins for minimal T-cell epitope content.</a> J. Comput. Chem. 34, 879-891 (2013).</li>
<li>Parker, A. S., Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-guided+deimmunization+of+therapeutic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure-guided deimmunization of therapeutic proteins.</a> J. Comput. Biol. 20, 152-165 (2013).</li>
<li>Parker, A. S., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+therapeutic+proteins+to+delete+T-cell+epitopes+while+maintaining+beneficial+residue+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bioinform.+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimization of therapeutic proteins to delete T-cell epitopes while maintaining beneficial residue interactions.</a> J. Bioinform. Comput. Biol. 9, 207-229 (2011).</li>
<li>Parker, A. S., Zheng, W., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+algorithms+for+functional+deimmunization+of+therapeutic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Optimization algorithms for functional deimmunization of therapeutic proteins.</a> BMC Bioinformatics. 11, 180(2010).</li>
<li>De Groot, A. S., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+risk%2C+improving+outcomes%3A+Bioengineering+less+immunogenic+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Reducing risk, improving outcomes: Bioengineering less immunogenic protein therapeutics.</a> Clin. Immunol. 131, 189-201 (2009).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+assessment+of+MHC+class+II+peptide+binding+predictions+and+evaluation+of+a+consensus+approach%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach.</a> PLoS Comput. Biol. 4, e1000048(2008).</li>
<li>Sette, A., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+vaccinology%3A+developing+vaccines+in+the+era+of+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Reverse vaccinology: developing vaccines in the era of genomics.</a> Immunity. 33, 530-541 (2010).</li>
<li>Moise, L., Cousens, L., Fueyo, J., De Groot, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+power+of+genomics+and+immunoinformatics+to+produce+improved+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Harnessing the power of genomics and immunoinformatics to produce improved vaccines.</a> Expert Opin. Drug Discov. 6, 9-15 (2011).</li>
<li>Sturniolo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tissue-specific+and+promiscuous+HLA+ligand+databases+using+DNA+microarrays+and+virtual+HLA+class+II+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices.</a> Nat. Biotechnol. 17, 555-561 (1999).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologic+drugs+set+to+top+2012+sales%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Biologic drugs set to top 2012 sales.</a> Nat. Med. 18, 636(2012).</li>
<li>Seib, K. L., Zhao, X., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+vaccines+in+the+era+of+genomics%3A+a+decade+of+reverse+vaccinology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Developing vaccines in the era of genomics: a decade of reverse vaccinology.</a> Clin. Microbiol. Infect. 18, 109-116 (2012).</li>
<li>Jiang, W., Boder, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+engineering+and+analysis+of+peptide+binding+to+class+II+MHC%5BTitle%5D)+AND+%22+Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">High-throughput engineering and analysis of peptide binding to class II MHC.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13258-13263 (2010).</li>
<li>Justesen, S., Harndahl, M., Lamberth, K., Nielsen, L. -L. B., Buus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+recombinant+MHC+class+II+molecules+and+high-throughput+peptide-binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Immun%22%5BJournal%5D)">Functional recombinant MHC class II molecules and high-throughput peptide-binding assays.</a> Immun. 5, 1-20 (2009).</li>
</ol>

Leonard Moise is in dienst van en houdt aandelenopties in EpiVax, Inc, een particulier biotechnologiebedrijf gevestigd in Providence, RI. De werkzaamheden in dit onderzoeksrapport is vrij van vooroordeel dat kan worden geassocieerd met de commerciële doelstellingen van het bedrijf.

Biotherapeutics hebben zich gevestigd als een hoeksteen van de moderne geneeskunde, die vier van de top vijf van de verkoop van drugs in 2012 32. De sector biofarmaceutische heeft aangetoond aanhoudende groei voor meerdere jaren 6, en de voortdurende ontwikkeling van nieuwe agenten, evenals de opkomst van biosimilars heeft biofarmaceutische pijpleidingen uitgebreid. Kijkend naar de toekomst, het beoordelen en het inperken van de immunogeniciteit van therapeutische eiwitten zal een integraal onderde...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/51308/a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis">A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes</a>.&#160; There were typos in the Protocol section and Table 2.
Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:
Add 80 &#181;l of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-&#946;-D-glucopyranaside to 3,920 &#181;l of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
to:
Add 80 &#181;l of 1 mM Pefa Bloc and 60 &#181;g of octyl-&#946;-D-glucopyranaside to 3,920 &#181;l of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
Step 5.2&#160;in the Protocol was updated from:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
to:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 &#181;M) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
Table 2 was updated from:
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="376">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MHC II Allele DRB1*:</td>
			<td>1501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mg/ml)</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mM)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. MHC II Stock to Add (ml)</td>
			<td>14.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. Reaction Buffer to Add (ml):</td>
			<td>2885.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Master Mix Concentration (nM)</td>
			<td>101</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="376">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MHC II Allele DRB1*:</td>
			<td>1501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mg/ml)</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (&#956;M)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. MHC II Stock to Add (&#956;l)</td>
			<td>14.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. Reaction Buffer to Add (&#956;l):</td>
			<td>2885.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Master Mix Concentration (nM)</td>
			<td>101</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/51308/a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis">A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes</a>.&#160; There were typos in the Protocol section and Table 2.

Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Eiwitten zijn de snelst groeiende klasse van therapeutische middelen 6, en de snelle expansie van biotherapeutic pijpleidingen heeft steeds meer aandacht gericht op de uitdagingen in verband met de ontwikkeling en het gebruik van eiwit drugs. Een unieke behandeling voort uit het feit dat in een gezond en functionerend immuunsysteem, alle extracellulaire eiwitten worden bemonsterd door antigeen presenterende cellen (APC&#39;s). Eenmaal geïnternaliseerd door APCs, is een eiwit gesplitst in kleine peptidefragmenten en vermeende immunogene segmenten in de groef van klasse II major histocompatibility complex eiwit (MHC II) geladen. De peptide-MHC complexen worden dan weergegeven op de APC oppervlak en waar immunogene peptiden, aangeduid als T-celepitopen vormen ternaire II MHC-peptide-T-cel receptor complexen cognate CD4 T-cel oppervlakte receptoren 7. Deze kritische moleculaire gebeurtenis herkenning een complexe signaalcascade, waardoor T-cel activatie, het vrijkomen van cytokines, CD4 T-cel gemedieerde B-cel rijping, en uiteindelijk de productie van circulerende IgG-antilichamen die binden aan en duidelijk het overtredende exogene eiwit. Zo zouden immunogene eiwitten worden deimmunized door identificatie van delen T cel epitopen en mutatie sleutelresten verantwoordelijk voor MHC II complexvorming. Het draagt ​​niettemin opmerkend dat T-celepitopen talrijk en breed verspreid immunogene eiwitten kunnen zijn, en de meerderheid van epitoop verwijderen mutaties waarschijnlijk een onopzettelijk verlies van eiwitfunctie of stabiliteit veroorzaken. Daarom techniek deimmunized biotherapies kan een complexe en technisch uitdagende doelstelling, maar er bestaan ​​verschillende voorbeelden van succesvolle T-cel epitoop verwijdering projecten 3,5,8-12. Unlike-enten based &quot;vermenselijking&quot;, die grotendeels beperkt tot antistoffen kunnen epitoop deletie worden toegepast in wezen elk eiwit doelwit ongeacht sequentie, structuur, functie of de beschikbaarheid van homologoons menselijk steigers. De eerste stap naar de uitvoering van een dergelijke aanpak is de identificatie van de belangrijkste peptide epitopen ingebed in de doelwiteiwitsequentie. Hoge doorvoer biochemische analyses met behulp van synthetische peptiden en recombinant humaan MHC II moleculen kunnen bieden snelle voorlopige inzichten in identificatie en mitigatie 1,3-5 epitoop. Deze ELISA soort testen kan een krachtige aanvulling op andere eiwit / vaccins voor ontwerp en ontwikkeling zijn. Bijvoorbeeld, een gevestigde experimentele benadering van epitoop kartering voert tijd, arbeid en geld kosten ex vivo celproliferatie assays 15. In het kort wordt de primaire sequentie van een doeleiwit eerst verdeeld in een panel van overlappende peptiden, vaak 15-meren met 12 residuen overlap tussen aangrenzende peptiden. Het peptide paneel chemisch gesynthetiseerd en immunogeniciteit van elk peptide getest in een van de verschillende immunoassays die perifere bloe dienstd mononucleaire cellen (PBMC) geïsoleerd uit menselijke donoren 13,14. Een groter vertrouwen in de resultaten te bieden, worden peptiden meestal getest in duplo met PBMC van 50 of meer verschillende donoren. In gevallen waarin deimmunization is het uiteindelijke doel, is het werk nog verergerd door de noodzaak om extra panelen van gemuteerde peptiden produceren en testen van de nieuwe peptide panelen in PBMC testen vóór de invoering van elke deimmunizing mutaties in het eiwit van volledige lengte voor verdere functionele analyse 10. Hoewel deze cellulaire bepalingen blijven de gouden standaard voor de beoordeling immunogeen potentieel in menselijke patiënten, kan de efficiëntie van een exhaustieve benadering worden verbeterd door voorfilteren vermoedelijke immunogène epitopen met een snelle hoge doorvoer MHC-peptide bindingstest. Evenzo kan biochemische peptide-MHC II bindingsproeven worden gecombineerd met voorspellende in silico methoden om radicaal te versnellen het epitoop identificatieproces.Er bestaan ​​verschillende computationele gereedschappen voor T-cel epitoop voorspelling; voorbeelden zijn ProPred 16, MHCPred 17 SVRMHC 18, ARB 19, SMM-lijn 20, NetMHCIIpan 21 evenals eigen tools zoals EpiMatrix door EpiVax 22. Ook hebben epitoop voorspellers onlangs gecombineerd met andere bio-informatica en moleculaire modeling tools om geïntegreerde eiwit deimmunization algoritmen ontwikkeld om het risico dat deimmunizing mutaties eiwit structuur en functie 23-26 kan verstoren verzachten opleveren. Terwijl verscheidene epitoop voorspellers hebben bewezen redelijk accuraat 27,28, computationele resultaten steevast vereisen experimentele validatie. Snelle, high throughput, en kosteneffectieve experimentele methoden het meest geschikt zijn als een voorfilter voor het in silico epitoop voorspellingen. In dezelfde geest, kan epitoop voorspellers antigeen selectie rijden voor omgekeerde vaccinology 29,30. Zo hebben ontwikkelingen in de bioinformatica gehele genoom schermen die snel vaccinkandidaten in de vorm van gehele eiwitten of peptide-epitopen afkomstig van pathogeen proteomen identificeren opgeleverd. Hoewel deze enabling technology is de omvorming van ontdekking en ontwikkeling van beschermende vaccins, het introduceert een nieuwe uitdaging in de vorm van intractably grote lijsten van immunogeen vaccin kandidaten. Hoge doorvoer peptide-MHC II bindingsbepalingen kan epitoop selectie begeleiden door het kwantificeren van peptide bindingsaffiniteit en bindend promiscuïteit tussen meerdere allelen MHC II. Zoals bij proteïne deimmunization, worden dergelijke experimentele methoden uiteindelijk nodig om computationele voorspelling van veelbelovende vaccin leads te valideren. Hier wordt een peptide-MHC bindingstest geschaald tot 384 putjes beschreven. Het protocol is zeer parallel verlopende en vermindert reagens met 75% in vergelijking met eerder beschreven 96-well plaat formaat 1,3-5. Met behulp van een enkele Liquid handlingrobot Deze methode maakt het mogelijk onderzoeker ongeveer negentig testpeptiden in drievoud gemakkelijk geanalyseerd over een bereik van concentraties acht en vier MHC allel soorten van minder dan 48 uur. Dit artikel beschrijft de installatie van een 384-wells ELISA-plaat voor de analyse van zeven experimentele peptiden tegen een MHC II allel, maar spread sheet rekenmachines worden als aanvullend materiaal om zo gemakkelijk uitbreiden het experiment om een ​​aantal gewenste peptiden en / of MHC II moleculen.

<table><tbody><tr><td>Sodium Tetraborate Decahydrate</td><td>Sigma</td><td>221732</td><td></td></tr><tr><td>Citric Acid</td><td>Sigma</td><td>C1901</td><td></td></tr><tr><td>Dibasic Sodium Phosphate</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Trizma HCl</td><td>OmniPur</td><td>9310</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>100% DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Octyl-&beta;-D-Glucopyranaside</td><td>Fischer</td><td>29836-26-8</td><td></td></tr><tr><td>Pefa Bloc SCF</td><td>Roche</td><td>1158591600</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s 10x Phosphate Buffered Saline</td><td>Invitrogen</td><td>14200-166</td><td></td></tr><tr><td>DELFIA Assay Buffer</td><td>Perkin Elmer</td><td>4002-0010</td><td></td></tr><tr><td>DELFIA Enhancement Buffer</td><td>Perkin Elmer</td><td>4001-0010</td><td></td></tr><tr><td>Europium Labelled Streptavidin</td><td>Perkin Elmer</td><td>1244-360</td><td></td></tr><tr><td>L243 anti-HLA-DR antibody</td><td>Biolegend</td><td>307602</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated tracer peptides</td><td>21st Century Biochemicals</td><td>Custom Order</td><td></td></tr><tr><td>Test peptides (1-4 mg, 85% purity)</td><td>Genscript</td><td>Custom Order</td><td></td></tr><tr><td>Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated)</td><td>Benaroya Research Institute*</td><td>Custom Order</td><td></td></tr><tr><td>384-well white EIA/RIA plate</td><td>Thermo</td><td>460372</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene 384-well plate</td><td>Costar</td><td>3656</td><td></td></tr><tr><td>Film, AxySeal, 80 &micro;m, ELISA Applicator&nbsp;</td><td>Axygen Ascientific</td><td>PCR-SP</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ Water</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Epimotion Liquid Handler (or similar)</td><td>Eppendorf</td><td>5075</td><td></td></tr><tr><td>Select TS Plate Washer (or similar)</td><td>BioTek</td><td>405</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar)</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory.  See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory</td></tr></tbody></table>

een high throughput mhc ii bindingsassay voor de kwantitatieve analyse van peptide-epitopen

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemische analyses met recombinant humaan MHC II moleculen kunnen bieden snelle, kwantitatieve inzichten in immunogeen epitoop identificatie, verwijdering, of ontwerp 1,2. Hier wordt een peptide-MHC bindingstest geschaald tot 384 putjes. De verkleinde protocol vermindert reagens met 75% en is hoger doorvoer dan eerder beschreven 96-well protocollen 1,3-5. Specifiek proefopzet maakt robuuste en reproduceerbare analyse tot 15 peptiden tegen een MHC allel per 384-well ELISA-plaat. Met een vloeistofverwerking robot, deze methode maakt het mogelijk onderzoeker ongeveer negentig testpeptiden in drievoud over een bereik van concentraties acht en vier MHC allel soorten van minder dan 48 uur geanalyseerd. Anderen werken op het gebied van eiwit deimmunization of vaccin ontwerp en ontwikkeling vinden het protocol om nuttig zijn in hun eigen werk vergemakkelijken zijn. Met name de stap-voor-stap instructies en visueel formaatvan Jupiter moet het mogelijk maken dat andere gebruikers deze methode snel en eenvoudig vast te stellen in hun eigen laboratoria.

De volgroeide peptidesequentie van Enterobacter cloacae P99 beta-lactamase (BLA) (Genbank ID # X07274.1) werd geanalyseerd met ProPred 16 naar mogelijke peptide bindmiddelen MHC allel DRB1 * 1501 (Tabel 4). ProPred geïdentificeerd 117 nonameer peptiden met aangegeven P1 anker residu (dwz een M, L, I, V, F, Y of W op positie 1, vereist voor MHC binding 31). Bij een drempel 5%, alleen peptiden met scores groter dan of gelijk aan 2,6 waarschijnlijk bindmiddelen. Aldu...

Biochemische analyses met recombinant humaan MHC II moleculen kunnen bieden snelle, kwantitatieve inzichten in immunogeen epitoop identificatie, verwijdering, of ontwerp. Hier wordt een peptide-MHC bindingstest geschaald naar 384-well platen beschreven. Deze kosteneffectieve formaat moet nuttig zijn in het gebied van eiwit deimmunization en vaccin ontwerp en ontwikkeling te bewijzen.

Een High Throughput MHC II Bindingsassay voor de kwantitatieve analyse van peptide-epitopen

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Het algemene doel van deze procedure is het kwantificeren van de binding van korte peptiden aan humane MHC-II-immuunproteïnenen middels een high-throughput assay in 384-wellplaten. Dit wordt bereikt door eerst solution-phase competitie-bindingsassays uit te voeren met de betreffende peptiden. In de tweede stap worden de geëquilibreerde peptide-MHC-II-complexen gevangen met een anti-MHC-II-antilichaam dat is geïmmobiliseerd op high-binding ELISA-platen.Vervolgens worden de gevangen complexen geïncubeerd met het met opium gelabelde streptavidine, waarna het ongebonden streptavidine wordt weggewassen en het gevangen opium wordt geactiveerd. Uiteindelijk kan tijd-opgeloste fluorometrie worden gebruikt om de niveaus van MHC twee gevangen controlepeptide te kwantificeren. Deze methode kan voorlopige inzichten bieden in het immunogene potentieel van doeleiwitten.Het is bijzonder nuttig voor het valideren van de output van in silico-voorspellers. Begin de procedure door 25 µL vers verdunde L 2 43-antilichaamoplossing aan elke put van een 384-wells high binding witte ELISA-plaat toe te voegen; sluit de plaat af met een polyesterfolie en incubeer deze overnacht bij 4 °C. Begin vervolgens met

a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft het gebruik van peptide: MHC tetrameren en magnetische microbolletjes voor laagfrequente populaties van epitoop-specifieke T-cellen isoleren en analyseren door flowcytometrie. Deze methode maakt de directe bestudering van endogene T-celpopulaties plaats...

Peptide: MHC tetrameer-gebaseerde verrijking van epitoop-specifieke T-cellen

This video demonstrates a technique that applies peptide microarray technology to profile the specificity of antibodies recognizing post-translational modifications (PTMs) on histone peptides. A microarray slide containing immobilized fluorophore-conjugated histone peptides with known PTM combinations is treated with target PTM-specific antibodies. This process helps identify the antibody's specificity for the target and its potential cross-reactivity with non-target PTMs.

A Peptide Microarray Technology for Specificity Profiling of Antibodies

Dit manuscript beschrijft hoe (enkele molecuul) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-gebaseerde assays uit te voeren om de bindingsdynamiek tussen T-cel antigeen receptor (TCR) en antigeen peptide-geladen MHC-moleculen te meten zoals ze optreden binnen de immunologische synaps van een T-cel in contact met een gefunctionaliseerde planaire ondersteunde lipide bilayer.

Het meten van TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Met een FRET-gebaseerde Microscopie Assay

Hier beschrijven we methoden die we vaak toepassen in het laboratorium om te bepalen hoe de aard van de interactie tussen het T-celreceptor en tumorantigenen, gepresenteerd door humane leukocytenantigenen, de functionaliteit van T-cellen bepaalt; deze methoden omvatten eiwitproductie, röntgenkristallografie, biofysica en functionele T-celleproeven.

Via röntgenkristallografie, Biophysics en functionele testen om de mechanismen van T-cel-receptorherkenning van kankerantigenen bepalen

Hier beschrijven we een chromatografische test in combinatie met de ion mobiliteit scheiding van peptide precursoren gevolgd door de hoge resolutie (~ 30.000) MS-detectie van peptide fragmenten voor de kwantificering van puntige peptide normen in een monoclonal antilichaam Digest.

Een HS-MRM Assay voor de kwantificering van de gastheercel eiwitten in Protein biofarmaceutica door vloeistofchromatografie Ion mobiliteit QTOF massaspectrometrie

Hier presenteren de auteurs een eenvoudig en efficiënt protocol om een lineair antigeen epitoop te definiëren met behulp van een gezuiverd monoklonaal antilichaam en peptide scanning door dot-blot hybridisatie. De geïdentificeerde epitoop kan vervolgens worden gebruikt in therapeutische en diagnostische toepassingen.

Peptide Scanning-bijgestaan ​​Identificatie van een monoklonaal antilichaam-erkende Lineair B-celepitoop

Biopanning bacteriële display bibliotheken is een bewezen techniek voor ontdekking van peptide affiniteit reagentia, een robuust alternatief voor antilichamen. De semi-automatische sorteermethode hierin heeft gestroomlijnd biopanning als u wilt verkleinen van het optreden van valse positieven. We illustreren hier het denkproces en de technieken toegepast in de beoordeling van kandidaten en het minimaliseren van de downstream-analyse.

Semi-automatische Biopanning van bacteriële Display bibliotheken voor Peptide affiniteit reagens detectie en analyse van de resulterende isolaten

QA-1 (HLA-E in mens) behoort tot een groep van niet-klassieke grote histocompatibility complex 1b moleculen. Immunisatie met QA--1-bindende epitopes heeft aangetoond dat weefsel-specifieke immuunregulatie vergroten en verbeteren van verschillende auto-immuunziekten. Hierin beschrijven we een overlappende peptide bibliotheek strategie voor de identificatie van QA--1 epitopes in een eiwit.

Overlappende Peptide bibliotheek Qa-1 Epitopes in een proteïne in kaart

Hier presenteren we een protocol voor de ex vivo kwalitatieve detectie van antigeen-specifieke CD8+ T cellen. Analyse is mogelijk met eencellige schorsingen van organen of van kleine hoeveelheden bloed. Een breed scala van studies vereisen de analyse van de reacties van de cytotoxische T-cel (vaccinatie en kanker immunotherapie studies).

Gelijktijdige kwantificering van anti-vector en Anti-transgenic-specifieke CD8+ T cellen Via MHC ik tetrameer kleuring na vaccinatie met een virale Vector

Op basis van een van hepatitis B-virus (HBV) afgeleide peptidematrix konden HBV-specifieke CD4 T-celresponsen parallel aan de identificatie van HBV-specifieke CD4 T-cel epitopen worden geëvalueerd.

Analyse van HBV-specifieke CD4 T-celresponsen en identificatie van HLA-DR-beperkte CD4 T-cel epitopen op basis van een peptidematrix

Hier presenteren we een protocol voor de zuivering van MHC klasse I en klasse II peptidecomplexen uit muis- en menselijke cellijnen die hoogwaardige immunopeptidomics-gegevens leveren. Het protocol richt zich op monstervoorbereiding met behulp van in de handel verkrijgbare antilichamen.

Immunopeptidomics: isolatie van muis en humane MHC klasse I- en II-geassocieerde peptiden voor massaspectrometrie-analyse

Leer een high-throughput MHC II bindingsassay voor de kwantitatieve analyse van peptide-epitopen met 384-well platen. Deze methode versnelt de identificatie van immunogene epitopen voor vaccinontwikkeling.

Een High Throughput MHC II Bindingsassay voor de kwantitatieve analyse van peptide-epitopen

Meer video's verkennen