Drie dimensionaal culturen: Een hulpmiddel om te studeren Normaal Acinaire Architectuur versus maligne transformatie van cellen borst
25 april 2014
Drie dimensionale cultuur van mammaire epitheelcellen op een gereconstitueerde basaalmembraan is een handige methode om de in vivo architectuur van de goedaardige borst herhalen, en het maligne fenotype onderscheiden van goedaardige borst fenotype. Belangrijk is dat dit systeem worden toegepast invasieve carcinomen studie in weefsels.
Het algemene doel van deze procedure is om het driedimensionale kweeksysteem te gebruiken als een middel om het benigne borstfenotype te onderscheiden van het maligne borstfenotype. Dit wordt bereikt door eerst de controle- en experimentele cellen in triplicaten aan te brengen op een laag growth factor verminderde matrigel in een achtputskamerschijven. De tweede stap is om elke vierde dag verse volledige mediaveranderingen met 2%GFR Matrigel te geven, waardoor de ezel-achtige kolonies 10 tot 15 dagen kunnen groeien.
Vervolgens worden de fasecontrastafbeeldingen van de aser-achtige kolonies die in 3D zijn gekweekt, verkregen bij een vijfvoudige resolutie. De laatste stap is om de aser-achtige culturen te verwerken voor immunocytochemische analyse met relevante moleculaire markers, gevolgd door de verwerving van confocale afbeeldingen van in C twee immunokleuring aser-achtige kolonies in het midden. Uiteindelijk worden de fasecontrast- en confocale afbeeldingen van de cellen die in 3D-kweek zijn gekweekt, gebruikt om cellulaire fenotypische en moleculaire veranderingen te identificeren en zo de benigne borstcellen te onderscheiden van de maligne cellen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals tweedimensionale culturen, invasie- of migratie-assays, is dat het de weefselarchitectuur van de benigne borst en het verlies van organisatie tijdens maligne transformatie kan nabootsen. Daarom kan deze techniek effectief worden gebruikt om de benigne borstcellen te onderscheiden van de maligne borstcellen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het borstkankerveld te beantwoorden, zoals het defect van signaalroutes op celfenotype, en bij het identificeren van nieuwe oncogeen en/of tumorsuppressorpaden.
Om het experiment te beginnen, ontdooi groeifactorverminderde of GFR matrigel bij vier graden Celsius door de nacht. Vervolgens warmt u volledige HME-media op tot 37 graden Celsius en plaatst u een achtputskamerschijven op ijs om af te koelen. Voeg 40 microliters van GFR Matrigel toe aan het midden van elke put van de voorgekoelde schijf.
Verspreid het gel zo gelijkmatig mogelijk met behulp van een P 200 pipettip, vermijd luchtbellen en overmatige verspreiding, wat kan leiden tot meniscusvorming. Maak vervolgens het matri-gel vast door de schijf te incuberen bij 37 graden Celsius en 5% CO2 terwijl het matri-gel wordt verstevigd, probeer de ogen, de HME-cellen, verzamel ze vervolgens in een 15 milliliterbuis en draai de cellen 150 keer zwaartekracht gedurende vier minuten, tel de cellen en verdun ze tot 12.500 cellen per milliliter. Voeg in volledige media GFR matrigel toe aan de celsuspensie met een eindconcentratie van 2% en voeg 400 microliters van de oplossing toe aan elke put van de voorgecodeerde kamerschijven.
Plaats vervolgens de plaat in een CO2-gebufferde incubator. Vervang het media elke vier dagen gedurende 15 dagen door vers compleet media. Voor remmerstudies, voeg kleine molecuulremmers toe aan het volledige media op het moment van plateren, gevolgd door verse mediaveranderingen aangevuld met de remmers elke drie dagen om celgroei en triplicaten voor elke behandelingsset te starten.
Neem fasecontrastafbeeldingen van aser-structuren uit elke put bij vijfvoudige resolutie met behulp van een fasecontrastmicroscoop die is bevestigd aan een diaverschuiver en een computer. Neem de afbeeldingen door de plaat van het ene frame naar het andere te verplaatsen, waarbij de volledige put van de kamerschijven wordt bedekt. Tel het totale aantal aser-structuren, het aantal enkele ronde platte ezels en het aantal multi-aser-structuren of willekeurig groeiende structuren zonder organisatie.
En met uitgaande vertakkingsprocessen, bereken het percentage enkele ronde platte aser-structuren versus kwaadaardige structuren en plot de informatie. Als een kolomgrafiek. Bereken de significantie met de tweezijdige ongepaarde student T-test.
Bereid reagentia voor immunofluorescencekleuring voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Gebruik vervolgens een P 200 pipet om voorzichtig het geconditioneerde media af te zuigen. Bevestig vervolgens de ASIN- of structuren met vers bereid 2% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten na fixatie, permease de cellen met 0,5% tritton X 100 gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.
Was vervolgens de culturen drie keer met 100 millimeter glycine gedurende 10 tot 15 minuten voor elke wassing. Blokkeer vervolgens de cellen in primaire blokbuis gedurende een uur bij kamertemperatuur. Bewerk vervolgens de culturen in 20 microgram per milliliter van geitenanti-muis fab twee fragment in primaire blokbuis, ook wel de tweede blokkeeroplossing genoemd, gedurende 30 minuten om de aminoreact muis IgG-soorten in het matri-gel te blokkeren.
Na blokkering, incubeer de cellen met primaire antilichaam in de tweede blokkeeroplossing gedurende een nacht bij vier graden Celsius. Was de cellen drie keer met immunofluorescence buffer of I-buffer met zacht schudden gedurende 10 tot 15 minuten voor elke wassing. Bewerk vervolgens de cellen met fluorescent geconjugeerde secundaire antilichamen in if F-buffer gedurende 45 minuten.
Was vervolgens de cellen drie keer gedurende 10 minuten met if F-buffer en zacht schudden. Monteer de dia's met DPI bevattende anti-fade reagens om de kernen te visualiseren. Laat de dia's een nacht bij kamertemperatuur drogen.
Vervolgens verwerft confocale afbeeldingen bij de kolonie middensectie van cellen die bovenop het matri-gel groeien en een reeks optische secties door de hele lengte van de asner-structuur door z-stacking confocale afbeeldingen van DPI-geverfde HME-gecontroleerde en C CN zes knockdown-cellen op dag vijf te tonen dat knockdown-cellen organisatie missen. Op dag 15 worden de controlecellen gegroeiarresteerd met gedifferentieerde ASIN of structuren en goed gedefinieerde lumen die divergeren van de knockdown-cellen, die een invasieve vertakking en buisvormige fenotypus vertonen. Immunofluorescent kleuring toont het verlies van expressie van laminine v alfa zes integrine en ECA herrin, wat respectievelijk wijst op de verstoring van de basale membraan,
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie maakt gebruik van een driedimensionaal culturesysteem om onderscheid te maken tussen benigne en maligne borstfenotypes. Door in vivo-condities na te bootsen, kunnen onderzoekers cellulaire gedragingen en moleculaire veranderingen analyseren die geassocieerd zijn met borstkanker.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Oncologie
Achtergrond
- Driedimensionale culturesystemen bieden een nauwkeurigere weergave van de weefselarchitectuur.
- Het begrijpen van de verschillen tussen benigne en maligne cellen is cruciaal voor kankeronderzoek.
- Deze methode kan worden aangepast om verschillende invasieve carcinomen te bestuderen.
- Immunocytochemische analyse helpt bij het identificeren van specifieke moleculaire markers.
Doel van de studie
- Om onderscheid te maken tussen benigne en maligne borstfenotypes.
- Om een 3D-cultuursysteem te gebruiken voor het bestuderen van cellulair gedrag.
- Om fenotypische en moleculaire veranderingen in borstcellen te analyseren.
Gebruikte methoden
- Cellen worden geplaatst op Matrigel met een verlaagde concentratie groeifactoren in een chamber slide met acht putjes.
- Mediumverversingen worden elke vierde dag uitgevoerd om de koloniegroei te ondersteunen.
- Fasecontrastbeelden worden vastgelegd om de morfologie van de koloniën te observeren.
- Confocale beeldvorming wordt gebruikt voor gedetailleerde analyse van immunogekleurde koloniën.
Belangrijkste resultaten
- Fasecontrast- en confocale beelden onthullen verschillende cellulaire fenotypen.
- Immunocytochemische analyse identificeert relevante moleculaire markers.
- Het 3D-cultuursysteem differentieert effectief tussen goedaardige en maligne cellen.
- De bevindingen kunnen toekomstige studies naar invasieve carcinomen in andere weefsels informeren.
Conclusies
- Het 3D-cultuursysteem is een waardevol instrument voor kankeronderzoek.
- Het vergroot het inzicht in de biologie van borstkanker.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid naar andere typen carcinomen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Driedimensionale cultuursystemen bieden een fysiologisch relevant ex vivo-model om de progressie van borstkanker te bestuderen door de weefselarchitectuur te reproduceren die verloren gaat in monolaagsystemen. Deze aanpak maakt een mechanische risicobeperking van oncogene pathways mogelijk door goedaardige van kwaadaardige fenotypes te onderscheiden via kwantificeerbare acinaire morfologie en expressie van moleculaire markers. De methode ondersteunt targetvalidatie en fenotypische screening in de vroege ontdekkingsfase door extracellulaire matrixsignalen te koppelen aan cellulaire transformatiegebeurtenissen.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door het blootleggen van het verlies van apico-basale polariteit en de integriteit van het basaalmembraan tijdens maligne transformatie.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk via differentiële expressie van gevalideerde markers zoals laminine, alpha-six integrine en E-cadherine.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door het kwantificeren van enkelvoudige ronde acinaire structuren tegenover invasieve vertakkende tubuli als fenotypische readout van pathway-activiteit.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarzetting van de assay: Bereidt gestandaardiseerde biologische systemen voor op evaluatie van verbindingen door extracellulaire matrix-afhankelijke signalering gedurende 10–15 dagen in stand te houden.
- Kwantitatieve output: Maakt meting mogelijk van acinaire structuurvorming, vertakkingsmorfologie en op immunofluorescentie gebaseerde markerexpressie voor hit-validatie.
- Hergebruik van het platform: Ondersteunt schaalbare screening-workflows via plating in triplikaat in kamerglaasjes en reproduceerbare schema's voor mediumverversing.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Modelleert histopathologische verschillen tussen goedaardige klieren en invasieve carcinomen, inclusief anastomoserende tubuli en stromale infiltratiepatronen.
- Translationele continuïteit: Verbindt fenotypische observaties uit de ontdekkingsfase met preklinische validatie via moleculaire markers voor proliferatie, polariteit en apoptose.
- Mechanistische risicoreductie: Verheldert signaleringsdefecten in oncogene pathways (bijv. CCN6, p38 MAPK) door moleculaire verstoringen te koppelen aan fenotypische uitkomsten in een micro-omgevingsafhankelijke context.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van het testen van doelwit-hypothesen tot de identificatie van lead-verbindingen, door een ziekterellevant systeem te bieden voor het evalueren van de effecten van verbindingen op de weefselarchitectuur en moleculaire fenotypen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden door fenotypische verschuivingen in de organisatie van acini na genetische of farmacologische perturbatie te kwantificeren.
- Screening: Zorgt voor standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays via fasecontrastbeeldvorming van koloniemorfologie en confocale analyse van immunogekleurde structuren.
- Analytiek: Genereert kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen (bijv. percentage enkelvoudige ronde acini, expressie-intensiteit van markers), waardoor statistische vergelijking tussen condities mogelijk wordt.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij de ontwikkeling van biomarkers door de expressie van polariteits- en adhesiemoleculen die gekoppeld zijn aan de integriteit van het basaalmembraan te volgen.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Fungeert als een herbruikbaar platform voor het bestuderen van invloeden van de extracellulaire matrix in meerdere borstkankermodellen en potentieel andere carcinomen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door aan te tonen hoe het verlies van de extracellulaire matrix bijdraagt aan cellulaire desorganisatie en invasieve fenotypes.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde Matrigel-plating, de frequentie van mediumverversingen en geblindeerde beeldverwerving bij gedefinieerde resoluties.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege fenotypische ankers te bieden voor de effectiviteit van signaalpaden, waardoor de afhankelijkheid van surrogaateindpunten wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde vooruitgang mogelijk door 3D-cultuurofenotypes te correleren met bekende histopathologische kenmerken van maligniteit.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het omgaan met de extracellulaire matrix, immunofluorescentiekleuring en confocale microscopie voor een nauwkeurige fenotypische beoordeling.
- Is afhankelijk van toegang tot Matrigel met een gereduceerde hoeveelheid groeifactor, fasecontrast- en confocale beeldsystemen en gevalideerde antilichaampanels voor polariteits- en adhesiemarkers.
- Vraagt om standaardisatie van beeldacquisitieprotocollen tussen teams (bijv. 5x fasecontrast, z-stack confocaal) en geblindeerde analyse van de classificatie van de acinaire structuur.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij overdracht naar verschillende cellijnen of tumormodellen, in het bijzonder met betrekking tot de Matrigel-concentratie en aanvulling van groeifactoren.
- Bevat praktische beperkingen, zoals variabiliteit in de efficiëntie van acinaire vorming en de noodzaak van aanvullende assays om het invasieve potentieel buiten de morfologie om te bevestigen.
Veelgestelde vragen over Biofarmaca
Chapters in this video
0:05
Title
1:57
Three Dimensional Culture Preparation
3:34
Quantification of the Malignant vs. Benign Breast Phenotype
4:31
Immunofluorescence Staining of Acinar Structures Grown on Matrigel
6:36
Results: Comparison of Benign vs. Malignant Phenotypes
8:05
Conclusion
