Neonatale Pial Surface Elektroporatie

Het algemene doel van deze procedure is om neurale voorlopercellen op het schiloppervlak genetisch te labelen en te manipuleren. Dit wordt bereikt door eerst een glazen pipet gevuld met plasma-DNA-oplossing in de schiloppervlakteregio in te brengen. De tweede stap is het injecteren van het DNA in de hersenvliesruimte, die het schiloppervlak bedekt.

Vervolgens worden de elektroden georiënteerd om de juiste stroom naar het schiloppervlak te leveren. De laatste stap is dat het DNA door middel van elektroporatie in de schiloppervlaktevoorlopers wordt gebracht door toepassing van stroom. Uiteindelijk kan deze methode worden gecombineerd met andere technieken om de natuurlijke geschiedenis en moleculaire determinanten van het schiloppervlak, neurale voorloperceelproliferatie, migratie en/of differentiatie te tonen.

De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals virale transductie, is dat elektroporatie veiliger, flexibeler is en geen aanmaak van virusdeeltjes of verpakking vereist. Deze methode kan cruciale vragen beantwoorden op het gebied van neurale stamcellen en voorlopercellen, zoals wat is de bijdrage van deze schiloppervlaktevoorlopers aan weefsel, histogenese en neurale circuitfunctie. Om te beginnen, gebruik een pipettrekker om pipetten te vormen van glazen capillaire buisjes; nadat ze getrokken zijn, snijd het uiteinde af met scherpe schaar.

Bereid vervolgens een 1% snelle groene stockoplossing met gefilterd, nuclease-vrij water. Na het verdunnen van endotoxine-vrij plasma-DNA-interes-EDTA-buffer, combineer het in de juiste verhoudingen met de 1% snelle groene oplossing. Gebruik een standaardpipet om de gewenste hoeveelheid plasmidemix die geïnjecteerd moet worden op een stukje paraffinewasfilm te plaatsen als referentie.

Gebruik vervolgens een micro-injector om voorzichtig de geassembleerde glazen pipet in de buis met het plasmidemengsel te brengen. Voorkom dat de punt de randen van de buis raakt om breken te voorkomen. Aanzuig de oplossing in de pipet door langzaam de overdrachtsknop terug te draaien.

Zodra er voldoende volume geladen is, draai de knop naar voren tot de druk terugkeert naar de neutrale positie van nul. Hector Pascals. Plaats vervolgens de punt naast de referentie-injectie en gebruik de voetpedaal van de micro-injector om één volume te verdrijven.

Stel de druk in totdat de hoeveelheid gelijk is aan het eerder gepipetteerde referentievolume. Na het kalibreren van het injectievolume, haal de dieren voor plasmide-injectie op. Zodra de diepte van de anesthesie bevestigd is, houd het jong vast met de duim en wijsvinger van de minder dominante hand.

Gebruik de dominante hand om het gewenste gebied te targeten, de corticale hemisferen en andere oppervlakkige structuren zoals de superieure colliculi zouden goed zichtbaar moeten zijn. Zodra de juiste locatie is geïdentificeerd, steek de pipet voorbij de huid en schedel. Zorg ervoor dat de cerebrale slagaders worden vermeden.

Om het schiloppervlak te targeten, stop direct met het verder voortschoven van de pipet. Zodra de schedel is doorboord met de pipetpunt op de juiste positie, injecteer de plasmideoplossing met behulp van de voetpedaal van de micro-injector. Na de injectie, verwijder voorzichtig de pipet. Voorkom dat de punt tussen injecties droogt en verstopt door deze in de testdruppeltjes op de paraffinefilm te plaatsen. Herhaal deze stappen totdat alle jongen geïnjecteerd zijn om de geleidbaarheid te verhogen en verbranding van de huid te voorkomen.

Bedek drie millimeter platina pincetten TRO's met elektroporatie-gel. Pas vervolgens de elektro-instellingen aan voor injecties in de cortex. Plaats de negatief geladen sonde boven het geïnjecteerde gebied en de positief geladen sonde rond het contralaterale gebied onder het oog.

De oriëntatie van de elektrode moet onder een hoek van 45 tot 60 graden ten opzichte van de middenlijn zijn. Gebruik de voetpedaal om de stroom te activeren en houd de pincet TRO's gedurende drie tot vijf pulsen op hun plaats. Afhankelijk van de leeftijd en het gewicht van het jong, moeten de pulsen het DNA in de onderliggende schiloppervlaktecellen targeten.

De negatieve pool kan over het injectiegebied worden geveegd. Tussen pulsen door of een grotere elektrode kan worden gebruikt om het elektrogebied onmiddellijk na elektroporatie te vergroten, veeg voorzichtig de gel van de jongen en plaats ze ongeveer vijf minuten onder een verwarmingslamp. Jongen zullen acuut hun natuurlijke roodachtige kleur verliezen in de minuten na elektroporatie als gevolg van cyanose.

Observeer de jongen op het herstel van de natuurlijke kleur en het begin van normale beweging voordat je ze terugbrengt naar hun kooien of injecties in de superieure colus. Lokaliseer het doelgebied net achter en lateraal van Lambda en ongeveer op de middenlijn, gevolgd door dezelfde stappen zoals net gedemonstreerd. Met succesvolle injecties vult het plasmidemengsel natuurlijk de contouren van de superieure colus.

Bij elektro-operaties na injecties in de superieure colus, plaats de negatief geladen sonde van de elektrode boven het geïnjecteerde gebied en de positief geladen sonde rond het oog, snuit of kin. In dit geval is de oriëntatie van de elektrode onder een hoek van 25 tot 40 graden ten opzichte van de middenlijn. Deze afbeelding toont de dorsale laterale cortex na elektroporatie van fluorescente reporterplasmiden die membraan-getagd klaver in groen en tag bfp tot expressie brengen.

Twee nucleaire eiwitten hier getoond in rood pseudokleur. Uitgebreide dendrieten worden gevonden in deze corticale interneuron ongeveer twee maanden na elektroporatie. EGFP-positieve cellen zijn BRDU-positief, wat aangeeft dat ze tijdens de elektroporatieprocedure aan het prolifereren waren.

Bij het uitvoeren van deze techniek is het belangrijk om te focussen op het juiste targeten van het schiloppervlak om verstoring van de onderliggende cortex en/of vaatbundel te voorkomen.