Name: Tissue Engineering van Tumor Stromal Microenvironment met Toepassing op Cancer Cell Invasion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Leer hoe je een native matrix genereert uit fibroblasten om tumorcelinvasie te bestuderen. Deze 3D-cultuurmethode biedt een fysiologisch relevant model voor kankeronderzoek en helpt bij het begrijpen van tumor-stroma interacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

APS wordt ondersteund door Debra International en de Britse Skin Foundation. YZN wordt ondersteund door A * STAR - University of Dundee Partnership PhD-programma.

Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki Principes en werd goedgekeurd door de bevoegde ethische commissies. 1. Voorbereiding van de media en reagentia <ol><li> Bereiding van 200x van L-ascorbinezuur 2-fosfaat stock <ol><li> Los 29 mg L-ascorbinezuur 2-fosfaat per 5 ml Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) oplossing en filtreer door 0,22 urn membraanfilter. Vastleggen als 0,25 ml steriel fracties in -20 ° C. </li><li> Voeg 0,25 ml van 200x L-ascorbinezuur 2-fosfaat stock elk 50 ml fibroblast medium (DMEM met 1% L-glutamine en 10% foetaal runderserum) op de dag vereist, voor een uiteindelijke concentratie van 0,1 mM L -ascorbinezuur 2-fosfaat. </li></ol></li><li> Bereiding van keratinocyt groeimedia <ol><li> Isolatie en kweek van primair SCC keratinocyten zijn eerder 21 beschreven. Bereiding van keratinocyten groeimedia wordt beschrevendaarin ook. </li><li> Kortom, bereid de media als volgt: 300 ml DMEM en 100 ml Ham&#39;s F-12 aangevuld met 10% FBS 0,4 mg / ml hydrocortison 5 mg / ml insuline 10 ng / ml EGF 5 mg / ml transferrine 8.4 ng / ml cholera toxine 13 ng / ml liothyronine 1x penicilline-streptomycine oplossing </li></ol></li></ol> 2. In Vitro Bouw van fibroblast-afgeleide Inheemse Matrix in L-ascorbinezuur 2-Fosfaat aangevuld medium <ol><li> Zaad 200.000 fibroblasten per putje in 6-well platen (20.000 cellen / cm 2) in fibroblast medium aangevuld met L-ascorbinezuur 2-fosfaat. Opnieuw ingevoerd om de 2-3 dagen met 2-5 ml van de media. (Opmerking: Refeeding frequentie en het volume kan worden aangepast aan de individuele behoeften van verschillende cellen passen Zie &quot;Discussies&quot;.). </li><li> Een dikke laag van cellen ingebed in de extracellulaire matrix aan het eind van 6 weken, zichtbaar voor het blote oog (formulier <strong&gt; Figuur 1). Om deze laag te bevrijden van de weefselkweek plaat, zachtjes schrapen de omtrek van matrix met een 1 ml micropipet tip en duw de randen van de matrix naar het midden van de put. Deze laag van cellen en matrix (matrix natief) moeten gemakkelijk losneembaar van het plaatoppervlak, en nu te zweven in de media. Spreid de inheemse matrix in de media om te voorkomen dat het vouwen op zichzelf. </li><li> Laat de inheemse matrix vlotter en verbouwen voor 5 dagen, het veranderen van de media om de 2-3 dagen. Door treksterkte en intrinsieke remodeling in matrix, de matrix sterk samentrekt en wordt gereduceerd tot een kleinere, maar dikker inheemse matrix, en is klaar om te worden gebruikt voor invasie assay. </li></ol> 3. Invasieanalyse met Tumor SCC Keratinocyten <ol><li> Pak de inheemse matrix voorzichtig met stompe tang en over te dragen aan nylon net. Eenmaal op de nylon net, verspreid de matrix zacht zo plat mogelijk liggen met een 1 ml micropipettip en stompe tang. </li><li> Bereid de steriele klonale cilinders door smeren een kleine hoeveelheid steriele vaseline aan een uiteinde. </li><li> Plaats de klonale cilinders op de inheemse matrix, met de vaseline naar beneden. Dit is om een ​​afdichting tussen de natieve matrix en klonale ringen waarborgen. </li><li> Voeg CSCC cellen aan de klonale cilinders (250.000 cellen in 100 ul keratinocyt groeimedium). </li><li> Verwijder de klonale cilinders na 6 uur wanneer de CSCC cellen neer op de inheemse matrix hebben gevestigd. </li><li> Til de nylon net met de inheemse matrix en CSCC cellen aan de lucht-water grensvlak op gebogen roestvrij staal gaas steun. </li><li> Voeg keratinocytengroeifactor medium aangevuld met ascorbinezuur tot de media level de bodem raakt van de oorspronkelijke matrix. </li><li> Verander media om de 2-3 dagen en de oogst op 7 en 14 dagen na het zaaien van CSCC cellen. </li></ol> 4. Oogsten van 3D Culturen en voorbereiding voor histologie <ol><li> Fix in 4% paraformaldehyde overnacht bij kamertemperatuur. </li><li> Bisect de monsters en embed in was voor formaline gefixeerde in paraffine ingebedde blokken, met het snijvlak naar buiten. </li><li> Als alternatief insluiten de doorsneden monsters in oktober en snap-vries onmiddellijk in vloeibare stikstof voor vers ingevroren weefsel blokken. </li><li> Snijd 4 micrometer secties over microtoom en dewax (indien nodig). Vlekken met behulp van standaard hematoxyline en eosine. De CSCC cellen te visualiseren, monoklonaal antilichaam tegen keratine 14 (LL001, in-house) kan worden gebruikt in immunohistochemische kleuring. </li></ol>

<ol><li>Bell, E., Ehrlich, H. P., Buttle, D. J., Nakatsuji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+tissue+formed+in+vitro+and+accepted+as+skin-equivalent+tissue+of+full+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness.</a> Science. 211 (4486), 1052-1054 (1981).</li>
<li>Asselineau, D., Bernhard, B., Bailly, C., Darmon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+morphogenesis+and+induction+of+the+67+kD+keratin+polypeptide+by+culture+of+human+keratinocytes+at+the+liquid-air+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Epidermal morphogenesis and induction of the 67 kD keratin polypeptide by culture of human keratinocytes at the liquid-air interface.</a> Exp. Cell Res. 159 (2), 536-539 (1985).</li>
<li>Pruniéras, M. M., Régnier, M. M., Woodley, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Cultivation+of+Keratinocytes+with+an+Air-Liquid+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface.</a> J. Invest. Dermatol. 81 (1 Suppl), 28-33 (1983).</li>
<li>Prunieras, M., Régnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+procedure+for+culturing+human+epidermal+cells+on+allogenic+or+xenogenic+skin%3A+preparation+of+recombined+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Chir.+Plast%22%5BJournal%5D)">New procedure for culturing human epidermal cells on allogenic or xenogenic skin: preparation of recombined grafts.</a> Ann. Chir. Plast. 24 (4), 357-362 (1979).</li>
<li>Gaggioli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-led+collective+invasion+of+carcinoma+cells+with+differing+roles+for+RhoGTPases+in+leading+and+following+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells.</a> Nature. 9 (12), 1392-1400 (2007).</li>
<li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432 (7015), 332-337 (2004).</li>
<li>Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-Associated+Fibroblasts+Are+Activated+in+Incipient+Neoplasia+to+Orchestrate+Tumor-Promoting+Inflammation+in+an+NF-%CE%BAB-Dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Manner.+Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-κB-Dependent.</a> Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).</li>
<li>Harkness, R. D., Marko, A. M., Muir, H. M., Neuberger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolism+of+collagen+and+other+proteins+of+the+skin+of+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">The metabolism of collagen and other proteins of the skin of rabbits.</a> Biochem. J. 56 (4), 558-569 (1954).</li>
<li>Ehrmann, R. L., Gey, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growth+of+cells+on+a+transparent+gel+of+reconstituted+rat-tail+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">The growth of cells on a transparent gel of reconstituted rat-tail collagen.</a> J. Natl. Cancer Inst. 16 (6), 1375-1403 (1956).</li>
<li>Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+complexes+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Basement membrane complexes with biological activity.</a> Biochemistry. 25 (2), 312-318 (1986).</li>
<li>Vukicevic, S., Kleinman, H. K., Luyten, F. P., Roberts, A. B., Roche, N. S., Reddi, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+active+growth+factors+in+basement+membrane+Matrigel+suggests+caution+in+interpretation+of+cellular+activity+related+to+extracellular+matrix+components%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components.</a> Exp. Cell Res. 202 (1), 1-8 (1992).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BD+Biosciences+-+Discover+Labware%5BTitle%5D)+AND+%22SPC-356230+Rev+5.0+at+Rev+5.0%22%5BJournal%5D)">BD Biosciences - Discover Labware.</a> SPC-356230 Rev 5.0 at Rev 5.0. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://SPC-356230 Rev 5.0">http://SPC-356230 Rev 5.0</a> Forthcoming.</li>
<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
<li>Ng, Y. Z., Dayal, J. H., South, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Predisposition+to+Cutaneous+Squamous+Cell+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Genetic Predisposition to Cutaneous Squamous Cell Carcinoma.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Christiano, A. M. A., Greenspan, D. S. D., Lee, S. S., Uitto, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+human+type+VII+collagen.+Complete+primary+sequence+of+the+alpha+1%28VII%29+chain+and+identification+of+intragenic+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning of human type VII collagen. Complete primary sequence of the alpha 1(VII) chain and identification of intragenic polymorphisms.</a> J. Biol. Chem. 269 (32), 20256-20262 (1994).</li>
<li>Hovnanian, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+linkage+of+recessive+dystrophic+epidermolysis+bullosa+to+the+type+VII+collagen+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Genetic linkage of recessive dystrophic epidermolysis bullosa to the type VII collagen gene.</a> J. Clin. Invest. 90 (3), 1032-1036 (1992).</li>
<li>Ryynänen, M. M., Ryynänen, J. J., Sollberg, S. S., Iozzo, R. V. R., Knowlton, R. G. R., Uitto, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+linkage+of+type+VII+collagen+%28COL7A1%29+to+dominant+dystrophic+epidermolysis+bullosa+in+families+with+abnormal+anchoring+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Genetic linkage of type VII collagen (COL7A1) to dominant dystrophic epidermolysis bullosa in families with abnormal anchoring fibrils.</a> J. Clin. Invest. 89 (3), 974-980 (1992).</li>
<li>Ng, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-derived+dermal+matrix+drives+development+of+aggressive+cutaneous+squamous+cell+carcinoma+in+patients+with+recessive+dystrophic+epidermolysis+bullosa%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-derived dermal matrix drives development of aggressive cutaneous squamous cell carcinoma in patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa.</a> Cancer Res. 72 (14), 3522-3534 (2012).</li>
<li>Larouche, D., Paquet, C., Fradette, J., Carrier, P., Auger, F. A., Germain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+15%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 15.</a> Methods Mol. Biol. 482, 233-256 (2009).</li>
<li>Pouliot, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstructed+human+skin+produced+in+vitro+and+grafted+on+athymic+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Reconstructed human skin produced in vitro and grafted on athymic mice).</a> Transplantation. 73 (11), 1751-1757 (2002).</li>
<li>Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+squamous+cell+carcinoma+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of squamous cell carcinoma lines.</a> Methods Biol. 731, 151-159 (2011).</li>
<li>Pinnell, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+collagen+biosynthesis+by+ascorbic+acid%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Yale+J.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of collagen biosynthesis by ascorbic acid: a review.</a> Yale J. Biol. Med. 58 (6), 553-559 (1985).</li>
<li>Hata, R., Senoo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-ascorbic+acid+2-phosphate+stimulates+collagen+accumulation%2C+cell+proliferation%2C+and+formation+of+a+three-dimensional+tissuelike+substance+by+skin+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">L-ascorbic acid 2-phosphate stimulates collagen accumulation, cell proliferation, and formation of a three-dimensional tissuelike substance by skin fibroblasts.</a> J. Cell. Physiol. 138 (1), 8-16 (1988).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Vanwege de aard van dit experiment, kan de totale tijd van uitvoering maximaal twee maanden. Gedurende deze tijd moeten uiterste zorg en steriele weefselkweek methoden worden toegepast om microbiële contaminatie te voorkomen. Naast zijn rol als cofactor bij de synthese van hydroxyproline en hydroxylysine van collagenen, ascorbinezuur stimuleert collageen mRNA expressie in fibroblasten 22. Het ascorbinezuur keuze hier is het stabieler L-ascorbinezuur 2-f...

Het gebruik van biomateriaal in 3D weefselkweek heeft onderzoekers in staat gesteld celgedrag te bestuderen in het laboratorium onder fysiologische omstandigheden meer verwant is aan een in vivo omgeving dan een samengevat met 2D hechting en kunststof. In het bijzonder, naar voren hebben grote vooruitgang geboekt in het modelleren van gelaagde epitheel met de goedkeuring van 3D kweekmethoden bij de lucht-water grensvlak 1-4. Dergelijke technieken getrouw na te bootsen keratinocytdifferentiatie en tumorcelinvasie waardoor meer flexibiliteit en trouw voor onderzoekers bestuderen deze processen. De keuze van biomateriaal substraat aan de stromale omgeving nabootsen heeft vooral betrekking op het gebruik van type I collageen, Engelbreth-Holm-Swarm muizen sarcoom matrix en de-epidermized dermis. Bijvoorbeeld zijn kanker-geassocieerde fibroblasten aangetoond bijdragen aan kankerinvasie 5, initiatie en progressie via stroma-epitheliale interacties 6,7 when gekweekt in dergelijke substraten. De gouden standaard voor het nabootsen van de stromale omgeving in de huid, het grootste en meest bestudeerde gelaagde epitheel gebruik van dergelijke technieken is te de-epidermized humane dermis (DED) beschouwd. Bereiding van DED betreft het verwijderen van de epidermis via trypsine of fysische dissociatie van menselijke kadaver huid 3,4. Niettemin kan de toegang tot dergelijke huid zeer moeilijk zijn voor laboratoria niet geassocieerd met klinische instellingen, en zieke dermis is bijna onmogelijk te verkrijgen. Als alternatief, laboratoria gebruiken vaak een combinatie van type I collageen (geïsoleerd uit staarten rat) en / of Engelbreth-Holm-Swarm muis sarcoom matrix. Na de ontdekking in 1927 door Nageotte 8 dat collageen gemakkelijk kunnen worden geïsoleerd met behulp van azijnzuur en zout neerslag, werd de toepassing ervan op weefselkweek vervolgens ontwikkeld door huzella en collega&#39;s 9. Collageen coating bleek superieur aan glas voor celkweek van 29 stammen en weefselexplantaten als ondervraagd door Ehrmann en Gey 9 te zijn. Momenteel is de belangrijkste soort collageen in weefselcultuur van rat-staart pezen en wordt meestal gekocht van commerciële bronnen. Echter, het nadeel voor een getrouwe substraat recapitulatie is dat de rattenstaart collageen is niet identiek aan menselijk collageen, of de menselijke dermis, waar type I en III collageen aanwezig als belangrijkste bestanddelen zijn, en geïsoleerde rattenstaart collageen is altijd gefragmenteerd. Engelbreth-Holm-Swarm muis sarcoom matrix is een geleiachtige eiwit mengsel afgescheiden door gekweekte Engelbreth-Holm-Swarm muis sarcoomcellen 10. De belangrijkste bestanddelen zijn laminin, type IV collageen, heparine sulfaat proteoglycanen, entactine en nidogen en de precieze verhoudingen van deze eiwitten zal variëren van partij tot partij. Naast structurele proeiwitten, deze matrix bevat ook aanzienlijke niveaus van groeifactoren zoals transformerende groeifactor β, epidermale groeifactor, insuline-achtige groeifactor 1, runder fibroblast groeifactor en van bloedplaatjes afgeleide groeifactor die celgedrag 11,12 zou veranderen. De richting van de enorme complexiteit van Engelbreth-Holm-Swarm muis sarcoom matrix, een totaal van 1851 eiwitten werden geïdentificeerd in een recente proteomics onderzoek 13. In het licht van de rijke en complexe aard van deze matrix, is voorzichtigheid is geboden bij het ​​interpreteren en vergelijken van verschillende experimenten met het gebruik van het 11. Onze laboratoria hebben een grote interesse in genetische huidziekten, met name die met een aanleg voor het ontwikkelen van plaveiselcelcarcinoom van de huid (CSCC) 14. Bij recessieve dystrofische epidermolysis bullosa (RDEB), ernstige blaarvorming ziekte met kiembaanmutaties in COL7A1 gen <sup&gt; 15-17, hebben wij vastgesteld dat de dermale micro bij deze patiënten tumorbevorderend 18. In de loop van deze studie konden we geen tumor bevorderende eigenschappen van dermale fibroblasten ingebed in collageen I / Engelbreth-Holm-Swarm muizen sarcoom matrix en onderzocht hoe beoordelen eigen, inheemse matrix cellen te beoordelen. Om dit te bereiken, hebben we bewerkt een eerdere techniek vanuit het laboratorium van Lucie Germain werken op de menselijke huid equivalenten 19,20. Techniek Germain kon menselijke huid reconstrueren overzichtelijke basaalmembraan met primaire humane keratinocyten en fibroblasten kweken in afwezigheid van een synthetisch of cadaveric steiger. In dit artikel worden de stappen die gebruikt worden om de cutane tumor stromale micro-omgeving (native matrix) recapituleren direct afgeleid uit primaire stromale fibroblasten in vitro worden beschreven 18. Inheemse matrices produced door langdurige kweek van fibroblasten werden als een dermale equivalent aan assay voor CSCC celinvasie. We presenteren gegevens met behulp natieve matrix verkregen uit de extracellulaire matrix afgescheiden door RDEB fibroblasten (tekort bij type VII collageen (C7)) of RDEB fibroblasten retroviraal getransduceerde met type VII collageen expressie construct en tonen de grote invloed van een collageen op tumor celinvasie.

<table><tbody><tr><td>L-Ascorbic acid 2-fosfaat</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>DMEM met L-glutamine, 4.500 mg/L D-glucose, 110 mg/L natriumpyruvaat</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>100x Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina</td><td>VWR</td><td>PROL28908.290</td><td></td></tr><tr><td>Clonale cilinders</td><td>Sigma</td><td>Z370789</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Net Filter Disc Hydrophilic 100 &#956;m 25 &#956;m diameter 100/pk</td><td>Millipore</td><td>NY1H02500</td><td></td></tr><tr><td>Gebogen roestvrij staal gaasdraad ondersteuning</td><td>Gemaakt in huis</td><td></td><td>Afmetingen zijn gemaakt zodat het gaas zou passen in 6-well platen</td></tr></tbody></table>

tissue engineering van tumor stromal microenvironment met toepassing op cancer cell invasion

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypische kweken van epitheliale cellen op een matrix ingebed met mesenchymale cellen worden veel gebruikt voor epitheliale celdifferentiatie en invasie bestuderen. Soort rat staart I collageen en / of matrix afgeleid van Engelbreth-Holm-Swarm muis sarcoom cellen zijn van oudsher gebruikt als de substraten het modelleren van de matrix of stromale micromilieu waarin mesenchymale cellen (meestal fibroblasten) worden bevolkt. Hoewel experimenten met dergelijke matrices zijn zeer informatief, kan worden gesteld dat door een dwingende aanwezigheid van een enkel eiwit (zoals type I collageen) of een hoog gehalte aan basale membraan componenten en groeifactoren (zoals matrix afgeleid uit muis sarcoom cellen), deze substraten niet de beste bijdrage matrixsamenstelling door de stromale cellen zelf weerspiegelen. Om inheemse matrices geproduceerd door primaire dermale fibroblasten geïsoleerd van patiënten met een tumor gevoelig, genetische blaarvorming stoornis (recessief Dystrofe studerenepidermolysis bullosa), hebben we een bestaande natief matrix protocol tumorcelinvasie studie aangepast. Fibroblasten worden geïnduceerd om hun eigen matrix produceren gedurende langere tijd in kweek. Deze inheemse matrix wordt dan losgemaakt van de cultuur schotel en epitheliale cellen worden gezaaid op het voordat het gehele co-cultuur wordt verhoogd tot het lucht-water grensvlak. Celdifferentiatie en / of invasie kan vervolgens worden beoordeeld in de tijd. Deze techniek biedt de mogelijkheid om epitheliale-mesenchymale cel interacties in een 3D-omgeving beoordelen zonder een synthetisch of buitenlandse matrix met als enige nadeel dat het lange tijd nodig om de natieve matrix produceren. De toepassing van deze techniek Hier beschrijven we het vermogen van een molecuul van fibroblasten type VII collageen, tumorcel invasie te remmen te beoordelen.

<html> Deze techniek opent de mogelijkheid van onderzoek en vergelijking van de invasieve gedrag van tumorcellen (in dit geval CSCC) onder verschillende 3D stromale omgevingen. Met deze techniek kan niet alleen C7-deficiënte natieve matrices die de RDEB dermale milieu samengevat gegenereerd, maar ook andere matrices die genetisch gemanipuleerd tot overexpressie C7 18. Zoals gezien in figuur 2, invasie van RDEB CSCC keratinocyten was significant vertraagd in C7-overexpressie natief matrices opz...

Weefselbewerkt-fibroblast afgeleid inheemse matrix is ​​een opkomende hulpmiddel om een ​​stromale substraat dat epitheelcelproliferatie en differentiatie ondersteunt genereren. Hier een protocol deze methode toegepast op de impact van verschillende stromale celtypen op tumorcel biologie beoordelen wordt gepresenteerd.

Tissue Engineering van Tumor Stromal Microenvironment met Toepassing op Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Het algemene doel van de volgende procedure is het genereren van een natuurlijke matrix uit fibroblasten voor het beoordelen van tumorcelinvasie. Dit wordt eerst bereikt door fibroblasten op plastic te kweken in een medium verrijkt met sorbinezuur om de natuurlijke matrix te genereren. In de tweede stap wordt de natuurlijke matrix losgemaakt en vrijgegeven van het plastic kweekoppervlak, waarna deze matrix wordt gezaaid met tumorcellen en na een vaste periode wordt geheven naar de lucht-vloeistofgrensvlak.Deze 3D-culturen worden geoogst voor histologische analyse van de tumorcelinvasie. Uiteindelijk kunnen de effecten van de natuurlijke fibroblastmatrix op de tumorcelinvasie worden geëvalueerd via immunohistologische analyse. Het voordeel van deze techniek voor het genereren van typische 3D-culturen is dus dat we de natuurlijke matrix kunnen beoordelen die door de fibroblasten zelf is geproduceerd, in afwezigheid van synthetische of vreemde substraten, zoals type I collageen van een andere soort. Begin met het uitplaten van 200.000 fibroblasten per putje in zes-well platen in fibroblastmedium, aangevuld met vers bereid ascorbinezuur.Vervang elke twee tot drie dagen het medium door

tissue-engineering-tumor-stromal-microenvironment-with-application-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een eenvoudige methode beschreven voor het analyseren effecten weefsel fibroblasten op geassocieerde epitheelcellen. De combinatie van deze methode en driedimensionale weefselkweek kan worden vergemakkelijkt analyse van cellen na isolatie van 3D. De techniek is voor cellen van verschillende maligne potentieel, waardoor systematisch onderzoek effecten van tumor-geassocieerde stroma op tumorcellen.

Isolatie van Borst epitheelcellen van drie-dimensionale Mixed-cel Spheroid Co-cultuur

Interstitiële vloeistof stroom wordt verhoogd in solide tumoren en kan moduleren tumorcel invasie. Hier beschrijven een techniek interstitiële fluïdumstroming toepassing cellen ingebed in een matrix en meet de gevolgen celinvasie. Deze techniek kan gemakkelijk worden aangepast aan andere te bestuderen.

Drie-dimensionale Cultuur van de Cel Model voor het meten van de effecten van het interstitiële vocht Flow op tumorcel invasie

This video describes the technique of utilizing a native matrix to study tumor cell invasion. The technique used in this assay provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix.

Tumor Cell Invasion Assay: A 3D In Vitro Native Matrix-based Method to Assess Epithelial-mesenchymal Cell Interactions

Methoden om menselijke 3D tumorweefsels maken als testsystemen worden beschreven. Deze technologieën zijn gebaseerd op een van cellen ontdane biologische Gevasculariseerd Steiger (BioVaSc), primaire humane cellen en tumor cellijn, die kan worden gekweekt in statische als onder dynamische omstandigheden in een stroom bioreactor.

Tissue Engineering van een Menselijke 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Tumor Test System

Hier presenteren we een protocol voor co-cultuur in drie dimensies, wat nuttig is voor het onderzoeken van interacties tussen meerdere cellen en het beïnvloeden van het gedrag van kankercellen door de extracellulaire matrix. In dit experimentele model worden kankercellen gekweekt op collageengels ingebed met humane kanker-geassocieerde fibroblasten.

Driedimensionale Co-cultuur Model voor Tumor-stromale Interactie

Deze methode evalueert de invasie van kankercellen uit sferoïden in een omringende 3D-matrix.  Sferoïden worden gegenereerd via de hanging drop-kweekmethode en vervolgens ingebed in een matrix bestaande uit basement membraanmaterialen en type I collageen.  Invasie uit de sferoïden wordt vervolgens gemonitord.

Een Cancer Cell Sferoïde Assay om Invasion beoordelen in een 3D-instelling

We hebben een permeabele microporeuze membraaninzet aangepast om het tumormicro-omgeving (TME) te imiteren. Het model bestaat uit een gemengde celcultuur, maakt een vereenvoudigde generatie van sterk verrijkte individuele celpopulaties mogelijk zonder het gebruik van fluorescente markering of celsortering, en maakt het mogelijk om intercellulaire communicatie binnen het TME te bestuderen onder normale of stressomstandigheden.

Een Mimic van de tumor micro: Een eenvoudige methode voor het genereren van verrijkte celpopulaties en Onderzoeken intercellulaire communicatie

Het doel van dit protocol is om een 3D in vitro model te vestigen om de differentiatie van met kanker geassocieerde fibroblasten (CAFs) in een tumor bulk-achtige omgeving te bestuderen, die kan worden aangepakt in verschillende analysesystemen, zoals immunofluorescentie, transcriptionele analyse en Life Cell Imaging.

Een 3D-Spheroid-model als een fysiologisch systeem voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten en invasies in vitro studies

De gepresenteerde aanpak evalueert tegelijkertijd kankercelinvasie in 3D-sferoïde testen en T-celcytotoxiciteit. Sferoïden worden gegenereerd in een steiger-vrije agarose multi-microwell gegoten. Co-cultuur en inbedding in type I collageen matrix worden uitgevoerd in hetzelfde apparaat dat het mogelijk maakt om kankercel invasie en T-cel gemedited cytotoxiciteit te controleren.

Monitoring Cancer Cell Invasion en T-Cell Cytotoxicity in 3D Cultuur

Er is een kritieke behoefte aan 3D-kankermodellen die heterocellulaire overspraak vastleggen om kankermetastasen te bestuderen. Onze studie presenteert de generatie van heteromulticellulair stromaal-epitheel in een steiger- en steigervrije omgeving die kan worden gebruikt om invasie en cellulaire ruimtelijke verdelingen te bestuderen.

Heteromulticellulaire stromale cellen in steigervrije 3D-culturen van epitheelkankercellen om invasie te stimuleren

Leer hoe je een native matrix genereert uit fibroblasten om tumorcelinvasie te bestuderen. Deze 3D-cultuurmethode biedt een fysiologisch relevant model voor kankeronderzoek en helpt bij het begrijpen van tumor-stroma interacties.

Tissue Engineering van Tumor Stromal Microenvironment met Toepassing op Cancer Cell Invasion

Meer video's verkennen