Tissue Engineering van Tumor Stromal Microenvironment met Toepassing op Cancer Cell Invasion
March 18th, 2014
Weefselbewerkt-fibroblast afgeleid inheemse matrix is een opkomende hulpmiddel om een stromale substraat dat epitheelcelproliferatie en differentiatie ondersteunt genereren. Hier een protocol deze methode toegepast op de impact van verschillende stromale celtypen op tumorcel biologie beoordelen wordt gepresenteerd.
Het algemene doel van de volgende procedure is om een native matrix van fibroblasten te genereren voor het beoordelen van tumorcelinvasie. Dit wordt eerst bereikt door fibroblasten op plastic te laten groeien in een sorbinezuurverrijkt medium om de native matrix te genereren. In de tweede stap wordt de native matrix losgemaakt en vrijgemaakt van het plastic groeivormoppervlak, en vervolgens wordt deze matrix gezaaid met tumorcellen en na een vaste periode naar de lucht-vloeistofeenheid gebracht.
Deze 3D-culturen worden geoogst voor histologische analyse van de tumorcelinvasie. Uiteindelijk kunnen de effecten van de native fibroblastmatrix op tumorcelinvasie worden geëvalueerd door middel van immunohistochemische analyse. Dus het voordeel van deze techniek voor het genereren van 3D-typische culturen is dat we de native matrix kunnen beoordelen die door fibroblasten zelf wordt geproduceerd in afwezigheid van synthetische of vreemde substraten, zoals cross-species type één collageen. Begin met het zaaien van 200.000 fibroblasten per putje in zes-putjes platen in fibroblastmedia, aangevuld met vers bereide IC-zuur.
Twee fosfaat refe de cellen elke twee tot drie dagen met twee tot vijf milliliter vers medium. Aan het einde van zes weken zal zich een dikke laag cellen ingebed in extracellulair matrix vormen die zichtbaar is voor het blote oog. Afhankelijk van de gebruikte cellen, kan de zichtbare matrix zich eerder of later vormen en kan deze beginnen los te komen van de schaal zoals hier te zien is.
Om deze laag los te maken van de weefselkweekplaat, schraap voorzichtig de omtrek van de matrix met een micropipettip van één milliliter en duw vervolgens de randen van de matrix naar het midden van de put. De cellen en native matrix moeten gemakkelijk loskomen van het plaatoppervlak en nu in het medium drijven. Spreid de native matrix uit in het medium om te voorkomen dat deze zichzelf opvouwt.
Laat de native matrix gedurende vijf dagen drijvend en remodellerend, en blijf het medium om de twee tot drie dagen vervangen vanwege de treksterkte en intrinsieke remodellering. De matrix zal drastisch samentrekken en verminderen tot een kleinere maar dikkere native matrix, waarop het klaar is om te worden gebruikt. Voor de invasietest.
Voor de invasietest. Gebruik eerst stompe pincetten om de native matrix voorzichtig over te brengen naar een nylon net. Eenmaal op het net, gebruik een micropipettip van één milliliter en stompe pincetten om de matrix voorzichtig uit te smeren om zo plat mogelijk te liggen.
Smeer vervolgens een kleine hoeveelheid vaseline op een uiteinde van één steriele klonale cilinder per matrix. Plaats vervolgens de cilinders met de vaselinezijde naar beneden op de native matrices om een strakke afdichting tussen de native matrix en de klonale ringen te garanderen. Voeg nu 250.000 cutane plaveiselcelcarcinoom of SCC-cellen toe aan de cilinders in carat site groeimedium.
Nadat de cutane SCC-cellen zich hebben gezet op de native matrix, verwijder de cilinders, til vervolgens het nylon net met de native matrix en cutane SEC-cellen naar de lucht-vloeistofeenheid, en plaats het op een gebogen roestvrijstalen gaasdraadondersteuning. Voeg ten slotte keratinocytengroeimedium toe, aangevuld met sorbinezuur totdat het medianiveau de bodem van de native matrix raakt, ververs het medium om de twee tot drie dagen en oogst na zeven en veertien dagen na het zaaien van de cutane SCC-cellen. Deze techniek opent de mogelijkheid om het invasieve gedrag van tumorcellen onder verschillende 3D-stromale omgevingen te onderzoeken en te vergelijken.
Zoals te zien is in deze afbeeldingen, was de invasie van de RDEB-cutane SCC-keratinocyten significant vertraagd in C zeven die native matrices overexpresseerden in de rechterpanelen vergeleken met de C zeven-deficiënte RDEB-controles in de linkerpanelen. De ontwikkeling van deze techniek heeft onderzoekers in staat gesteld om direct de invloed van de Native Matrix geproduceerd door fibroblasten op tumorcelprocessen zoals invasie te beoordelen.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het genereren van een native matrix uit fibroblasten om tumorcelinvasie te bestuderen. De methodologie maakt het mogelijk om de impact van verschillende stromale celtypen op de tumorcelbiologie te beoordelen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Weefsel engineering
- Celbiologie
- Oncologie
Achtergrond
- Door fibroblasten afgeleide matrices bieden een natuurlijke omgeving voor celgroei.
- Het begrijpen van tumorcelinvasie is cruciaal voor kankeronderzoek.
- 3D-culturen kunnen de in vivo-omstandigheden nauwkeuriger nabootsen dan 2D-culturen.
- Native matrices vermijden de complicaties van synthetische substraten.
Doel van het onderzoek
- Om een door fibroblasten afgeleide native matrix te genereren.
- Om de effecten van deze matrix op tumorcelgedrag te evalueren.
- Om het begrip van tumor-stroma-interacties te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Fibroblasten worden gekweekt in met sorbinezuur verrijkte media.
- De native matrix wordt losgemaakt van het plastic oppervlak.
- Tumorcellen worden op de matrix gezaaid.
- 3D-culturen worden histologisch geanalyseerd op tumorinvasie.
Belangrijkste resultaten
- De native matrix ondersteunt tumorcelproliferatie.
- Histologische analyse geeft inzichten in tumorinvasiepatroon.
- Verschillende stromale celtypen beïnvloeden het tumorcelgedrag.
- Deze methode biedt een fysiologisch relevanter model voor onderzoek.
Conclusies
- De door fibroblasten afgeleide matrix is een waardevol hulpmiddel voor kankeronderzoek.
- Het verbetert het begrip van tumormicro-omgevingen.
- Deze aanpak zou kunnen leiden tot betere therapeutische strategieën.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This technique enables direct assessment of fibroblast-derived extracellular matrix on tumor cell invasion, providing a physiologically relevant model for stromal-tumor interactions. By eliminating synthetic substrates, it improves predictive confidence in preclinical target validation and mechanistic de-risking of stroma-modulating therapies. The approach supports early discovery workflows focused on stromal contribution to cancer progression.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of stromal-derived matrix components in tumor invasion assays.
- Operational Value: Provides a human-relevant 3D culture system to de-risk stromal targets.
- Scientific Value: Supports functional validation of stromal molecules like type VII collagen in modulating tumor behavior.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized native matrices for reproducible tumor cell invasion readouts.
- Operational Value: Enables quantitative histological assessment of invasion depth and pattern over time.
- Scientific Value: Facilitates comparison of invasion across genetically defined stromal conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human tumor-stroma continuity using patient-derived fibroblasts.
- Operational Value: Supports longitudinal invasion analysis at 7 and 14 days post-seeding.
- Scientific Value: Links stromal matrix composition to invasive phenotype in squamous cell carcinoma.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from stromal target identification to functional validation in 3D invasion assays, informing lead selection for stroma-modulating agents.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about stromal matrix influence on epithelial invasion pathways.
- Screening: Delivers invasion assays with standardized, fibroblast-generated matrices for compound or genetic screening.
- Analytics: Provides histological endpoints for quantifying invasion under defined stromal conditions.
- Translational Research: Uses patient-derived fibroblasts to model disease-relevant stromal contributions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for stromal biology across tumor types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating stromal matrix effects from exogenous substrates.
- Operational Value: Enables standardized matrix production and assay setup across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing stromal dependencies in tumor invasion.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of stroma-targeted candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary fibroblast culture and 3D tissue engineering.
- Depends on long-term culture (up to six weeks) for native matrix deposition.
- Necessitates sterile handling for matrix detachment, tumor cell seeding, and air-liquid interface culture.
- Involves histological processing and imaging for invasion analysis.
- Limited by the extended timeline for matrix maturation, affecting throughput.
