Tissue Engineering van Tumor Stromal Microenvironment met Toepassing op Cancer Cell Invasion

Het algemene doel van de volgende procedure is om een native matrix van fibroblasten te genereren voor het beoordelen van tumorcelinvasie. Dit wordt eerst bereikt door fibroblasten op plastic te laten groeien in een sorbinezuurverrijkt medium om de native matrix te genereren. In de tweede stap wordt de native matrix losgemaakt en vrijgemaakt van het plastic groeivormoppervlak, en vervolgens wordt deze matrix gezaaid met tumorcellen en na een vaste periode naar de lucht-vloeistofeenheid gebracht.

Deze 3D-culturen worden geoogst voor histologische analyse van de tumorcelinvasie. Uiteindelijk kunnen de effecten van de native fibroblastmatrix op tumorcelinvasie worden geëvalueerd door middel van immunohistochemische analyse. Dus het voordeel van deze techniek voor het genereren van 3D-typische culturen is dat we de native matrix kunnen beoordelen die door fibroblasten zelf wordt geproduceerd in afwezigheid van synthetische of vreemde substraten, zoals cross-species type één collageen. Begin met het zaaien van 200.000 fibroblasten per putje in zes-putjes platen in fibroblastmedia, aangevuld met vers bereide IC-zuur.

Twee fosfaat refe de cellen elke twee tot drie dagen met twee tot vijf milliliter vers medium. Aan het einde van zes weken zal zich een dikke laag cellen ingebed in extracellulair matrix vormen die zichtbaar is voor het blote oog. Afhankelijk van de gebruikte cellen, kan de zichtbare matrix zich eerder of later vormen en kan deze beginnen los te komen van de schaal zoals hier te zien is.

Om deze laag los te maken van de weefselkweekplaat, schraap voorzichtig de omtrek van de matrix met een micropipettip van één milliliter en duw vervolgens de randen van de matrix naar het midden van de put. De cellen en native matrix moeten gemakkelijk loskomen van het plaatoppervlak en nu in het medium drijven. Spreid de native matrix uit in het medium om te voorkomen dat deze zichzelf opvouwt.

Laat de native matrix gedurende vijf dagen drijvend en remodellerend, en blijf het medium om de twee tot drie dagen vervangen vanwege de treksterkte en intrinsieke remodellering. De matrix zal drastisch samentrekken en verminderen tot een kleinere maar dikkere native matrix, waarop het klaar is om te worden gebruikt. Voor de invasietest.

Voor de invasietest. Gebruik eerst stompe pincetten om de native matrix voorzichtig over te brengen naar een nylon net. Eenmaal op het net, gebruik een micropipettip van één milliliter en stompe pincetten om de matrix voorzichtig uit te smeren om zo plat mogelijk te liggen.

Smeer vervolgens een kleine hoeveelheid vaseline op een uiteinde van één steriele klonale cilinder per matrix. Plaats vervolgens de cilinders met de vaselinezijde naar beneden op de native matrices om een strakke afdichting tussen de native matrix en de klonale ringen te garanderen. Voeg nu 250.000 cutane plaveiselcelcarcinoom of SCC-cellen toe aan de cilinders in carat site groeimedium.

Nadat de cutane SCC-cellen zich hebben gezet op de native matrix, verwijder de cilinders, til vervolgens het nylon net met de native matrix en cutane SEC-cellen naar de lucht-vloeistofeenheid, en plaats het op een gebogen roestvrijstalen gaasdraadondersteuning. Voeg ten slotte keratinocytengroeimedium toe, aangevuld met sorbinezuur totdat het medianiveau de bodem van de native matrix raakt, ververs het medium om de twee tot drie dagen en oogst na zeven en veertien dagen na het zaaien van de cutane SCC-cellen. Deze techniek opent de mogelijkheid om het invasieve gedrag van tumorcellen onder verschillende 3D-stromale omgevingen te onderzoeken en te vergelijken.

Zoals te zien is in deze afbeeldingen, was de invasie van de RDEB-cutane SCC-keratinocyten significant vertraagd in C zeven die native matrices overexpresseerden in de rechterpanelen vergeleken met de C zeven-deficiënte RDEB-controles in de linkerpanelen. De ontwikkeling van deze techniek heeft onderzoekers in staat gesteld om direct de invloed van de Native Matrix geproduceerd door fibroblasten op tumorcelprocessen zoals invasie te beoordelen.