Reconstructie van 3-dimensionale Histologie Volume en de toepassing ervan te studeren Mouse borstklieren

Het algemene doel van de volgende video is om een benadering voor beeldregistratie voor driedimensionale histologie en volumereconstructie te presenteren om veranderingen in de macrostructuur van mammaire cellen te bestuderen. Hiervoor worden melkklieren weggesneden uit wild-type muizen en insulin-like growth factor binding protein seven, IGF BP seven null muizen, drie dagen na het begin van de lactatie. De klieren worden vervolgens verwerkt en ingebed in paraffineblokken voor het maken van coupes.

Vervolgens worden er beelden van het optische blokoppervlak van de weefselblokken vastgelegd en wordt het weefselblok in coupes gesneden. Beelden van de coupes worden vastgelegd en met behulp van aangepaste software wordt elke coupe uitgelijnd met het bijbehorende beeld van het blokoppervlak om het histologische volume van de melkklier te reconstrueren. De resulterende gegevens benadrukken verschillen in grootte tussen mutante en wild-type klieren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals driedimensionale confocale tweevoudige microscopie, is dat deze informatie verschaft over een veel groter ruimtelijk gebied. Deze methode kan ook worden gebruikt voor het onderzoeken en valideren van nieuwe technieken en algoritmen in volumetrische medische beeldvorming en therapieën, alsook voor het maken van 3D-analyses met een hoge resolutie van verschillende organen. Dit gereconstrueerde histologische volume vormt een betrouwbare weergave van het geprocesseerde specimen zonder voortgeplante registratiefouten.

We kregen oorspronkelijk het idee voor deze methode toen we opmerkten dat IGF P seven null-muizen kleinere nesten hebben en niet in staat zijn om meerdere grote nesten te ondersteunen, waardoor we besloten de structuur van hun melkklieren te onderzoeken. Zodra het weefsel is ingebed in paraffine, gebruikt u een rotatiemicrotoom om het blok bij te trimmen totdat het overtollige paraffine is verwijderd. Boor vervolgens met een verticale freesmachine gaten van 1 mm in ten minste twee hoeken van het paraffineblok, loodrecht op de cassette, en monteer het weefselblok op het rotatiemicrotoom.

Om vervolgens het systeem voor block-face imaging voor de microtoom op te stellen, plaatst u een camera met een telelens onder een kleine hoek ten opzichte van het oppervlak van het weefselblok. De camera moet verbonden zijn met een computer vóór de microtoom. Plaats vervolgens een lichtbron voor het blok, zodanig dat de camera de reflectie van het licht vanaf het blok vastlegt.

Pas de hoek van de camera aan totdat het weefsel aan het oppervlak van het blok duidelijk te onderscheiden is van de omringende paraffine. Maak één optische afbeelding van het blokoppervlak. Snijd vervolgens met de microtoom linten van vier secties met een dikte van vijf microns.

Breng de linten over naar een koud waterbad, scheid de secties van het lint en schep vervolgens de tweede en vierde secties uit het koude water op een objectglas. Breng deze over naar een warm waterbad om de rimpels te verwijderen. Door de tweede en vierde secties te kiezen, ontstaat er een tussenruimte van vijf micron tussen de secties.

Zodra ze kreukvrij zijn, worden de coupes door middel van scooping opnieuw op de microscoopglasplaatjes gemonteerd. Zoals eerder vermeld, dient men erop te letten dat het snijden, monteren en kreukvrij maken van de coupes vervormingen kan veroorzaken, zoals scheuren, plooien, krimp en uitzetting. Deze artefacten bemoeilijken de registratie van de histologische coupes.

Kleur de coupes met h en d met behulp van een automatische kleurstofmachine. Dek de coupes vervolgens af met een dekglas met behulp van een automatische dekglasplaatmachine en digitaliseer de coupes op de gewenste resolutie met een digitale histologiescanner. Voor dit protocol is de vergroting 20 x en de resolutie 0,47 microns.

Dit gedeelte van de video geeft een overzicht van het proces van beeldregistratie, dat wordt uitgevoerd met eigen software die in ons laboratorium is ontwikkeld in combinatie met MATLAB C++. Met behulp van ITK wordt gestart met het downsamplen van de histologische beelden tot de resolutie van de block face-beelden. Hierdoor worden de histologische beelden met een factor 0,026 verkleind.

Open vervolgens voor beeldsegmentatie en puntselectie een aantal beelden van het blokoppervlak in MATLAB en gebruik de datacursor-tool om de pixelwaarden van de registratiegaatjes te meten. Gebruik de gemiddelde pixelwaarde als een vaste drempelwaarde om de registratiegaatjes te segmenteren. Gebruik om de extra segmenten te verwijderen de circulariteit en het oppervlak van de gesegmenteerde objecten, zodat de gaatjes behouden blijven en de overbodige segmenten worden verwijderd.

Select vervolgens voor elke melkklier één afbeelding van het blokoppervlak als referentie. Lijn de centra van de registratiegaatjes van de overige afbeeldingen van het blokoppervlak uit met de centra van de registratiegaatjes van de referentieafbeelding. Lijn vervolgens, met behulp van de transformaties die zijn verkregen voor de registratiegaatjes, de afbeeldingen van het blokoppervlak uit; segmenteer of extraheer vervolgens handmatig het weefsel uit de achtergrond voor de h- en d-secties van de uitgelijnde afbeeldingen van het blokoppervlak.

Gebruik de OSU-drempelwaardetechniek om afbeeldingen van de achtergrond te segmenteren en binaire maskers van de histologische beelden te maken. Identificeer en selecteer vervolgens, met behulp van het histogram van de gelabelde objecten, het grootste object in elk masker. Extraheer de één pixel brede begrenzingspunten uit zowel de histologische maskers als de maskers van het blokoppervlak.

Gebruik vervolgens een algoritme voor Fourier-descriptoren om de initiële rigide transformatie te bepalen tussen de randpunten van de histologie en de overeenkomstige block face-afbeeldingen. Deze initiële transformatie omvat de translatie-, rotatie- en schaalfactoren. Transformeer elke histologie-afbeelding met de initiële transformatie die in de vorige stap is verkregen.

Om de rigide registratie te verfijnen, worden de randsecties met een hoge kromming uit de histologische contour verwijderd met behulp van een rolling ball-filter. Selecteer vervolgens via een uniforme distributie willekeurig 500 punten uit de resterende histologische randpunten. Transformeer de histologische randpunten met de initiële transformatie die is verkregen uit Fourier-descriptoren.

Gebruik de begrenzingspunten van het blokoppervlak en pas het iteratieve dichtstbijzijnde-puntenalgoritme (iterative closest points algorithm) toe om de rigide transformatie tussen de begrenzingspunten van het blokoppervlak en de histologie te bepalen. Willekeurige begrenzingspunten. Transformeer vervolgens de histologiebeelden die in de vorige stap zijn verkregen om een visueel beeld van het histologievolume in de 3D-visualisatiesoftware te creëren.

Ga in Me vis lab naar modules, selecteer file miscellaneous en voeg de module composed 3D from 2D files toe. Kies vervolgens image uit het menu en voeg de module image property convert toe. Voeg tot slot een view 3D-module toe vanuit modules visualization 3D viewers.

Dubbelklik op compose 3D from 2D files om de afbeeldingen te laden en klik op create 3D. Pas de voxelgrootte aan door dubbel te klikken op image property convert, en stel de voxelgrootte in op 0.018 0.018 0.01. Bekijk het volume door dubbel te klikken op view 3D.

Bekijk tot slot de stapel afbeeldingen bij een vijfvoudige vergroting door de stappen in het bijbehorende document te volgen. Om het deficiëntiebeeld van de I-G-F-B-P seven null-muis beter te karakteriseren, is een 3D-reconstructie van de melkklieren uitgevoerd zoals hierin beschreven. Deze figuren tonen de gereconstrueerde histologische volumes van de melkklieren van het wildtype en de null-muis.

Merk op dat de gemuteerde klier rechts korter en smaller is dan het wildtype links, maar ongeveer dezelfde diepte heeft, waarbij de wildtype klier 1,06 millimeters en de null-klier 1,02 millimeters diep is. Let ook op dat de wildtype klieren links weinig stromaweefsel hebben, wat wordt aangegeven door de roze eosinekleuring, terwijl de null-klieren rechts voornamelijk uit stromaweefsel lijken te bestaan. Hier laat de hematoxylinekleuring, die de gekernde cellen identificeert, zien dat de null-klier zijn dichtheid behoudt, terwijl de wildtype klier voornamelijk klierstructuren lijkt te bevatten.

Om dit verder te onderzoeken, werden hier beelden met een hogere resolutie van het gebied van de lymfeklier uitgelijnd. Er zijn grote structuren zichtbaar die gevuld zouden zijn met melk. In tegenstelling hiermee vertoont de I-G-F-B-P seven null-klier weinig goed ontwikkelde structuren.

Bovendien zijn deze structuren dichtbevolkt met fibroblast-achtige cellen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een 3D-reconstructie van een orgaan maakt door het opnieuw opbouwen van seriële scansecties. Goed. Onthoud nu, bij het uitvoeren van deze procedure, dat het belangrijk is om de slides en scans consequent te benoemen, aangezien er een groot aantal van beide zal zijn en een sequentiële organisatie de sleutel tot succes is bij het volgen van deze procedure.

Andere methoden, zoals immunohistochemie voor specifieke cel- en ziektegescheiden markers, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals: hoe infiltreert de vasculatuur een tumor?