Name: Reconstructie van 3-dimensionale Histologie Volume en de toepassing ervan te studeren Mouse borstklieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Leer een beeldregistratiemethode voor 3D-histologische volumereconstructie van muizenmammaklieren. Deze techniek onthult structurele verschillen tussen wild-type en mutante klieren voor inzicht in lactatiebiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen het Biomarker Imaging Research Laboratory (BIRL) bij het Sunnybrook Research Institute bedanken voor hun histologiediensten. De steun voor dit werk werd geboden door de Terry Fox Foundation, de Canadian Breast Cancer Foundation‐de Prairie‐NWT evenals een CIHR-subsidie, #MOP-97996.

1. Specimen <ol><li> Accijnzen de melkklieren chirurgisch van wild-type CDH1 evenals IGFBP7-null muizen drie dagen na het begin van de lactatie. </li><li> Spreid de klieren op glasplaatjes te helpen herwinnen inheemse borstklier morfologie. </li></ol> 2. Bevestiging en weefselbehandeling <ol><li> Bevestig de melkklieren in neutraal gebufferde 4% PFA O / N bij 4 ° C. </li><li> Bewaar de klieren in 70% ethanol voor weefselverwerking. </li><li> Breng de klieren om kleine weefselverwerking cassettes. </li><li> Verwerk de weefsels met behulp van een geautomatiseerde weefselprocessor <ol><li> Dehydrateer de weefsels in toenemende ethanol en xyleen baden van 70% ethanol gedurende 45 minuten, 2 keer in 95% ethanol gedurende 45 minuten, 3 maal in 100% ethanol gedurende 1 uur en 2 keer in xyleen gedurende 45 minuten. </li><li> Permeaat de weefsels paraffine 3 maal 1 uur elk in een vacuüm met aangebrachte druk. </li></ol></li><li> Insluiten de weefsels in paraffine om blokken te vormenVoor snijden. </li></ol> 3. Histologie en Blockface Imaging <ol><li> Trim de paraffine blokken met behulp van een rotatiemicrotoom totdat de overmaat paraffine wordt verwijderd. </li><li> Gebruik een verticale freesmachine 1 mm gaten in ten minste twee hoeken van het paraffine blok loodrecht op de cassette. </li><li> Monteer het weefsel blok op de rotatiemicrotoom. </li><li> Stel het blockface imaging systeem 19 in de voorkant van het microtoom. </li><li> Image optische blockface vangen voorafgaand aan het snijden. </li><li> Snijd linten uit vier secties 5 micrometer dikte op de microtoom. <ol><li> Breng de linten om het koud waterbad. </li><li> Scheid de tweede en vierde gedeelten van de lint en mount prepareren. Het kiezen van de tweede en vierde secties verschaft een 5 um tussen secties. </li><li> Vouw elke sectie in een warm waterbad (48 ° C) om het unwrinkle, vervolgens opnieuw monteren op de microscoop dia. OPMERKING: CUtting, montage, unwrinkling de secties leiden tot een aantal verstoringen op de sectie, zoals scheuren, vouwen, krimp en uitzetting. Deze artefacten compliceren de registratie van de histologie secties. </li><li> Vlekken op de secties met H &amp; E met behulp van een automatische stainer. </li><li> Dekglaasje de dia&#39;s met behulp van een automatische afdekautomaat. </li><li> Digitaliseren van de dia&#39;s met behulp van een digitale histologie dia scanner op de resolutie van belang. Voor dit protocol de vergroting is 20x en de resolutie is 0,47 micrometer. </li><li> Down-proeven van de histologie beelden naar de resolutie van blockface beelden, 18 micrometer. </li></ol></li></ol> 4. Beeldregistratie <ol><li> Afbeelding Segmentatie en punt Selection <ol><li> In blockface beelden meet de pixelwaarden van de registratiegaten en gebruik de gemiddelde waarde vaste drempel segment registratie gaten in de hoeken van het paraffineblok. </li><li> Sinds een aantal extra onderdelen kunnen ook worden gesegmenteerd doorhet gebruik van de vaste drempel, gebruik maken van de rondheid en het gebied van de gesegmenteerde objecten om de gaten te vinden en de extra objecten verwijderen. Om dit te doen, schrijf een kleine code en vind de verhouding van (4π x gebied) / (perimeter) 2 voor de gesegmenteerde objecten. Deze ratio voor ronde voorwerpen 1. </li><li> Voor elke borstklier, selecteert u een blockface beeld als referentie en lijn de rest van de blockface afbeeldingen om de verwijzing door het centrum van de registratie gaten en-mijlpaal registratie op basis van technieken. </li><li> Voor de uitgelijnde blockface afbeeldingen handmatig segment of extraheren weefsel van de achtergrond. Gebruik de meest omvangrijke object in het masker voor de rest van het protocol. </li><li> Voor H &amp; E secties Volg de onderstaande stappen voor de automatische segmentatie. <ol><li> Gebruik Otsu thresholding techniek 20 tot segment beelden van de achtergrond en maak binaire maskers van de histologie afbeeldingen. </li><li> Identificeren en selecteren van de meest omvangrijke object in elk masker met behulp van de histogram van de gelabelde objecten. </li><li> Pak het een pixel breed grenspunten van zowel histologie en blockface maskers. </li><li> Gebruik Chain code algoritme 21, aan de grens punten vertegenwoordigen door een opeenvolging van stuksgewijze lineaire past. </li></ol></li></ol></li><li> Initial rigide registratie <ol><li> Gebruik Fourier Descriptoren algoritme 22, op zoek naar de eerste starre transformeren tussen de grenspunten van de histologie en de bijbehorende blockface beelden. Deze eerste transformatie omvat de translatie, rotatie en schaal factoren. </li><li> Transformeer elk beeld histologie met de eerste transformatie verkregen uit de vorige stap. </li></ol></li><li> Verfijning van de rigide registratie <ol><li> Verwijder de hoge kromming randprofielen van de histologie contour met een rollende bal filter 23. </li><li> Selecteer 500 punten uit de resterende histologie grenspunten willekeurig op basis van uniforme verdeling. </li><li> Transformeer de dehistologie willekeurige grens punten met de eerste transformatie verkregen van Fourier descriptors. </li><li> Selecteer de hele set van blockface grenspunten en gebruiken iteratieve Dichtstbijzijnde Points (ICP) algoritme 24 de starre transformatie tussen de blockface grenspunten, bestemming, en histologie willekeurige punten grens te vinden. </li><li> Transformeer de uitgelijnde histologische beelden verkregen uit de vorige stap en de stapel uitgelijnd histologie beelden creëert histologie volume. </li><li> Gebruik een 3D-visualisatie software om een ​​visueel beeld van de histologie volume te creëren. </li></ol></li><li> Het bekijken van de Stapel Beelden op 5x vergroting <ol><li> Down-proeven van de originele histologie beelden naar vergroting 5x. </li><li> Snijd de regio van belang in een van de histologie afbeeldingen. </li><li> Bereken de locatie van dat gebied in andere 5x histologie beelden met de combinatie van de starre transformaties van de twee niet van registratie. </li><li> Snijd de regions van belang dezelfde grootte regio alle andere histologie afbeeldingen. </li><li> Eindelijk verfijnen van de afstemming tussen de regio&#39;s handmatig. Schrijf een programma dat twee beelden overlapt en zorgt voor het selecteren van waarden voor rotatie en translatie van een van de beelden over het andere en slaat het getransformeerde beeld wanneer de uitlijning wordt aanvaard. </li><li> Bekijk de stapels van de uitgelijnde 5x histologie regio&#39;s met behulp van een 3D-visualisatie software. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Sunkin, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+Atlas%3A+An+integrated+spatiotemporal+port+for+exploring+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Brain Atlas: An integrated spatiotemporal port for exploring the central nervous system.</a> Nucleic Acids Research. 41, 996-1008 (2012).</li>
<li>Shen, E. H., Overly, C. C., Jones, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Allen+Human+Brain+Atlas%3A+Comprehensive+gene+expression+mapping+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The Allen Human Brain Atlas: Comprehensive gene expression mapping of the human brain.</a> Trends in Neurosciences. 35 (12), 711-714 (2012).</li>
<li>Trifunović, D., Karali, M., Camposampiero, D., Ponzin, D., Banfi, S., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+RNA+expression+atlas+of+retinitis+pigmentosa+genes+in+human+and+mouse+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">A high-resolution RNA expression atlas of retinitis pigmentosa genes in human and mouse retinas.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49 (6), 2330-2336 (2008).</li>
<li>Evdokimova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGFBP7+binds+to+the+IGF-1+receptor+and+blocks+its+activation+by+insulin-like+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">IGFBP7 binds to the IGF-1 receptor and blocks its activation by insulin-like growth factors.</a> Science Signaling. 5 (255), 92(2012).</li>
<li>Burger, A., Leyland-Jones, B., Banerjee, K., Spyropoulos, D., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+roles+for+IGFBP-3+and+IGFBP-rP1+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22European+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Essential roles for IGFBP-3 and IGFBP-rP1 in breast cancer.</a> European J. Cancer. 41 (11), 1515-1527 (2005).</li>
<li>Amemiya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+like+growth+factor+binding+protein-7+reduces+growth+of+human+breast+cancer+cells+and+xenografted+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">Insulin like growth factor binding protein-7 reduces growth of human breast cancer cells and xenografted tumors.</a> Breast Cancer Res Treat. 126 (2), 373-384 (2011).</li>
<li>Benatar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGFBP7+reduces+breast+tumor+growth+by+induction+of+senescence+and+apoptosis+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">IGFBP7 reduces breast tumor growth by induction of senescence and apoptosis pathways.</a> Breast Cancer Res Treat. 133 (2), 563-573 (2012).</li>
<li>Bardinet, E., et al. Co-registration of histological, optical and MR data of the human brain. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBardinet%2C+E+%22Medical+Image+Computing+and+Computer-Assisted+Intervention-Part+I%22">Medical Image Computing and Computer-Assisted Intervention-Part I</a>. , Springer-Verlag. London, UK. 548-555 (2002).</li>
<li>Jacobs, M. A., Windham, J. P., Soltanian-Zadeh, H., Peck, D. J., Knight, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registration+and+warping+of+magnetic+resonance+images+to+histological+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Physics%22%5BJournal%5D)">Registration and warping of magnetic resonance images to histological sections.</a> Medical Physics. 26 (8), 1568-1578 (1999).</li>
<li>Zhan, Y., Ou, Y., Feldman, M., Tomaszeweski, J., Davatzikos, C., Shen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registering+histologic+and+MR+images+of+prostate+for+image-based+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Academic+radiology%22%5BJournal%5D)">Registering histologic and MR images of prostate for image-based cancer detection.</a> Academic radiology. 14 (11), 1367-1381 (2007).</li>
<li>Dauguet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+stained+histological+slices+and+3D+non-linear+registration+with+in+vivo+MRI+for+whole+baboon+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of stained histological slices and 3D non-linear registration with in vivo MRI for whole baboon brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 191-204 (2007).</li>
<li>Lazebnik, R. S., Lancaster, T. L., Breen, M. S., Lewin, J. S., Wilson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+registration+using+needle+paths+and+point+landmarks+for+evaluation+of+interventional+MRI+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Volume registration using needle paths and point landmarks for evaluation of interventional MRI treatments.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 22 (5), 653-660 (2003).</li>
<li>Breen, M. S., Lazebnik, R. S., Wilson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+registration+of+magnetic+resonance+image+data+to+histological+sections+with+model-based+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional registration of magnetic resonance image data to histological sections with model-based evaluation.</a> Annals of Biomedical Engineering. 33 (8), 1100-1112 (2005).</li>
<li>Mori, H., Borowsky, A. D., Bhat, R., Ghajar, C. M., Seiki, M., Bissell, M. J. The American Journal of Pathology. 180 (6), 2249-2256 (2012).</li>
<li>Gibb, M., et al. Resolving the three-dimensional histology of the heart. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGibb%2C+M+%22Computational+Methods+in+Systems+Biology%22">Computational Methods in Systems Biology</a>. Gilbert, D., Heiner, M. , 2-16 Springer-Verlag. London, UK. 2-16 (2012).</li>
<li>Wu, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+virtual+microscopy+of+colorectal+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional virtual microscopy of colorectal biopsies.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 129 (4), 507-510 (2005).</li>
<li>Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Reconstruction+of+histological+sections%3A+Application+to+mammary+gland+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">3D Reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue.</a> Microscopy Research and Technique. 73 (11), 1019-1029 (2010).</li>
<li>Song, Y., Treanor, D., Bulpitt, A. J., Magee, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+reconstruction+of+multiple+stained+histology+images%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology+Informatics%22%5BJournal%5D)">3D reconstruction of multiple stained histology images.</a> Journal of Pathology Informatics. 4 (2), 7(2013).</li>
<li>Shojaii, R., Karavardanyan, T., Yaffe, M., Martel, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+histology+image+registration%5BTitle%5D)+AND+%22SPIE+Medical+Imaging.+7962%2C+79621E%2C+doi%3A10.1117%2F12.878762%22%5BJournal%5D)">Validation of histology image registration.</a> SPIE Medical Imaging. 7962, 79621E, doi:10.1117/12.878762. 7962 (7962E), (2011).</li>
<li>Ridler, T. W., Calvard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picture+thresholding+using+an+iterative+selection+method%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Systems%2C+Man%2C+and+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">Picture thresholding using an iterative selection method.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 8 (8), 630-632 (1978).</li>
<li>Freeman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+processing+of+line-drawing+images%5BTitle%5D)+AND+%22ACM+Computing+Surveys+%28CSUR%22%5BJournal%5D)">Computer processing of line-drawing images.</a> ACM Computing Surveys (CSUR. 6 (1), 57-97 (1974).</li>
<li>Giardina, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+curve+approximation+by+harmonically+related+vectors+with+elliptical+loci%29%5BTitle%5D)+AND+%22Computer+Graphics+and+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">Accuracy of curve approximation by harmonically related vectors with elliptical loci).</a> Computer Graphics and Image Processing. 6 (3), 277-285 (1977).</li>
<li>Shojaii, R., Martel, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+edge+point+selection+method+for+registration+of+histology+images%5BTitle%5D)+AND+%22Optical+Tissue+Image+analysis+in+Microscopy%2C+Histopathology+and+Endoscopy.+%28OPTIMHisE%29+Workshop%2C+MICCAI%22%5BJournal%5D)">A novel edge point selection method for registration of histology images.</a> Optical Tissue Image analysis in Microscopy, Histopathology and Endoscopy. (OPTIMHisE) Workshop, MICCAI. , (2009).</li>
<li>Besl, P., McKay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+registration+of+3-D+shapes%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Pattern+Analysis+and+Machine+Intelligence%22%5BJournal%5D)">A method for registration of 3-D shapes.</a> IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 14 (2), 239-256 (1992).</li>
<li>Chatterjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Igfbp7+causes+precocious+involution+in+lactating+mouse+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Loss of Igfbp7 causes precocious involution in lactating mouse mammary gland.</a> PLoS ONE. 9 (2), e87858(2013).</li>
<li>Manjunath, B. S., Chellappa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unsupervised+texture+segmentation+using+Markov+random+field+models%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Pattern+Analysis+and+Machine+Intelligence%22%5BJournal%5D)">Unsupervised texture segmentation using Markov random field models.</a> IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 13 (5), 478-482 (1991).</li>
<li>Krishnamachari, S., Chellappa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiresolution+Gauss-Markov+random+field+models+for+texture+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%3A+a+publication+of+the+IEEE+Signal+Processing+Society%22%5BJournal%5D)">Multiresolution Gauss-Markov random field models for texture segmentation.</a> IEEE Transactions on Image Processing: a publication of the IEEE Signal Processing Society. 6 (2), 251-267 (1997).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

In deze studie hebben we een beeld registratie workflow om een ​​3D histologie volume reconstrueren van seriële 2D histologie beelden, die intern willekeurig geselecteerde monumenten of geïmplanteerde ijkmarkeringen binnen het weefsel, dat het weefsel kan vervalsen niet vereist ontwikkeld. Door de beschreven methode worden optische blockface beelden zelf als referentie beelden voorafgaand aan het snijden. Wij maken gebruik van externe gaten geboord in het paraffine blok om te helpen bij het uitlijnen van de blockface af...

IGFBP7 (insuline-achtige groeifactor bindend eiwit 7) is een lid van de IGF-bindende eiwit familie, en is aangetoond dat de IGF-1 receptor 4 binden. Neerregeling van IGFBP7 bekend is gecorreleerd met slechte prognose bij borstkanker 5, terwijl de herinvoering van IGFBP7 in xenograft tumormodellen sterk remt de groei van tumoren 6 tot inductie van apoptose en cellulaire senescentie 7. Teneinde de effecten van IGFPB7 bestuderen, werd een IGFBP7-null muizen gecreëerd 5 (ongepubliceerde gegevens). Hoewel deze muizen geen tumoren, ze tonen de veranderingen in de histologie van de eierstokken, spier en lever, evenals defecten in borstklieren ontwikkeling patronen (ongepubliceerde gegevens). De defecte fenotype werd eerst aangeduid als KOmuizen kleinere worpen en niet in staat om meerdere grote tomen (ongepubliceerde gegevens) ondersteunen. 3D histologie volumes hebben de potentie om nuttige informat biedenion voor kwantitatieve en vergelijkende analyses en evaluatie van pathologische bevindingen in volumetrische medische beelden. Drie-dimensionale confocale kunnen twee-foton microscopie hoge resolutie cellen morfologische informatie van de klier op lokaal deel 14, maar heeft een beperkt gezichtsveld en diepte. Histologie volume reconstructie geeft meer informatie over een veel grotere ruimtelijke omvang. Met traditionele benaderingen enige vervorming wordt verwacht tijdens de bereiding van histologische secties, zoals krimp, uitbreiding, scheuren en plooien. Deze verstoringen bemoeilijken seriële histologische beelden register naar een 3D-stapel een 3D volume te reconstrueren. Als het aantal opeenvolgende secties met defecten verhoogt de overeenkomsten tussen intacte secties wordt verminderd en daardoor maakt het registratieproces ingewikkelder. Verschillende werkwijzen zijn voorgesteld om coupes te registreren en een continue histologie vo creërenlume. Sommige technieken afhankelijk intensiteitsvariaties 8 en anderen zijn gebaseerd op de vorm van de profielen 9. Voor sommige exemplaren van de anatomische structuren kan worden gebruikt als oriëntatiepunten 10,11 samen met-mijlpaal registratie op basis van methoden 12,13. Maar deze interne structuren misschien niet aantoonbaar zijn in het hele volume en voor sommige exemplaren geen betrouwbare anatomische structuren kunnen worden geïdentificeerd. Sommige groepen hebben een paarsgewijs registratie aanpak gebruikt en geregistreerd opeenvolgende histologie beelden ene naar de andere met contouren of anatomische structuren 16-18. Registreren seriële histologie secties met elkaar zonder het gebruik van referentiebeelden kunnen registratiefout propageren en verander de werkelijke vorm van de histologie volume. Pair-wise registratie aanpak is gebaseerd op de consistentie van de vorm van de histologie secties en de interne structuren in de hele stapel van de beelden; daarom dichte bemonstering van het model, die vereistmisschien niet altijd mogelijk, bijvoorbeeld voor klinische monsters. In deze pijpleiding gebruiken we blockface beelden als een set van referentiebeelden voor histologie volume reconstructie 19. Blockface beelden worden genomen van de paraffine weefsel blokken na montage op de microtoom en voor elke sectie wordt gesneden. Zo hoeft schade aan individuele seriecoupes cut niet bemoeien met de registratie van seriecoupes 8,11,15. We detecteren blockface beelden op een andere wijze dan de andere groepen. Het optisch blok gezicht beelden worden verkregen door een telecentrische lens te elimineren of te minimaliseren de loop en perspectivische vertekening, die meestal optreedt bij het gebruik van gewone lenzen in de optica. Dit is een van de voordelen van de voorgestelde aanpak via andere gepubliceerde methoden die blockface beeldvorming uitgevoerd met gewone lenzen. De beelden worden genomen onder een kleine schuine hoek met de reflectie van het oppervlak van het blok voor contrastverbetering tussen Tissue en paraffine oppervlak en de schaduw van het weefsel te elimineren in de diepte, onder de paraffine oppervlak. Een fotografisch filter wordt ook gebruikt om het licht afkomstig van het blok oppervlak en het weefsel om het contrast 19 evenwicht polariseren. Om te corrigeren voor de verplaatsing van het blok op de roterende microtoom worden 02:58 gaten in de hoeken van het blok, die gemakkelijk detecteerbaar zijn in de blockface afbeeldingen. De hartlijnen van deze gaten worden gebruikt samen met landmark-gebaseerde rigide registratie de blockface afbeeldingen uitlijnen.

<table><tbody><tr><td>16% PFA</td><td>VWR International</td><td>15710</td><td>16% Paraformaldehyde-oplossing</td></tr><tr><td>Kleine weefselverwerkingscassettes</td><td>VWR International</td><td>CA95029-956</td><td></td></tr><tr><td>Leica ASP300 geautomatiseerde weefselprocessor</td><td>Leica</td><td>14047643515</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25307B</td><td></td></tr><tr><td>XYleen</td><td>VWR International&nbsp;</td><td>CA95057-822</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>39501006</td><td>Paraplast weefselinbeddingsmedium</td></tr><tr><td>Leica EG 1160 inbeddingscentrum</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica roterende microtoom</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slijpmachine</td><td>Argo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscoopglazen</td><td>VWR International&nbsp;</td><td>CA48312-015</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;E kleurstof</td><td>VWR International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatische kleurinrichting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dekvlakken&nbsp;</td><td>VWR International&nbsp;</td><td>48404-452</td><td></td></tr><tr><td>MEDITE RCM 7000 glazen dekvlakbevestiger</td><td>MEDITE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica SCN400 diascanner</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks Inc</td><td>MATLAB 2007b</td><td>Ontwikkelingssoftware</td></tr><tr><td>MeVisLab</td><td>MeVis Medical Solutions AG</td><td>MeVisLab 2.1</td><td>3D visualisatiesoftware</td></tr></tbody></table>

reconstructie van 3-dimensionale histologie volume en de toepassing ervan te studeren mouse borstklieren

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Histologie volume reconstructie vergemakkelijkt de studie van 3D vorm en volumeverandering van een orgaan ter hoogte van macrostructuren opgebouwd uit cellen. Het kan ook worden gebruikt om nieuwe en algoritmen volumetrische medische beeldvorming en therapie onderzoeken en valideren. Het maken van 3D high-resolution atlassen van verschillende organen 1,2,3 is een andere toepassing van histologie volume wederopbouw. Dit verschaft een middel voor het onderzoeken van weefsel structuren en de ruimtelijke relatie tussen verschillende cellulaire functies. We geven een beeld registratie aanpak voor histologie volume reconstructie, die een reeks van optische blockface beelden gebruikt. De gereconstrueerde histologie volume vertegenwoordigt een betrouwbare vorm van de verwerkte monster zonder kunstmatig gekweekte nabewerking registratie fout. De hematoxyline en eosine (H &amp; E) gekleurde coupes van twee muizen borstklieren geregistreerd hun overeenkomstige blockface beelden gebruiken grenspunten uit het edges van het monster in de histologie en blockface afbeeldingen. De nauwkeurigheid van de registratie werd visueel beoordeeld. De uitlijning van de macrostructuren van de melkklieren werd ook visueel beoordeeld met een hoge resolutie. Deze studie schetst de verschillende stappen van deze beeldregistratie pijpleiding, van excisie van de borstklier tot 3D histologie volume reconstructie. Terwijl 2D histologie beelden tonen de structurele verschillen tussen paren van gedeelten, 3D histologie volume biedt de mogelijkheid om de verschillen in vorm en volume van de borstklieren visualiseren.

Een valkuil traditionele microscopische technieken is dat het begrip van een orgaan op microscopisch niveau is beperkt tot een gebied-van-aanzicht tegelijk. Zelfs &quot;volledige openbaarmaking&quot; dia&#39;s, die volledige dia secties bieden, niet om driedimensionale informatie te verstrekken. Met de ontwikkeling van het objectglaasje, dynamische scantechnologieën ons vermogen om een ​​gedeelte zien in zijn geheel is toegenomen, maar extrapolatie structuren vereist 3D histologie volume reconstructie. <p class="jov...

We presenteren een benadering voor beeldregistratie voor reconstructie van 3-dimensionale (3D) histologievolumes, die het onderzoek naar de veranderingen van een orgaan op het niveau van macrostructuren van cellen vergemakkelijkt. Met behulp van deze aanpak hebben we de 3D-veranderingen tussen wild-type en Igfbp7-null borstklier beoordeeld.

Reconstructie van 3-dimensionale Histologie Volume en de toepassing ervan te studeren Mouse borstklieren

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

Het algemene doel van de volgende video is om een benadering voor beeldregistratie voor driedimensionale histologie en volumereconstructie te presenteren om veranderingen in de macrostructuur van mammaire cellen te bestuderen. Hiervoor worden melkklieren weggesneden uit wild-type muizen en insulin-like growth factor binding protein seven, IGF BP seven null muizen, drie dagen na het begin van de lactatie. De klieren worden vervolgens verwerkt en ingebed in paraffineblokken voor het maken van coupes.Vervolgens worden er beelden van het optische blokoppervlak van de weefselblokken vastgelegd en wordt het weefselblok in coupes gesneden. Beelden van de coupes worden vastgelegd en met behulp van aangepaste software wordt elke coupe uitgelijnd met het bijbehorende beeld van het blokoppervlak om het histologische volume van de melkklier te reconstrueren. De resulterende gegevens benadrukken verschillen in grootte tussen mutante en wild-type klieren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals driedimensionale confocale tweevoudige microscopie, is dat deze informatie verschaft over een veel groter ruimtelijk gebied. Deze methode kan ook worden gebruikt voor het onderzoeken en valideren van nieuwe technieken en algoritmen in volumetrische medische beeldvorming en therapieën, alsook voor het maken van 3D-analyses met een hoge resolutie van verschillende organen. Dit gereconstrueerde histologische volume vormt een betrouwbare weergave van het geprocesseerde specimen zonder voortgeplante registratiefouten.We kregen oorspronkelijk het idee voor deze methode toen we opmerkten dat IGF P seven null-muizen kleinere nesten hebben en niet in staat zijn om meerdere grote nesten te ondersteunen, waardoor we besloten de structuur van hun melkklieren te onderzoeken. Zodra het weefsel is ingebed in paraffine, gebruikt u een rotatiemicrotoom om het blok bij te trimmen totdat het overtollige paraffine is verwijderd. Boor vervolgens met een verticale freesmachine gaten van 1 mm in ten minste twee hoeken van het paraffineblok, loodrecht op de cassette, en monteer het weefselblok op het rotatiemicrotoom.Om vervolgens het systeem voor block-face imaging voor de microtoom op te stellen, plaatst u een camera met een telelens onder een kleine hoek ten opzichte van het oppervlak van het weefselblok. De camera moet verbonden zijn met een computer vóór de microtoom. Plaats vervolgens een lichtbron voor het blok, zodanig dat de camera de reflectie van het licht vanaf het blok vastlegt.Pas de hoek van de camera aan totdat het weefsel aan het oppervlak van het blok duidelijk te onderscheiden is van de omringende paraffine. Maak één optische afbeelding van het blokoppervlak. Snijd vervolgens met de microtoom linten van vier secties met een dikte van vijf microns.Breng de linten over naar een koud waterbad, scheid de secties van het lint en schep vervolgens de tweede en vierde secties uit het koude water op een objectglas. Breng deze over naar een warm waterbad om de rimpels te verwijderen. Door de tweede en vierde secties te kiezen, ontstaat er een tussenruimte van vijf micron tussen de secties.Zodra ze kreukvrij zijn, worden de coupes door middel van scooping opnieuw op de microscoopglasplaatjes gemonteerd. Zoals eerder vermeld, dient men erop te letten dat het snijden, monteren en kreukvrij maken van de coupes vervormingen kan veroorzaken, zoals scheuren, plooien, krimp en uitzetting. Deze artefacten bemoeilijken de registratie van de histologische coupes.Kleur de coupes met h en d met behulp van een automatische kleurstofmachine. Dek de coupes vervolgens af met een dekglas met behulp van een automatische dekglasplaatmachine en digitaliseer de coupes op de gewenste resolutie met een digitale histologiescanner. Voor dit protocol is de vergroting 20 x en de resolutie 0,47 microns.Dit gedeelte van de video geeft een overzicht van het proces van beeldregistratie, dat wordt uitgevoerd met eigen software die in ons laboratorium is ontwikkeld in combinatie met MATLAB C++. Met behulp van ITK wordt gestart met het downsamplen van de histologische beelden tot de resolutie van de block face-beelden. Hierdoor worden de histologische beelden met een factor 0,026 verkleind.Open vervolgens voor beeldsegmentatie en puntselectie een aantal beelden van het blokoppervlak in MATLAB en gebruik de datacursor-tool om de pixelwaarden van de registratiegaatjes te meten. Gebruik de gemiddelde pixelwaarde als een vaste drempelwaarde om de registratiegaatjes te segmenteren. Gebruik om de extra segmenten te verwijderen de circulariteit en het oppervlak van de gesegmenteerde objecten, zodat de gaatjes behouden blijven en de overbodige segmenten worden verwijderd.Select vervolgens voor elke melkklier één afbeelding van het blokoppervlak als referentie. Lijn de centra van de registratiegaatjes van de overige afbeeldingen van het blokoppervlak uit met de centra van de registratiegaatjes van de referentieafbeelding. Lijn vervolgens, met behulp van de transformaties die zijn verkregen voor de registratiegaatjes, de afbeeldingen van het blokoppervlak uit; segmenteer of extraheer vervolgens handmatig het weefsel uit de achtergrond voor de h- en d-secties van de uitgelijnde afbeeldingen van het blokoppervlak.Gebruik de OSU-drempelwaardetechniek om afbeeldingen van de achtergrond te segmenteren en binaire maskers van de histologische beelden te maken. Identificeer en selecteer vervolgens, met behulp van het histogram van de gelabelde objecten, het grootste object in elk masker. Extraheer de één pixel brede begrenzingspunten uit zowel de histologische maskers als de maskers van het blokoppervlak.Gebruik vervolgens een algoritme voor Fourier-descriptoren om de initiële rigide transformatie te bepalen tussen de randpunten van de histologie en de overeenkomstige block face-afbeeldingen. Deze initiële transformatie omvat de translatie-, rotatie- en schaalfactoren. Transformeer elke histologie-afbeelding met de initiële transformatie die in de vorige stap is verkregen.Om de rigide registratie te verfijnen, worden de randsecties met een hoge kromming uit de histologische contour verwijderd met behulp van een rolling ball-filter. Selecteer vervolgens via een uniforme distributie willekeurig 500 punten uit de resterende histologische randpunten. Transformeer de histologische randpunten met de initiële transformatie die is verkregen uit Fourier-descriptoren.Gebruik de begrenzingspunten van het blokoppervlak en pas het iteratieve dichtstbijzijnde-puntenalgoritme (iterative closest points algorithm) toe om de rigide transformatie tussen de begrenzingspunten van het blokoppervlak en de histologie te bepalen. Willekeurige begrenzingspunten. Transformeer vervolgens de histologiebeelden die in de vorige stap zijn verkregen om een visueel beeld van het histologievolume in de 3D-visualisatiesoftware te creëren.Ga in Me vis lab naar modules, selecteer file miscellaneous en voeg de module composed 3D from 2D files toe. Kies vervolgens image uit het menu en voeg de module image property convert toe. Voeg tot slot een view 3D-module toe vanuit modules visualization 3D viewers.Dubbelklik op compose 3D from 2D files om de afbeeldingen te laden en klik op create 3D. Pas de voxelgrootte aan door dubbel te klikken op image property convert, en stel de voxelgrootte in op 0.018 0.018 0.01. Bekijk het volume door dubbel te klikken op view 3D.Bekijk tot slot de stapel afbeeldingen bij een vijfvoudige vergroting door de stappen in het bijbehorende document te volgen. Om het deficiëntiebeeld van de I-G-F-B-P seven null-muis beter te karakteriseren, is een 3D-reconstructie van de melkklieren uitgevoerd zoals hierin beschreven. Deze figuren tonen de gereconstrueerde histologische volumes van de melkklieren van het wildtype en de null-muis.Merk op dat de gemuteerde klier rechts korter en smaller is dan het wildtype links, maar ongeveer dezelfde diepte heeft, waarbij de wildtype klier 1,06 millimeters en de null-klier 1,02 millimeters diep is. Let ook op dat de wildtype klieren links weinig stromaweefsel hebben, wat wordt aangegeven door de roze eosinekleuring, terwijl de null-klieren rechts voornamelijk uit stromaweefsel lijken te bestaan. Hier laat de hematoxylinekleuring, die de gekernde cellen identificeert, zien dat de null-klier zijn dichtheid behoudt, terwijl de wildtype klier voornamelijk klierstructuren lijkt te bevatten.Om dit verder te onderzoeken, werden hier beelden met een hogere resolutie van het gebied van de lymfeklier uitgelijnd. Er zijn grote structuren zichtbaar die gevuld zouden zijn met melk. In tegenstelling hiermee vertoont de I-G-F-B-P seven null-klier weinig goed ontwikkelde structuren.Bovendien zijn deze structuren dichtbevolkt met fibroblast-achtige cellen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een 3D-reconstructie van een orgaan maakt door het opnieuw opbouwen van seriële scansecties. Goed. Onthoud nu, bij het uitvoeren van deze procedure, dat het belangrijk is om de slides en scans consequent te benoemen, aangezien er een groot aantal van beide zal zijn en een sequentiële organisatie de sleutel tot succes is bij het volgen van deze procedure.Andere methoden, zoals immunohistochemie voor specifieke cel- en ziektegescheiden markers, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals: hoe infiltreert de vasculatuur een tumor?

reconstruction-3-dimensional-histology-volume-its-application-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze methode beschrijft hoe te ontleden en te evalueren ontwikkeling van de borstklier en de functie van muizen. Weggesneden borstklieren zijn beoordeeld op de mate van ontwikkeling met behulp van ganse berg, terwijl melk ejectie is geëvalueerd met behulp van een oxytocine-based myo cel contractie assay.

Evaluatie van de ontwikkeling van de borstklier en functie in muismodellen

Met behulp van MRI-scans (menselijk), 3D-beeldvormingssoftware en immunohistologische analyse documenteren we veranderingen in de laterale ventrikels van de hersenen. Longitudinaal 3D-mapping van veranderingen in het volume van de laterale ventrikels en de karakterisering van periventriculaire cellulaire veranderingen die optreden in de menselijke hersenen als gevolg van veroudering of ziekte worden vervolgens gemodelleerd bij muizen.

3D modellering van de laterale ventrikels en histologische karakterisering van periventriculaire Tissue bij de mens en muis

Ontwikkeling van de mammageklier in het knaagdier is typisch geëvalueerd met behulp van beschrijvende beoordelingen of door het meten van basis fysieke attributen. Vertakingsdichtheid is een indicator van de ontwikkeling van de moeders die moeilijk is om objectief te kwantificeren. Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor de kwantitatieve beoordeling van de vertakkingseigenschappen van de borstklier.

Kwantificerende vertakkingsdichtheid in Rat Mammary Gland Whole-mounts Met behulp van de Sholl Analyse Methode

We ontwikkelden een methode om succesvol te verwijderen, verwerken, delen en vlek voor histopathologische evaluatie, mammariumweefsel dat oorspronkelijk op glijbanen was vastgezet als gehele mounts. Deze methode kan de verzameling en evaluatie van de hele membraan van de borstklier bevorderen in onderzoeken voor reproductieve en ontwikkelingstest.

Sectie Mammary Gland Whole Mounts voor Lesion Identificatie

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van geheel, intact muis borstklieren om te onderzoeken van de extracellulaire matrix (ECM) expressie en ductaal morfologie. Muis #4 abdominale klieren werden gehaald uit de 8-10 week oude vrouwelijke nullipaar muizen, vast in neutraal gebufferde formaline, gesegmenteerd en gekleurd met behulp van immunohistochemistry voor ECM eiwitten.

Isolatie van Intact, hele muis borstklieren p.a. van extracellulaire Matrix expressie en klier morfologie

We beschrijven technieken voor differentiatie-inductie van twee borstepitheellijnen, HC11 en EpH4. Terwijl beide foetale kalf serum, insuline, en prolacactine nodig om melkeiwitten te produceren, EpH4 cellen kunnen volledig onderscheiden in mammosferen in driedimensionale cultuur. Deze complementaire modellen zijn nuttig voor signaaltransductiestudies van differentiatie en neoplasie.

Differentiatie van muisborst epitheel HC11 en EpH4 Cellen

Dit protocol beschrijft een nieuw mammabeeldvormingsvenster met een vervangbaar deksel (R.MIW). Intravitale microscopie na implantatie van de R.MIW maakt longitudinale en meerdaagse beeldvorming van de gezonde en zieke borstklier mogelijk met een cellulaire resolutie tijdens de verschillende ontwikkelingsstadia.

Longitudinale intravitale microscopie met behulp van een mammabeeldvormingsvenster met vervangbaar deksel

De hier beschreven intravitale beeldvormingsmethode maakt gebruik van collageen tweede harmonische generatie en endogene fluorescentie van de metabole co-factor NAD (P) H om een niet-invasieve tumormicro-omgeving te segmenteren in tumor-, stromale en vasculaire compartimenten voor diepgaande analyse van 4D intravitale beelden.

Een labelvrije segmentatiebenadering voor intravitale beeldvorming van de micro-omgeving van borsttumoren

Een methode van intraductale injectie van reagentia voor een op ethanol gebaseerde ablatieve oplossing in de mamma-ductale boom van muizen voor in vivo beeldvorming en preventie van borstkanker wordt beschreven. Injectie direct in de tepelopening maakt het mogelijk om borstepitheelcellen te richten met minimale collaterale weefselschade.

Intraductale toediening en röntgenvisualisatie van op ethanol gebaseerde ablatieve oplossing voor preventie en lokale behandeling van borstkanker in muismodellen

Het huidige protocol beschrijft een eenvoudige techniek voor de intravitale beeldvorming van de borstklier van de zogende muis door middel van laserscanning, confocale en multifotonenmicroscopie.

Intravitale subcellulaire microscopie van de borstklier

Leer een beeldregistratiemethode voor 3D-histologische volumereconstructie van muizenmammaklieren. Deze techniek onthult structurele verschillen tussen wild-type en mutante klieren voor inzicht in lactatiebiologie.

Reconstructie van 3-dimensionale Histologie Volume en de toepassing ervan te studeren Mouse borstklieren

Meer video's verkennen