Eiwit-eiwit interacties gevisualiseerd door Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie in Protoplasten en Bladeren Tabak

Het algemene doel van het volgende experiment is het monitoren van de interactie tussen twee eiwitten die tot expressie komen in intacte tabaksbladeren. Dit wordt bereikt door het ontwerpen van geschikte constructen, waarbij de twee genen van belang worden gefuseerd met split fluorescent proteins en deze constructen worden getransformeerd in agrobacteriën. In een tweede stap worden agrobacterieculturen gemengd en geïnjecteerd in tabaksbladeren, wat leidt tot de expressie van de eiwitten en een gereconstitueerd fluorescent signaal.

Wanneer de eiwitten in nauwe nabijheid van elkaar komen, worden vervolgens ofwel volledige bladeren of geïsoleerde protoplasten onder de microscoop geanalyseerd. De resultaten tonen eiwit-eiwitinteracties aan op basis van het uitgezonden fluorescentiesignaal dat met fluorescentiemicroscopie wordt gedetecteerd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals co-immunoprecipitatie of yeast two-hybrid, is dat de eiwit-eiwitinteractie direct kan worden gemonitord in de levende plantencel.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de plantbiologie, zoals de vorming van proteïnecomplexen in verschillende cellulaire compartimenten. Om deze procedure te starten, kweekt u de agrobacteriën die gebruikt zullen worden voor de transformatie van de tabaksbladeren. Inoculeer 10 milliliters LB-medium met de juiste antibiotica met 50 microliters van de AG L one glycerolstockcultuur die het plasmid van belang bevat in een steriele 50 milliliter buis.

Incubeer gedurende ten minste 24 uur bij 28 °C, schuddend op 190 RPM, totdat de cultuur de volgende dag een OD 600 bereikt tussen 1,0 en 2,0. Centrifugeer de bacteriën bij 3000 ×g gedurende 15 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in vers bereid infiltratiemedium; pas de suspensie vervolgens aan tot een OD 600 van 1,0.

Incubeer de agrobacteriecellen gedurende twee uur in het donker bij kamertemperatuur in een overhead-schudmachine voor infiltratie van tabaksbladeren. Kies verschillende oudere bladeren van een drie weken oude tabaksplant. Meng gelijke volumes.

Drie milliliter van elk van de agro-bacteriën die de constructen van belang dragen. Vul een spuit van vijf milliliter zonder naald met het celsuspensiemengsel om de celsuspensie in de tabaksbladeren te infiltreren. Druk de spuit voorzichtig op verschillende plaatsen op de onderzijde van de bladeren, bewater de planten en laat ze gedurende twee dagen afgedekt en beschermd tegen licht staan.

Om protoplasten uit een geïnfiltreerd blad te isoleren, plaatst u eerst het blad in een Petrischaal en voegt u een beetje vers bereide enzymoplossing toe. Snijd het blad met een nieuw scheermesje in stukjes van ongeveer 0,5 vierkante centimeter. Breng vervolgens de bladstukjes samen met de enzymoplossing over naar een vacuüm.

Infiltratiefles. Vacuüm-infiltreer gedurende ongeveer 20 seconden totdat er luchtbellen uit de bladeren komen. Laat het vacuüm zeer voorzichtig ontsnappen.

Schud de kolf na 90 minuten gedurende 90 minuten bij 40 RPM in het donker bij kamertemperatuur. Laat de protoplasten vrij door één minuut te schudden bij 90 RPM. Filtreer de oplossing door gaas in een centrifugebuis met ronde bodem van 15 milliliter.

Voeg twee milliliter FPCN-buffer toe bovenop de protoplastenoplossing en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 70 ×g met een langzame versnelling en vertraging bij kamertemperatuur. Intacte protoplasten zullen zich ophopen op de interface tussen de enzymoplossing en de FPCN-buffer. Gebruik een ene milliliter pipetpunt met een wijde opening om de intacte protoplasten over te brengen naar een nieuwe centrifugebuis. Voor het slagen van deze procedure moeten altijd punten met een wijde opening worden gebruikt om het scheuren van intacte protoplasten te voorkomen.

Vul de buis aan met W five buffer en centrifugeer twee minuten bij 100 ×g met een langzame acceleratie en deceleratie. Verwijder voorzichtig het supernatant om de protoplasten te pelletten en resuspendeer de pellet in ongeveer 200 µL W five buffer, afhankelijk van de hoeveelheid protoplasten.

Om een protoplastenmonster voor laser-scanning microscopie voor te bereiden, plaatst u eerst twee kleine stroken afdichtingsmiddel met ongeveer twee centimeter tussenruimte op een microscoopglasplaatje. Breng 20 µL van de protoplastenoplossing aan tussen de stroken en plaats voorzichtig een dekglas erbovenop. De stroken afdichtingsmiddel voorkomen dat de protoplasten door het dekglas worden platgedrukt.

Om een monster van een volledig blad voor laserscanningmicroscopie voor te bereiden, snijdt u een stuk van één centimeter uit het blad en plaatst u dit op een microscoopglaasje met de onderzijde van het blad naar boven gericht. Voeg ongeveer 30 µL water toe. Plaats een dekglas bovenop en fixeer dit stevig met plakband aan beide zijden.

De beeldvorming wordt uitgevoerd met een confocale laser-scanning microscoop van het type MICCA TCS SP five voor vergroting. Gebruik een objectief met een vergroting van 63x met glycerol als beeldvormingsmedium en gebruik de Leica application suite advanced fluorescent software voor de evaluatie. Stel de Argonne-laser in op 30% en de laserenergie bij 488 nanometers op een intensiteit van 18%. Om het signaal bij 515 nanometers te monitoren, wordt de emissiebandbreedte van de eerste PMT-detector ingesteld van 495 tot 550 nanometers.

Om de autofluorescentie van chlorofyl te monitoren, stelt u de emissiebandbreedte van een tweede PMT-detector in van 650 tot 705 nanometer. Gebruik de HENI 5 61 laser om het M cherry-signaal te monitoren.

Stel de intensiteit van de laser in op 18% en de emissiebandbreedte van een derde PMT-detector op 587 tot 610 nanometer. Zorg ervoor dat afbeeldingen van alle PMT-detectorkanalen worden genomen met dezelfde gain-instellingen. De gain moet tussen 800 en 900 liggen om achtergrondsignalen uit te sluiten.

Verwerf beelden in dit formaat, met een breedte en hoogte van 1024 bij 1024 pixels en een scansnelheid van 100 hertz. Gebruik voor Z-stacks een maximale afstand van 0,5 microns tussen elke stack. In deze studie werd de BFC-methode gebruikt om de interactie van het cytosolische moleculaire chaperone HSP 90 met de membraandocking-eiwitten TPR seven en to 64 te monitoren.

Zoals in dit schema wordt getoond, is Venus gekoppeld aan het cytosolische deel van ofwel TPR7, dat zich in het endoplasmatisch reticulum bevindt, of aan 64, dat zich in de buitenste envelop van de chloroplast bevindt. Hs.P90 is aan de N-terminus gefuseerd met SCFP, waardoor interactie mogelijk is van de TPR-domeinen van talk 64 en TPR7 met de C-terminus van HSP90. SCFP alleen wordt tot expressie gebracht in het cytosol als negatieve controle om de lokalisatie van het TPR7-HSP90-proteïnecomplex te verifiëren. TPR7 en HSP90 werden co-getransformeerd met een ER-marker.

De fluorescentie werd gemonitord in intacte bladeren als controle. SCFP werd alleen tot expressie gebracht samen met TPR seven en de ER-marker. In alle getoonde afbeeldingen staat de schaalbalk voor 10 microns.

De panelen links tonen gereconstitueerde fluorescentie in het groen, gemonitord bij 515 nanometer. De ER-marker verschijnt in het rood. In de middelste panelen wordt de overlay van beide signalen getoond in de rechterpanelen.

Een gereconstitueerd signaal voor TPR7 samen met HSP90 werd gemonitord, waarbij overlap met de ER-marker geel verscheen. In contrast hiermee werd geen signaal waargenomen voor TPR7 en de negatieve controle als CFP. In het volgende voorbeeld werd het chloroplast-eiwit TOX64 als controle co-expressie met HSP90.

Tox 64 werd co-expressief met SCFP alleen. Zoals voorheen werd de gereconstitueerde groene fluorescentie gemonitord bij 515 nanometer. De middelste panelen tonen chlorofyl-autofluorescentie gemonitord bij 480 nanometer.

In de rechterpanelen is een rode overlay van beide signalen weergegeven. Gereconstitueerde fluorescentie werd waargenomen in cellen die tox 64 en HSP 90 co-expresseerden, maar niet in cellen die uitsluitend tox 64 en SCFP co-expresseerden.

Omdat de exacte lokalisatie van tox 64 en HSP 90 moeilijk te bepalen is in microscopische beelden van de volledige bladeren, werden protoplasten geïsoleerd uit geïnfiltreerde tabaksbladeren voor fluorescentiemicroscopie. Zoals eerder beschreven, werd de gereconstitueerde fluorescentie gemonitord bij 515 nanometers, de chlorofyl-autofluorescentie bij 480 nanometers, en er werden overlay-beelden gemaakt zoals getoond in dit overlay-beeld, waarin tox 64 en HSP 90 gedetecteerd kunnen worden als ringvormige structuren rondom de chloroplasten.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u uw constructen ontwerpt, tabaksbladeren transformeert en hoe u het fluorescentiesignaal dat de interactie tussen uw twee eiwitten van belang aantoont, het beste kunt visualiseren.