Name: Analyse van oxidatieve stress in zebravis embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Leer oxidatieve stress meten in levende zebravisembryo's met behulp van confocale microscopie en cytofluorometrische analyse. Deze methode maakt kwalitatieve en kwantitatieve detectie van reactieve zuurstofsoorten mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Steun in het Massimo Santoro lab komt van HFSP, Marie Curie Action, Telethon en AIRC. We danken Dafne Gays en Emiliano Panieri voor het kritisch lezen van het manuscript.

1. Voorbereiding van instrumenten en werkende oplossingen <ol><li> Bereid de vis water oplossing. Maak een voorraad oplossing door het oplossen van 2 g zeezout &#39;Instant Ocean&#39; in 50 ml gedestilleerd water. Voeg 1,5 ml van de vis water tot 1 liter gedestilleerd water te bereiden klaar om vis water (60 ug / ml zeezout uiteindelijke concentratie) te gebruiken. Autoclaaf het klaar om te vissen water te gebruiken voor gebruik. Deze oplossing wordt gebruikt als zebravis embryo medium. </li><li> Bereid methylcellulose voor embryo montage. Los op in 50 ml steriel vis water 1,5 g methylcellulose. Vergemakkelijken de ontbinding met behulp van een magneet op een roer plaat. De volledige oplossing van het poeder kan enkele uren in beslag. Controleer de oplossing op helderheid en hoeveelheid in kleine buisjes. Bewaren bij -20 ° C voor maanden en ontdooien fracties bij gebruik. Centrifugeer de methylcellulose bij 950 xg gedurende 5 minuten voor gebruik. Vermijd vries-dooi cycli van porties. </li><li> Bereid 50 ml tricaïne / ethyl-3-aminobenzoaat methaansulfonaat zout (voorraadoplossing) door het oplossen van 200 mg tricaïne in 100 ml water en op pH 7,0 met Tris-HCl 1 M (pH 9). Bewaar deze voorraad bij 4 ° C voor niet meer dan 30 dagen. LET OP: tricaïne is giftig. Gebruiken in overeenstemming met adequate behandeling richtlijnen. </li><li> Induceren van oxidatieve stress in de zebravis embryo&#39;s <ol><li> Bereid een oxidant oplossing voor generieke oxidatieve stress inductie: Maak 50 ml oxidant oplossing door toevoeging van H 2 O 2 stockoplossing (waterstofperoxide; 100 mM) om vis water. Gebruik H 2 O 2 van een uiteindelijke concentratie tussen 2 mM en 100 uM. Maak deze oplossing vlak voor gebruik. Het oxidatiemiddel oplossing kan worden toegepast op zowel gehele mount ROS-detectie en eencellige ROS-detectiemethoden. Mis deze oplossing niet bewaren. LET OP: H 2 O 2 is gevaarlijk en schadelijk bij inademing en opname door de mond. Contact met brandbaar materiaal kan brand veroorzaken. Behandel onder een afzuigkap en draag geschikte personale beschermingsmiddelen. </li><li> Bereid een oxidant oplossing voor-mitochondriën afgeleide oxidatieve stress inductie: Maak een oxidant stockoplossing (5 mm) door het oplossen van 3,9 mg rotenone in 2 ml van dimethylsulfoxide (DMSO). Bewaar deze oplossing bij kamertemperatuur in het donker. <ol><li> Ontbinden rotenone stockoplossing aan 10 ml water om een ​​vis klaar te gebruiken oplossing te maken. Gebruik rotenon bij een concentratie van 5-50 uM. Gebruik geen rotenone in concentraties van meer dan 100 micrometer. Bij passende concentraties, kan dit oxidant oplossing worden toegepast op zowel hele mount ROS-detectie en single-cell ROS-detectiemethoden. LET OP: Rotenon is giftig en gevaarlijk. Behandel volgens gepaste voorzorgsmaatregelen. </li></ol></li><li> Induceren van oxidatieve stress door gen knock-down: Knock-down nrf2a genexpressie in zebravis embryo&#39;s door morpholino micro-injectie, zoals eerder gemeld door Timme-Laragy A. et al., 2012 38.. </li><li> Induceren oxidtieve spanning na weefselschade: het genereren van een wond marge op de staartvin van de zebravis embryo&#39;s in 72 hpf zoals eerder beschreven door Niethammer et al., 2009 39.. </li></ol></li><li> Bereid 5 ml van ROS-detectie oplossing voor enkele cel ROS-detectiemethode: <ol><li> Oplossing voor algemene ROS detectie: Los het generieke ROS-gevoelige moleculaire probe in HBSS (Hanks gebalanceerde zoutoplossing) om een ​​werkoplossing (concentratiegebied: 2.5-10 pM) bereiden. Deze oplossing moet worden bereid vlak voor gebruik. </li><li> Oplossing voor specifieke detectie ROS geïnduceerd mitochondria: Kort voor gebruik lossen een mitochondriale ROS-gevoelige probe met DMSO maken van een 5 mM voorraadoplossing. Los op voorraad oplossing in HBSS om een ​​werkende oplossing (concentratie range: 2.5-10 uM) te bereiden. OPMERKING: Vermijd licht en zuurstof blootstelling van ROS-detectie werkende oplossingen en hun respectievelijke voorraad oplossingen. Bescherm de buis van licht door het gebruik vanaluminiumfolie. Bewaar of hergebruik probes opgelost in HBSS. Bewaar de voorraad oplossingen bij -20 ° C voor een maand. LET OP: Behandel moleculaire probes en DMSO onder een zuurkast in een daartoe geëigende richtlijnen. </li></ol></li><li> Bereid 5 ml ROS-detectie oplossing voor de gehele mount ROS-detectiemethode: Los het generieke ROS-gevoelige probe stockoplossing (gestabiliseerd in DMSO) in HBSS om een ​​werkoplossing (concentratiegebied: 2,5-5 uM) te bereiden. Vermijd licht en belichting zuurstof. Bescherm de buis van licht. Bereid deze oplossing voor gebruik. Bewaar of hergebruiken van deze oplossing. LET OP: Behandel moleculaire probes onder een zuurkast in een daartoe geëigende richtlijnen. </li><li> Voeg 25 ml stop oplossing door toevoeging van 10 ml foetaal runderserum 15 ml PBS 1x. Houd oplossing steriel. Bewaar deze oplossing bij 4 ° C. Deze oplossing is alleen vereist voor enkele cel - ROS detectiemethode. </li><li> Stel de zebravis lucht incubator bij 28 &amp;# 176; C. </li><li> Stel de centrifuge bij 4 ° C voor de cel ROS-detectiemethode. </li></ol> 2. Het koppelen van Adult Vissen en Selectie van zebravis embryo&#39;s <ol><li> Opstelling volwassen zebravissen paar kruisen volgens standaardprotocollen 40. Selecteer de juiste transgene lijn in overeenstemming met specifieke experimentele behoeften. </li><li> Verzamel eieren en leg ze in een 90-mm schotel met vis water / embryo medium. Houd eieren bij 28 ° C tot embryo&#39;s ontwikkelen en te groeien naar de gewenste ontwikkelingsstadium (bv. 48 HPF, 72 HPF; HPF: uur na de bevruchting). </li><li> Scherm voor het ontwikkelende embryo&#39;s. Sluiten alle onbevruchte eieren of onderontwikkelde embryo&#39;s. </li><li> Verdoven van embryo&#39;s door het toevoegen van 1 ml tricaïne (voorraad-oplossing) in 50 ml water vissen. </li><li> Selecteer Tg fluorescerende embryo&#39;s onder een stereomicroscoop. </li></ol> 3. Behandeling van embryo&#39;s met Oxidant Agent <ol><li> Gebruik minimaal 30 embryo&#39;s tussen 48 hpf en 72 HPF per andere toestand. Was embryo tweemaal met verse vis water om tricaïne verwijderen. </li><li> Splits fluorescerende embryo&#39;s in drie gerechten. Zet niet meer dan 30 embryo&#39;s / schotel. </li><li> Verwijder de wasvloeistof en voeg 10 ml van de oxidant oplossing of 10 ml van vis water als controle-oplossing. </li><li> Incubeer embryo gedurende 10 minuten tot 1 uur bij 28 ° C. De incubatieperiode hangt van het niveau van oxidatieve stress geïnduceerd worden in bepaalde weefsels. Korte perioden zijn de beste als cellen beïnvloed door oxidatieve stress geleidelijk celdood ondergaan. </li><li> Transfer embryo&#39;s in een nieuwe schotel met HBSS en wassen embryo&#39;s door zwenken. Pre-warm HBSS bij 28 ° C. </li></ol> 4. Hele Mount ROS Detectiemethode <ol><li> Verzamel embryo na behandeling oxidatiemiddel en zet niet meer dan 10 embryo&#39;s in een buisje. Spoelen met HBSS zoveel mogelijk. Bescherm de buis van licht met behulp van aluminiumfolie. </li><li> Voeg 1 ml van ROS-detectie oplossing voorelke buis. </li><li> Incubeer embryo&#39;s in het donker gedurende 15 minuten bij 28 ° C om blootstelling aan licht te vermijden. </li><li> Tijdens de incubatietijd bereiden een glasplaatje voor de hele embryo analyse. Zet 300 ul van methylcellulose op een &quot;depressie&quot; glasplaatje en verdeel het over de glazen oppervlak met een pipet tip. Vermijd bellen tijdens het loslaten van de methylcellulose. </li><li> Aan het einde van de incubatietijd, onmiddellijk de ROS-detectie-oplossing en tweemaal wassen met 2 ml HBSS. Was embryo door het buisje meerdere malen. Niet pipet of vortex. </li><li> Aspireren embryo&#39;s up in een glas Pasteur pipet. Plaats embryo bij de opening van de pipet en voorzichtig werpen ze in de methylcellulose. Oriënteer de embryo&#39;s op de juiste wijze met een fijne nylon lijn. </li><li> Vergelijk de fluorescentie van de controle embryo&#39;s met behandelde embryo. Alternatief parameters vaststellen van de fluorescentie stereomicroscoop of confocale microscoop zodat alle embryo&#39;s worden afgebeeld met dezelfdeimaging-instellingen. </li></ol> 5. Single Cell ROS-detectiemethode <ol><li> Start vanaf stap: 3.5. Zorg ervoor dat u ten minste 35 embryo&#39;s voor elke aandoening. </li><li> Transfer embryo&#39;s in een nieuw gerecht. Verwijder vis water zoveel mogelijk. Voeg 10 ml ijskoude PBS 1x en 400 ul van proteaseremmers Cocktail. Handmatig dechorionate embryo&#39;s met een tang en verwijder de dooierzak met een fijne naald. Opmerking: Het verwijderen van dooierzak zorgt voor schone monsters voor de volgende FACS-analyse. Deze stap kan worden vermeden volgens FACS instrument. </li><li> Transfer-de yolked embryo&#39;s in een 24-putjes multi-plaat (15 embryo&#39;s / putje) en verwijder alle vis water. </li><li> Voeg 300 ul HBSS, 30 ui collagenase P, 50 pi trypsine-EDTA in elk putje. </li><li> Homogeniseren embryo&#39;s door de pipet voorzichtig op en neer met een strakke pipet tip (1000 pl). </li><li> Incubeer bij 28 ° C gedurende 20 min en homogeniseren monsters pipetteren elke 5 minuten. </li><li> Controleer weefsel DISRuption door het observeren van een monster van homogenaat in de samengestelde microscoop. Vergemakkelijken enkele celsuspensie door pipetteren. Niet embryo incubeer gedurende meer dan 30 minuten. </li><li> Stop de reactie door toevoeging van 200 pl stopoplossing. Meng door pipetteren voorzichtig. </li><li> Breng celsuspensie in een vooraf gekoelde buis met strak laag. Houd buis op ijs en vermijd blootstelling aan licht. </li><li> Centrifugeer gedurende 5 min bij 250 xg bij 4 ° C. </li><li> Verwijder de bovenste fase en opnieuw te schorten cellen met ijskoude HBSS door voorzichtig pipetteren. </li><li> Tellen cellen en zorg ervoor dat je hetzelfde aantal cellen in al uw monsters. Gebruik niet minder dan 2 x 10 6 cellen. </li><li> Centrifugeer cellen gedurende 5 min bij 250 xg bij 4 ° C. </li><li> Verwijder supernatant en het pellet schorsen 1 ml ijs gekoeld HBSS bevattende ROS-gevoelige probe. </li><li> Incubeer de buis bij kamertemperatuur gedurende 3 min in het donker. Variëren incubatietijd volgens het niveau van oxidatieve stress en tHij gevoeligheid van de probe. </li><li> Overdracht cellen om een ​​FACS buis. Houd buizen op ijs en blootstelling aan licht te vermijden voor het FACS-analyse. </li><li> Cellen te sorteren met een fluorescentie-geactiveerde cel sorteerder (FACS). Set golflengten volgens Tg weefsel fluorescentie (bijv. GFP) en de excitatie / emissie spectra van de moleculaire probe voor ROS detectie (bv. specifieke mitochondriale ROS-gevoelige probes generieke ROS-gevoelige probes). </li><li> Voor elke aandoening, meten alle monsters binnen dezelfde experimentele sessie door toepassing van dezelfde FACS instellingen. Bereken het percentage fluorescerende cellen als het gemiddelde van verschillende biologische herhalingen. Analyseer tenminste twee replica voor elke conditie. </li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Kritische stappen De procedure voor oxidatieve stress detectie in zebravis embryo hierin beschreven omvat twee verschillende methoden. De hele mount ROS-detectiemethode is vooral een kwalitatieve test voor ROS-detectie, terwijl de cel ROS-detectie methode is de specifieke kwantitatieve metingen (figuur 1). Beide methoden bieden een snelle en eenvoudige manier om in vivo ROS-detectie in zebravis embryo&#39;s te beoordelen. Maar ze beiden presenteren een aantal kritisch...

Oxidatieve stress is specifiek gedefinieerd als een aandoening die het gevolg van een onevenwichtige cellulaire redox toestand. Het complex redoxreacties die routinematig gebeuren in cellen bepalen de cellulaire redox-toestand. Redoxreacties omvatten alle chemische reacties die bestaan ​​uit de overdracht van elektronen tussen de atomen van biologische moleculen produceren reductie en oxidatie van moleculen (bijvoorbeeld redoxreacties). Deze reacties worden gekatalyseerd door elektronische sturing soorten (pro-oxidatieve deeltjes), die worden gekenmerkt door een extreme structurele instabiliteit en spontane activatie van onevenwichtige elektronen die uit met naburige biomoleculen. Deze onregelmatige reacties resulteren in DNA-schade, eiwit carboxylatie en vetverbranding, en uiteindelijk leiden tot celdood 1. Verhoogde niveaus van oxidatieve stress zijn geassocieerd met veroudering en de progressie van verschillende pathologische toestanden 2. Oxidatieve stress heeftgerapporteerd verantwoordelijk voor vasculaire veranderingen in diabetes en cardiovasculaire aandoeningen 3,4 te zijn. Het speelt ook een cruciale rol in neuronale degeneratie bij de ziekte van Alzheimer en Parkinson 5. Bovendien is oxidatieve stress is aangetoond als een kritieke factor in het bestuur van de progressie van kanker en metastatische gebeurtenissen 6,7. Bovendien kan ontsteking en immuunreacties en verdere steun oxidatieve stress 8. In levende cellen, worden pro-oxidatieve deeltjes afkomstig uit zuurstof (ROS, reactieve zuurstofspecies) of stikstof (RNS, reactieve stikstof species). ROS zijn de hydroxylgroep, de superoxide anion (OH.) (O 2 -) en waterstofperoxide (H 2 O 2). De primaire RNS is stikstofoxide (NO.). Een reeks van secundaire reactieve species kunnen worden gegenereerd door spontane interactie between ROS en RNS of vrije metalen ionen 9. Bijvoorbeeld, het superoxide anion reageert met lachgas te peroxynitraat (ONOO -) vorm, terwijl H 2 O 2 reageren met Fe2 + genereert hydroxylradicalen. ROS en RNS, vanwege hun vermogen om te reageren met verschillende biomoleculen, worden beschouwd als een gevaarlijke bedreiging voor het onderhoud van de fysiologische redox toestand 10. Handhaving van de redox toestand cellen zijn uitgerust met een reeks ontgiftende anti-oxidant moleculen en enzymen. Het superoxide dismutase (SOD), katalase, glutathion peroxidase en Peroxiredoxins wezen vormen de anti-oxidant enzymatische-arsenaal dat cellulaire bescherming biedt tegen pro-oxidatieve soorten, waaronder H 2 O 2, OH en OONO -. 11. Ook anti-oxidant moleculen zoals vitamine C en E, polyfenolen en CoenzymeQ10 (CoQ10) zijn van cruciaal belang voor ROS en de gevaarlijke de lessenderivaten 12,13. Echter, een overmatige productie van ROS en RNS, of disfunctie in de anti-oxidant systeem, verschuift de cellulaire redox-toestand naar oxidatieve stress 14. Naast hun negatieve connotatie, kan ROS verschillende fysiologische rol spelen in de cellen van verschillende oorsprong. Cellen normaal produceren ROS als signaalmoleculen te bemiddelen normale biologische gebeurtenissen zoals afweer en wondheling 15-17. Reactieve species worden gewoonlijk geproduceerd in cellen door intracellulaire enzymen zoals NOx (NADPH oxidase) en XO (xanthine oxidase) in reactie op signalering factoren, groeifactoren, en intracellulaire schommelingen van calcium 18,19. Er werd gemeld dat ROS differentieel kan moduleren de activiteit van belangrijke nucleaire factoren zoals p53 of cellulaire componenten zoals de ATM-kinase, de regulering van de respons op DNA-schade 20. Analoog ROS beïnvloeden sterk cellulaire signalering door te bemiddelen the oxidatie en inactivering van eiwit tyrosine fosfatasen (PTP&#39;s), die zijn gevestigd als kritische regulatoren van signaaltransductie 21. Bovendien proteomics gebaseerde methoden tonen dat RNS ook verantwoordelijk zijn voor specifieke proteïne modificaties en veranderingen van moleculaire signalering. RNS reageren met de cysteine ​​thiolgroepen te wijzigen in S-nitrothiols (SNO) en triggering moleculaire wegen gelijktijdig met pathologische, zoals ontsteking en auto-immuunziekten 22,23. Aangezien celcultuurexperimenten gedeeltelijk reproduceren veelheid van factoren handelen in vivo, is het van groot belang redox studies uitgevoerd in diermodellen 24,25. Hiertoe is de zebravis beschouwd als een geschikte gewervelde diermodel oxidatieve stress dynamiek 26 bestuderen. De zebravis is een nieuw model systeem dat geeft een aantal voordelen om te studeren cellulaire en genetische gebeurtenissen tijdens gewervelde development en ziekte. Grote clusters van embryo&#39;s kunnen worden gegenereerd en wekelijks beschikbaar voor experimentele behoeften. Bovendien is de buitengewone optische helderheid van zebravis embryo&#39;s, evenals hun kleine formaat, kan via een cell imaging en dynamisch volgen in een hele organismen 27. In de afgelopen tien jaar hebben een aanzienlijk aantal zebravismutanten gegenereerd te modelleren van de menselijke pathologische aandoeningen zoals kanker en genetische ziekten 28-31. Het belangrijkste is, is een veelheid van transgene lijnen geproduceerd om uitgebreide mogelijkheden van genetische en biologische manipulaties 32 mogelijk te maken. Zo worden transgene weefselspecifieke zebravislijnen regelmatig gebruikt voor in vivo studies. Deze lijnen drukken een fluorescent eiwit onder de controle van een geselecteerde promoter, die de mogelijkheid om enkele cellen in vivo te identificeren, evenals de anatomische structuur die zij bevatten. Verschillende toxicologische studies hebben reeds gebruikt thij zebravis over het in vivo effect van chemische stoffen op redox homeostase evalueren, suggereert de geschiktheid van deze gewervelde als een diermodel voor het gebied van geneesmiddelen en oxidatieve stress 33-35. Hoewel sommige fluorescerende probes getest om te controleren oxidatieve stress in zebravis larven 36,37, er geen vaste bepalingen om de niveaus van oxidatieve stress in zebravis weefsels en levende cellen te detecteren en te meten. Hier beschrijven we een werkwijze voor in vivo kwantificatie van oxidatieve stress in levende cellen van de zebravis embryo. Imaging gereedschappen, FACS-sortering, fluorescente probes en pro-oxidatieve voorwaarden wordt gecombineerd tot een eenvoudige test voor de detectie en kwantificering van oxidatieve deeltjes in zebravis embryo&#39;s en weefsels genereren.

<table><tbody><tr><td>Hydrogen peroxide solution</td><td>SIGMA</td><td>516813</td><td>BEWAAR GEEN DILUTIES</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution 1x</td><td>GIBCO</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>Methyl cellulose</td><td>SIGMA</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture</td><td>INSTANT OCEAN</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>SIGMA</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Generieke ROS-gevoelige sonde: CellROX Deep Red Reagens</td><td>INVITROGEN</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondria specifieke ROS-gevoelige sonde: MitoSOX&nbsp;</td><td>INVITROGEN</td><td>M36008</td><td>los één glas op met 13 &mu;l van DMSO</td></tr><tr><td>Hydroethidine</td><td>INVITROGEN</td><td>D23107</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>SIGMA</td><td>R8875</td><td>Bereid een 5 mM stamoplossing in DMSO. </td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>SIGMA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine</td><td>EnzoLifeScience</td><td>BML-EI395</td><td>los het poeder op in DMSO; verdun in viswater</td></tr><tr><td>Propidium Iodide&nbsp;</td><td>Molecular probes (Life Technologies)</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>7-aminoactinomycine D (7-AAD)&nbsp;</td><td>Molecular probes (Life Technologies)</td><td>A1310</td><td></td></tr><tr><td>Nrf2a Morpholino</td><td>GeneTools</td><td>5'-CATTTCAATCTCCAT CATGTCTCAG-3'</td><td>Ref: Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al.; 2002 (PMID:12167159)</td></tr><tr><td>Collageenase P</td><td>ROCHE</td><td>11213857001</td><td>Los het poeder op bij 100 mg/ml in steriel HBSS. Bewaar aliquots bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>GIBCO</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>ROCHE</td><td></td><td>Los een tablet op in 1 ml water</td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA (10x), geen fenol rood</td><td>GIBCO</td><td>15400-054</td><td>Bereid 1x werkoplossing voor gebruik</td></tr><tr><td>Compound microscope&nbsp;</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope met fluorescerende verlichting</td><td>Nikon</td><td>AZ100</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>ZEISS</td><td>AxioCamMRm</td><td></td></tr><tr><td>software voor fluorescentie beeld-acquisitie</td><td>ZEISS</td><td>ZEN 2011</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie-geactiveerde celsorteerder</td><td>BD FACSCalibur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes&nbsp;</td><td>BD</td><td>342065</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell Plate&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Gesteriliseerde, niet-behandelde Petri schotels 90 mm</td><td>VWR</td><td>391-1915</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Leica</td><td>Leica SP5</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse van oxidatieve stress in zebravis embryo&#39;s

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Hoge niveaus van reactieve zuurstof species (ROS) kan een verandering van cellulaire redox toestand naar oxidatieve stress situatie veroorzaken. Deze situatie veroorzaakt oxidatie van moleculen (lipiden, DNA, eiwit) en leidt tot celdood. Oxidatieve stress ook invloed op de progressie van verscheidene pathologische aandoeningen zoals diabetes, retinopathieën, neurodegeneratie, en kanker. Derhalve is het belangrijk om instrumenten te definiëren oxidatieve stress condities te bestuderen niet alleen op het niveau van individuele cellen, maar ook in de context van hele organismen. Hier beschouwen we de zebravis embryo als een nuttig in vivo systeem om dergelijke studies uit te voeren en presenteren een protocol om in vivo oxidatieve stress te meten. Profiteren van fluorescerende probes ROS en zebravis transgene fluorescerende lijnen, ontwikkelen we twee verschillende methodes om oxidatieve stress te meten in vivo: i) een &quot;hele embryo ROS-detectiemethode&quot; voor de kwalitatieve meting van oxidatieve stress en ii) een &quot;eencellige ROS detectiemethode &quot;voor kwantitatieve metingen van oxidatieve stress. Hierin tonen we de werkzaamheid van deze procedure door het verhogen oxidatieve stress in weefsels door oxyderende agens en fysiologische of genetische methoden. Dit protocol is vatbaar voor voorwaartse genetische screens en het zal adres oorzaak-gevolg relaties van ROS helpen in diermodellen van oxidatieve stress-gerelateerde ziekten zoals neurologische aandoeningen en kanker.

Door toepassing van de hier beschreven methode, kunnen we gemakkelijk meten en detecteren oxidatieve stress (en ROS levels) in de zebravis embryonale weefsels. Na het oversteken volwassen zebravissen worden eieren verzameld en kunnen ontwikkelen bij 28 ° C tot 72 uur na bevruchting (HPF). Om oxidatieve stress induceren, stellen we twee verschillende benaderingen: 1) de behandeling van embryo&#39;s met sterke pro-oxidant reagentia of 2) het bevorderen van ROS vorming na weefselbeschadiging. I...

Hier rapporteren we een protocol om oxidatieve stress in levende zebravisembryo's te meten. Deze procedure maakt de detectie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) mogelijk in zowel volledige embryoweefsels als enkele-celpopulaties. Dit protocol zal zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyses mogelijk maken.

Analyse van oxidatieve stress in zebravis embryo&#39;s

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om oxidatieve stress in levende zebravisembryo's kwalitatief en kwantitatief te meten. Dit wordt bereikt door een oxidatieve oplossing toe te voegen aan geprepareerde embryo's voor de inductie van oxidatieve stress, of door een wondrand te creëren bij de staartvin van het embryo. De embryo's worden vervolgens verwerkt voor de detectie van oxidatieve stress via een methode voor enkelvoudige cellen of via een whole mount-methode.Vervolgens worden de preparaten geïncubeerd met een Ross-detectieprobe. De resultaten kunnen de hoeveelheid oxidatieve stress en het Ross-niveau aantonen op basis van confocale microscopie van hele mounts of cytofluorimetrische analyse van individuele cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals immunofluorescentie voor markers van oxidatieve stress, is dat het directe detectie in de context van een levend organisme en kwantificering op het niveau van individuele weefsels mogelijk maakt.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het basisonderzoek, zoals het verkennen van oxidatieve stresscondities in de context van een pathologische toestand. Personen die nieuw zijn aan de procedure kunnen hinder ondervinden van onbedoelde weefselschade, aangezien de ruwe, gevoelige moleculaire probes een onvoorziene bron van zuurheid kunnen vormen. Omdat hoge niveaus van oxidatieve stress onvermijdelijk leiden tot celdood, terwijl te lage niveaus moeilijk te detecteren zijn door middel van praktijk en experimenten, zullen deze kwesties zich pas tijdens de uitvoering openbaren. Bij het bereiden van de oplossing voor het induceren van oxidatieve stress in mitochondriën met rot known in DMSO, moet dit worden gemaakt met een rot known-stockoplossing met een concentratie tussen 5 en 50 µM en nooit boven de 100 µM, aangezien rotten known toxisch en gevaarlijk is.Houd rekening met de aangegeven voorzorgsmaatregelen. De sonde-oplossing voor de detectie van het Ross-gat mag tijdens de bereiding niet worden blootgesteld aan licht of zuurstof en moet vers worden bereid voor de Ross-detectiemethode voor enkelcellen. Een stopoplossing van FBS in PBS moet worden bereid en bewaard bij vier graden Celsius.Andere voorbereidingen omvatten het instellen van de incubator voor zebravissen op 28 °C en, voor de methode met enkelvoudige cellen, het koelen van de centrifuge tot 4 °C. Kruisingen van zebravissen, embryo-verzameling en anesthesie worden allemaal uitgevoerd. Verzamel met behulp van standaardmethodiek de gewenste embryo's tussen 48 en 72 uur na bevruchting.Nadat de embryo's zijn geanestheseerd, wordt het anestheticum tweemaal weggespoeld, waarna de embryo's in drie schaaltjes worden geplaatst met maximaal 30 per schaaltje voor rawe detectie van enkelcellen. Verzamel ten minste 35 embryo's per conditie over meerdere schaaltjes. Breng vervolgens 10 milliliters oxidatieve oplossing of een negatieve controle aan.Voeg 10 milliliters water toe en wacht vervolgens 10 tot 60 minuten terwijl de embryo's incuberen bij 28 degrees Celsius. Verwarm daarnaast HBSS voor tot 28 degrees Celsius voor de wasstap. Breng na de incubatie de embryo's over naar een nieuwe schaal met warm HBSS en draai deze voorzichtig rond.Ga vervolgens over tot Ross-detectie via hele mount of individuele cellen. Een meer fysiologische optie is het opwekken van stress na weefselschade door de staartvinverwondingstechniek te gebruiken die is beschreven door NI Tomer en collega's. Breng na de oxidantbehandeling groepen van maximaal 10 embryo's over naar kleine buisjes.Spoel ze grondig af met HBSS en bescherm ze tegen licht met aluminiumfolie. Voeg vervolgens een milliliter ruwe detectieoplossing toe aan elke buis en laat de buizen 15 minuten incuberen bij 28 °C. Bereid een glazen objectglas voor om zowel de controle- als de experimentele conditie te bevatten.Bedek een concave objectglas met 300 µL methylcellulose. Voorkom dat er luchtbellen ontstaan bij het toevoegen van de methylcellulose. Vervang na de incubatie van de embryo's de oplossing in de buisjes snel door twee milliliter HBSS en keer de buisjes meerdere keren om om de embryo's te wassen.Aspireer vervolgens de embryo's in de tip van een micropipet en breng ze voorzichtig over naar het behandelde objectglas. Orienteer de embryo's met een fijne nylondraad en gebruik daarna een fluorescentie- of confocale scanningsmicroscoop voor de analyse. Zorg ervoor dat alle embryo's onder dezelfde instellingen worden geanalyseerd.Breng de embryo's van de HBSS-was over naar een nieuw schaaltje en verwijder zoveel mogelijk van de oplossing. Voer nu handmatig de decoting van de embryo's uit. Dit is strikt noodzakelijk om de embryo's te dissociëren tot enkelvoudige cellen.Verplaats vervolgens de embryo's naar een 24-wells plaat en plaats 15 embryo's in elke well. Vul bij voorkeur drie wells per conditie. Verwijder daarna alle oplossing en vervang deze door 300 µL HBSS, 30 µL collagenase P en 50 µL trypsine-EDTA.Homogeniseer de embryo's met een trituratietechniek met behulp van een pipetteertip van één milliliter. Zodra alle wells zijn voorbereid, wordt de plaat gedurende ten minste 20 minuten bij 28 graden Celsius bewaard, waarbij de monsters elke vijf minuten getritureerd worden om een goede homogenisatie te garanderen. Zet daarnaast enkele microcentrifugebuisjes op ijs om de weefsels te verzamelen zodra deze klaar zijn.Neem na 20 minuten een monster en controleer onder een microscoop of het weefsel is gedisrumpeerd tot een suspensie van enkelvoudige cellen. Zo niet, zet de incubatie voort tot een totale duur van maximaal 30 minuten. Wanneer het weefsel gereed is, wordt de reactie gestopt met een extra 200 microliters stopoplossing.Meng dit met TRI met behulp van een pipetteertip van één milliliter. Draag vervolgens de inhoud van elke put over naar een vooraf gekoelde microcentrifugebuis en bewaar deze buizen op ijs en in het donker. Centrifugeer de monsters daarna bij 250 GS gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.Verwijder vervolgens het supernatant door aspiratie. Resuspendeer de celpellet in ijskoud HBSS door voorzichtig te pipetteren en controleer of de suspensie ten minste 2 miljoen cellen bevat. Resuspendeer de cellen vervolgens in één milliliter van de ruwe sensitieve probe-oplossing.Incubeer ze bij kamertemperatuur en in het donker gedurende ongeveer drie minuten. Pas deze incubatietijd empirisch aan. Draag de cellen vervolgens over naar fax-buisjes die afgeschermd zijn tegen licht.Voer FACS-analyses uit om de transgene marker te detecteren. Fluorescentie en Ross-probe-fluorescentie tijdens uw analyse. Bereken verliesniveaus altijd als voudaverschivingen (fold increases) ten opzichte van controlemonsters om de achtergrondfluorescentie te normaliseren.Alle Mount Ross-detectie werd gebruikt om de ophoping van waterstofperoxide op een wondplaats te onderzoeken. Intacte en beschadigde staarten werden vergeleken na 20 minuten behandeling met een oxidant. In beide condities werd een aspecifiek signaal gedetecteerd.Hetzelfde experiment met een voorbehandeling van de embryo's om de waterstofperoxideniveaus te verlagen. Het gebruik van de OX-remmer VAs 28 70 toonde aan dat de gedetecteerde signalen inderdaad afhankelijk waren van de accumulatie van Ross. Bekende behandelde embryo's werden daarnaast onderzocht via whole mount.Onder hoge vergroting konden anatomische regio's worden geïdentificeerd. Dit resulteerde in Ross, zoals aangegeven door fluorescentietelling van Ross-positieve cellen via fax, wat werd uitgevoerd voor de detectie van Ross op enkelcelniveau. Deze analyse werd uitgevoerd zonder inbegrip van dode cellen. Controle.Ook cellen zonder behandeling werden geanalyseerd. Door deze resultaten te vergelijken, werd de kwantificering van de Ross-accumulatie zeer eenvoudig. De assay blijkt uitstekend geschikt voor het testen van diverse experimentele manipulaties.Zodra deze techniek beheerst is, kan deze in 90 minuten worden uitgevoerd indien dit correct gebeurt. Vergeet niet dat het werken met moleculaire probes extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen vereist zijn. Tijdens het uitvoeren van deze procedure moeten altijd handschoenen worden gedragen.

analysis-of-oxidative-stress-in-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Zebravis een krachtig gewervelde model dat is onder-gebruikt voor metabole studies. Hier beschrijven we een snelle manier om de te...

Metabole Profiel Analyse van zebravis embryo&#39;s

This video demonstrates a highly sensitive immunofluorescence-based assay for detecting PM2.5-induced oxidative damage in the hearts of zebrafish embryos by measuring the levels of 8-OHdG and γH2AX, which indicate DNA damage and double-strand DNA breaks, respectively.

Immunofluorescence Assay to Detect PM2.5-Mediated DNA Damage in Fish Embryos

Bepaalde genetische verstoringen of blootstelling aan toxines kunnen normale ontwikkelingsprocessen verstoren, wat leidt tot de dood van specifieke celtypen. De analyse van geactiveerde Caspase 3 door middel van immunofluorescence in zijn geheel in zebrafish embryo's onthult een stadium- en weefselspecifieke lokalisatie van cellen die specifiek apoptose ondergaan.

Analyse van Apoptose in Zebravis Embryo's door middel van Whole-mount Immunofluorescentie om Geactiveerd Caspase 3 te Detecteren

Zebravissen zijn een belangrijk modelorganisme voor de studie van energiehomeostase. Door gebruik te maken van een NADH2 gevoelige redoxindicator, alamar Blue, hebben we een test ontwikkeld die de metabole snelheid van zebravislarven meet in een 96-well plate formaat en kan worden toegepast op medicijn- of genontdekking.

High Throughput<em&gt; Danio Rerio</em&gt; Energie Uitgaven Assay

Blootstelling aan teratogens kan geboorteafwijkingen veroorzaken. Zebravis zijn nuttig voor het bepalen van het teratogeen potentieel van chemicaliën. We demonstreren het nut van zebravis embryo's door blootstelling aan verschillende niveaus van nitriet en ook op verschillende tijden van blootstelling. We tonen aan dat nitriet giftig zijn en ernstige ontwikkelingsstoornissen.

Zebravis als een model om de teratogene potentie van nitriet Assess

Zebravis embryo's worden gebruikt voor het evalueren van de toxiciteit van chemische verbindingen. Ze ontwikkelen zich extern en zijn gevoelig voor chemicaliën, waardoor subtiele fenotypische veranderingen kunnen worden opgespoord. Het experiment vereist slechts een kleine hoeveelheid stof, die direct wordt toegevoegd aan de plaat die embryo's bevat, waardoor het testsysteem efficiënt en kosteneffectief is.

Snelle evaluatie van de toxiciteit van chemische verbindingen met behulp van zebravis embryo's

Dit protocol maakt gebruik van een immunofluorescentietest om PM2,5-geïnduceerdeDNA-schade in de ontlede harten van zebravisembryo's te detecteren.

Immunofluorescentie gebruiken om PM2.5-geïnduceerdeDNA-schade in zebravisembryoharten te detecteren

De zebravis is onlangs gebruikt als model om potentiële stralingsmodificatoren te valideren. Het huidige protocol beschrijft de gedetailleerde stappen om zebravisembryo's te gebruiken voor op straling gebaseerde screeningsexperimenten en enkele observationele benaderingen om het effect van verschillende behandelingen en bestraling te evalueren.

Zebravislarven als model om potentiële radiosensibilisatoren of beschermers te evalueren

Dit protocol beschrijft een screeningprocedure voor geneesmiddelen bij zebravislarven 3-7 dagen na de bevruchting, gevolgd door morfologische beoordeling.

Screening van kleine moleculen en toxiciteitstesten bij zebravislarven in een vroeg stadium

RASopathieën zijn multisysteem-genetische syndromen die worden veroorzaakt door hyperactivering van de RAS-MAPK-route. Potentieel pathogene varianten die wachten op validatie duiken continu op, terwijl slecht preklinisch bewijs de therapie beperkt. Hier beschrijven we ons in vivo protocol voor het testen en kruisvalideren van RASopathie-geassocieerde ERK-activeringsniveaus en de farmacologische modulatie ervan tijdens de embryogenese door middel van live FRET-beeldvorming in Teen-reporter...

Een efficiënt protocol om ERK-activiteitsmodulatie te beoordelen in vroege zebravismodellen van het Noonan-syndroom via live FRET-microscopie en immunofluorescentie

Dit protocol beschrijft een goedkope lichtmicroscopiemethode om de cardiale morfologie en functie in zebravisembryo's te beoordelen, waardoor een reproduceerbare evaluatie van ontwikkelingscardiotoxiciteit mogelijk is zonder dat er geavanceerde beeldvormingssystemen nodig zijn.

Functionele cardiale beeldvorming in zebravisembryo's met behulp van standaardmicroscopie en videoanalyse: toepassingen in milieu- en biomedisch onderzoek

Leer oxidatieve stress meten in levende zebravisembryo's met behulp van confocale microscopie en cytofluorometrische analyse. Deze methode maakt kwalitatieve en kwantitatieve detectie van reactieve zuurstofsoorten mogelijk.

Analyse van oxidatieve stress in zebravis embryo's

Meer video's verkennen