Name: Harmonische Nanodeeltjes voor Regeneratieve Onderzoek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-01T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Leer hoe je harmonische nanodeeltjes gebruikt voor het labelen van humane embryonale stamcellen en het monitoren van cardiale contracties via multi-fotonmicroscopie. Deze methode biedt diepe weefselpenetratie en stabiele beeldvorming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag de gedeeltelijke financiering van de Europese FP7 Research Project NAMDIATREAM (NMP4-LA-2010-246479, http://www.namdiatream.eu) en het INTERREG IV France-Zwitserland NAOMI project erkennen.

1. Cultuur en uitbreiding van Human ESC <ol><li> Bereid de cel propagatiemedium (zogenaamde PM) bevattende Knockout DMEM gesupplementeerd met 20% Knockout Serum, 1% MEM niet-essentiële aminozuren, 1% L-glutamine 200 mM, 1% penicilline-streptomycine, en 3,5 pl β-mercaptoethanol. </li><li> Ontdooi menselijke ESC (hESC) in 8 ml PM medium en centrifugeer ze 5 min bij 115 xg to-DMSO aangevuld bevriezing medium weggooien. </li><li> Voeg 1 ml PM medium dat 10 mM Rock remmer apoptose te voorkomen en te verbeteren cel overleving na ontdooien (alleen 24 uur incubatie). </li><li> Voeg basische fibroblastgroeifactor (bFGF) aan de PM in de gewenste concentratie (4-10 ng / ml) voor het onderhoud van pluripotentie. </li><li> Plate de hESC van bestraalde humane voorhuid feeder-cellen (γHFF) (figuur 1A), eerder uitgeplaat bij een concentratie van 2 x 10 4 cellen / cm 2. </li><li> Medium dagelijks veranderen en, indien nodig, te verwijderen gedeelten van colonies beginnen te differentiëren door aspiratie met behulp van een langgerekte scherp gesneden Pasteur pipet. </li><li> Een keer per week, passage kolonies enzymatisch: <ol><li> Verwijder medium en was kolonies met 2 ml PBS. </li><li> Verwijder PBS en incubeer ze met 0,5 ml per putje van warme collagenase IV bij 1 mg / ml gedurende 10 min bij 37 ° C, 5% CO2. </li><li> Verzamel kolonie fragmenten in 2 ml nieuwe PM en centrifugeer bij 115 xg gedurende 3 minuten. </li></ol></li><li> Als alternatief kan kolonies mechanisch worden gepasseerd door schrapen: <ol><li> Verwijder medium en was kolonies met 2 ml PBS. </li><li> Handmatig schrapen kolonies met behulp van de StemPro EZPassage roller schraper (Figuur 1B). </li><li> Verzamel kolonie fragmenten en centrifugeer vervolgens gedurende 3 minuten bij 115 xg om de supernatant te verwijderen. </li><li> Plaat fragmenten op γHFF of verwerken voor differentiatie in embryoid lichamen (EBS). </li></ol></li></ol> 2. Menselijke ESC DifferentiatieProtocol <ol><li> Bereid het differentiatiemedium (DM) met Knockout DMEM gesupplementeerd met 2% Hyclone serum, 1,0% MEM niet-essentiële aminozuren, 1,0% L-glutamine 200 mM, 1% penicilline-streptomycine, 3,5 pi β-mercaptoethanol. </li><li> Verwijder medium en was kolonies met 2 ml PBS. </li><li> EB vorming van kolonie fragmenten in suspensie: <ol><li> Verwijder PBS en incubeer ze met 0,5 ml per putje van warme collagenase IV bij 1 mg / ml gedurende 10 min bij 37 ° C, 5% CO2. </li><li> Verzamel kolonie fragmenten in 2 ml nieuwe DM en centrifugeer bij 115 xg gedurende 3 minuten. </li><li> Cultuur hen in suspensie in ultra-low attachment 6-well platen (2 ml per putje) voor 4 dagen (figuur 1C). </li><li> Verzamelen en plaat het nieuw gevormde EBS 0,1% gelatine beklede platen met 24 putjes (ongeveer 3 EBS / putje) (Figuur 1D). </li></ol></li><li> Alternatief gedwongen samenvoeging van enkele cellen in EBS via de Aggrewell plaat: <ol><li> Verwijder PBS endistantiëren kolonies in afzonderlijke cellen met behulp Accutase (0,5 ml / putje). </li><li> Centrifuge en resuspendeer cellen in DM bij 1,2 x 10 6 / ml. </li><li> Voeg 2 ml per Aggrewell kamer voor 1 dag (Figuur 1B). </li><li> Verzamel nieuw gevormde EBS (figuur 1C) en plaat ze op 0,1% gelatine beklede platen met 24 putjes (ongeveer 3 EBS / putje). </li><li> Wijzig DM om de 2-3 dagen tot de verschijning van het verslaan van clusters van hartspiercellen (15-30 dagen). </li></ol></li></ol> 3. Air-vloeibare 3D Culturen van Beating Clusters en Labeling met HNPs <ol><li> Identificeren en handmatig ontleden clusters van het verslaan van hartspiercellen (figuur 1D), normaal verschijnen na 2-4 weken van de cultuur, met behulp van een langgerekte scherp gesneden Pasteur pipet. </li><li> Borg 4 PTFE filters per inzetstuk dat op een 6-well plaat (Figuur 1F) zal worden geplaatst. </li><li> Voeg 1 ml van DM medium bovenop each goed. </li><li> Voeg een ontleed slaan cluster op elke PTFE-filter (figuur 1E), maximale 4/well, dwz 24 aggregaten per plaat (Figuur 1F &#39;). </li><li> Wijzig DM medium om de 2-3 dagen. </li><li> Om de clusters te labelen, verwijder de PTFE-filter met het kloppende cluster en zet het op 3,5 cm glazen bodem schaal (170 micrometer dik). </li><li> Voeg 1 ml HNP bij een concentratie van 50 ug / ml gedurende 30 minuten. </li></ol> 4. Niet-lineaire optische beeldvorming <ol><li> Voorbereiding van het monster. Na HNP etikettering (zie Stap 3.6), over te dragen ofwel geheel differentiëren vroeg HeBS of cardiale kloppend clusters (ontleed bij samentrekking uiterlijk) op PTFE filters over een 170 um dikke glazen bodem schaal compatibel met de werkafstand van hoge numerieke apertuur doelstellingen. Ook verzoeken een direct coating van het verslaan van clusters op de glazen bodem schaal pre-gecoat met 0,1% gelatine. </li><li> Doorvoermonsters eenalles-in-een microscoop uitgerust met incubatie kamer zorgen voor stabiele temperatuur, luchtvochtigheid en CO2 controle over langere tijd. </li><li> Na de eerste inspectie, het imago van de steekproef via wide-field imaging onder wit licht verlichting aan structuren van belang in gedifferentieerde EBs of actieve kloppend clusters die zullen worden geselecteerd voor verder onderzoek vast te stellen. </li><li> Als cel autofluorescentie van NADH en SH van HNPs moeten gelijktijdig worden verkregen, stelt een kortere laser excitatie golflengte (bijvoorbeeld 720 nm) de moleculaire absorptie passen. Gebruik een smalle banddoorlaat-spectraal filter gecentreerd op de helft van de golflengte (dat wil zeggen, λ = 360 ± 10 nm) te detecteren SH, en een andere om autofluorescentie detecteren. </li><li> Ten eerste het uitvoeren van een snelle, lage resolutie, drie-dimensionale scan naar de algemene morfologie van de cardiale cluster herbouwen en selecteer een beeldvlak binnen het cluster volume met diverse zichtbare HNPs. </li><li> Wijzig indien nodig de excitatie golflengte vrij het ​​beste overeenkomen met het monster optische eigenschappen of photobleaching, foto schade en op de foto te voorkomen dieper in weefsels met een IR golflengte (dwz, 790 nm) en vervang de tweede harmonische filter dienovereenkomstig (dat wil zeggen, 395 nm ). Optimaliseer de instellingen van de laserpuls pre-compressor bij de werkende golflengte van keuze door het maximaliseren van de tweede harmonische signaal HNPs afgezet op het monster. </li><li> Om toezicht te houden in real time de cardiale cluster weeën, stel de microscoop optische scanner in de snelste modus, zoals resonantiemodus, waardoor hoge snelheid overname van twee-dimensionale beelden. </li><li> Kies de instellingen als beste compromis tussen beeldcontrast en acquisitie snelheid, zoals: <ul type="disc"><li> Scan middeling: 4 </li><li> Pixelverblijftijd: 0,1 msec </li><li> Afbeelding tarief: 3,75 frames per seconde (fps) </li></ul></li><li> Laservermogen wordt aangepast aan brandpunt size en scansnelheid. 50 mW (gemeten bij de ingang van de doelstelling) is een typische waarde voor 0,1 usee pixelverblijftijd en Plan APO 20X NA 0.75 doel het behoud van levensvatbaarheid van de cellen. </li></ol> 5. Beeldanalyse <ol><li> Axiale kalibratie procedure. Selecteer een HNP afgezet op een kale ondergrond. Pas de scherpstelling (dwz de axiale positie van de nanodeeltjes) voor het maximaliseren van de SH intensiteit. Verschillen op gecontroleerde wijze de axiale positie van de microscooptafel afgelezen betreffende SH intensiteit als een functie van de HNP verkrijgen opzichte van het brandpuntsvlak. De uitgang van deze kalibratieprocedure voor de plan APO 20X NA 0,75 doel wordt gerapporteerd in Figuur 4C. </li><li> Selecteer HNPs aanwezig in alle video frames en bepalen hun periodieke bewegingen. Deze procedure kan gemakkelijk worden geautomatiseerd, bijvoorbeeld door aangepaste code die maximale signaalintensiteit plekken in een bepaald gebied van belang enze te verbinden tussen verschillende frames (een voorbeeld code geschreven in Matlab R2009 b met behulp van de functie &#39;regio props&#39; van de Beeldverwerking Toolbox wordt gepresenteerd). </li><li> Beoordelen van de kwantificering van de out-of-plane verplaatsingen, in verband met niet-continu traceerbaar HNPs verplaatsen langs de optische as, door het omzetten van hun intensiteit modulaties over verschillende frames in axiale verplaatsing met behulp van de ijklijn bij stap 5.1 vastgesteld. Merk op dat deze procedure geeft toegang tot axiale bewegingen, maar kan niet worden gebruikt om de absolute richting (naar boven of naar beneden) te bepalen. </li></ol>

<ol><li>Bonacina, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+Fe%28IO3%293+nanocrystals+as+local+probes+for+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+B-Lasers+and+Optics%22%5BJournal%5D)">Polar Fe(IO3)3 nanocrystals as local probes for nonlinear microscopy.</a> Applied Physics B-Lasers and Optics. 87, 399-403 (2007).</li>
<li>Nakayama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+nanowire+nonlinear+optical+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tunable nanowire nonlinear optical probe.</a> Nature. 447, 1098-1101 (2007).</li>
<li>Aufray, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Synthesis+of+Nanosized+Niobium+Oxides+and+Lithium+Niobate+Particles+and+Their+Characterization+by+XPS+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanosci+Nanotechno%22%5BJournal%5D)">New Synthesis of Nanosized Niobium Oxides and Lithium Niobate Particles and Their Characterization by XPS Analysis.</a> J Nanosci Nanotechno. 9, 4780-4785 (2009).</li>
<li>Hsieh, C. L., Grange, R., Pu, Y., Psaltis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+harmonic+holographic+microcopy+using+nanoparticles+as+probes+for+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional harmonic holographic microcopy using nanoparticles as probes for cell imaging.</a> Opt Express. 17, 2880-2891 (2009).</li>
<li>Pantazis, P., Maloney, J., Wu, D., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+harmonic+generating+%28SHG%29+nanoprobes+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Second harmonic generating (SHG) nanoprobes for in vivo imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14535-14540 (2010).</li>
<li>Baumner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evanescent-field-induced+second+harmonic+generation+by+noncentrosymmetric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Evanescent-field-induced second harmonic generation by noncentrosymmetric nanoparticles.</a> Opt Express. 18, 23218-23225 (2010).</li>
<li>Le Xuan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photostable+second-harmonic+generation+from+a+single+KTiOPO4+nanocrystal+for+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Photostable second-harmonic generation from a single KTiOPO4 nanocrystal for nonlinear microscopy.</a> Small. 4, 1332-1336 (2008).</li>
<li>Sandeau, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defocused+imaging+of+second+harmonic+generation+from+a+single+nanocrystal%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Defocused imaging of second harmonic generation from a single nanocrystal.</a> Opt Express. 15, 16051-16060 (2007).</li>
<li>Johnson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-field+imaging+of+nonlinear+optical+mixing+in+single+zinc+oxide+nanowires%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Near-field imaging of nonlinear optical mixing in single zinc oxide nanowires.</a> Nano Lett. 2, 279-283 (2002).</li>
<li>Kachynski, A. V., Kuzmin, A. N., Nyk, M., Roy, I., Prasad, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+oxide+nanocrystals+for+nonresonant+nonlinear+optical+microscopy+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+C%22%5BJournal%5D)">Zinc oxide nanocrystals for nonresonant nonlinear optical microscopy in biology and medicine.</a> J Phys Chem C. 112, 10721-10724 (2008).</li>
<li>Bonacina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+Nanomedecine%3A+Harmonic+Nanoparticles+toward+Targeted+Diagnosis+and+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmaceut%22%5BJournal%5D)">Nonlinear Nanomedecine: Harmonic Nanoparticles toward Targeted Diagnosis and Therapy.</a> Mol Pharmaceut. 10, 783-792 (2013).</li>
<li>Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHG+nanoprobes%3A+advancing+harmonic+imaging+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">SHG nanoprobes: advancing harmonic imaging in biology.</a> Bioessays. 34, 351-360 (2012).</li>
<li>Campagnola, P. J., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-harmonic+imaging+microscopy+for+visualizing+biomolecular+arrays+in+cells%2C+tissues+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms.</a> Nat Biotechnol. 21, 1356-1360 (2003).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Photon+Laser+Scanning+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">2-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li>
<li>Magouroux, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Speed+Tracking+of+Murine+Cardiac+Stem+Cells+by+Harmonic+Nanodoublers%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">High-Speed Tracking of Murine Cardiac Stem Cells by Harmonic Nanodoublers.</a> Small. 8, 2752-2756 (2012).</li>
<li>Staedler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harmonic+Nanocrystals+for+Biolabeling%3A+A+Survey+of+Optical+Properties+and+Biocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Nano%22%5BJournal%5D)">Harmonic Nanocrystals for Biolabeling: A Survey of Optical Properties and Biocompatibility.</a> Acs Nano. 6, 2542-2549 (2012).</li>
<li>Extermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodoublers+as+deep+imaging+markers+for+multi-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Nanodoublers as deep imaging markers for multi-photon microscopy.</a> Optics Express. 17, 15342-15349 (2009).</li>
<li>Chen, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength+dependent+damage+in+biological+multi-photon+confocal+microscopy%3A+A+micro-spectroscopic+comparison+between+femtosecond+Ti+%3A+sapphire+and+Cr+%3A+forsterite+laser+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Quantum+Electron%22%5BJournal%5D)">Wavelength dependent damage in biological multi-photon confocal microscopy: A micro-spectroscopic comparison between femtosecond Ti : sapphire and Cr : forsterite laser sources.</a> Opt. Quantum Electron. 34, 1251-1266 (2002).</li>
<li>Ferreira, L., Karp, J. M., Nobre, L., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+opportunities%3A+The+use+of+Nanotechnologies+to+manipulate+and+track+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">New opportunities: The use of Nanotechnologies to manipulate and track stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 136-146 (2008).</li>
<li>Kaur, S., Singhal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+nano+meets+stem%3A+The+impact+of+nanotechnology+in+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">When nano meets stem: The impact of nanotechnology in stem cell biology.</a> J Biosci Bioeng. 113, 1-4 (2012).</li>
<li>Hong, H., Yang, Y. N., Zhang, Y., Cai, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Invasive+Imaging+of+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Biotechno%22%5BJournal%5D)">Non-Invasive Imaging of Human Embryonic Stem Cells.</a> Curr Pharm Biotechno. 11, 685-692 (2010).</li>
<li>Tumbar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+epithelial+stem+cell+niche+in+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Defining the epithelial stem cell niche in skin.</a> Science. 303, 359-363 (2004).</li>
<li>Shah, B. S., Clark, P. A., Moioli, E. K., Stroscio, M. A., Mao, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+mesenchymal+stem+cells+by+bioconjugated+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Labeling of mesenchymal stem cells by bioconjugated quantum dots.</a> Nano Lett. 7, 3071-3079 (2007).</li>
<li>Zimmer, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+series+of+small+indium+arsenide-zinc+selenide+core-shell+nanocrystals+and+their+application+to+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Size series of small indium arsenide-zinc selenide core-shell nanocrystals and their application to in vivo imaging.</a> J Am Chem Soc. 128, 2526-2527 (2006).</li>
<li>Vallee, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-based+cardiopatches+improve+cardiac+function+in+infarcted+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-based cardiopatches improve cardiac function in infarcted rats.</a> Stem Cells Transl Med. 1, 248-260 (2012).</li>
<li>Idris, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+transplanted+cells+in+live+animal+using+upconversion+fluorescent+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tracking transplanted cells in live animal using upconversion fluorescent nanoparticles.</a> Biomaterials. 30, 5104-5113 (2009).</li>
<li>Haase, M., Schafer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upconverting+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Upconverting nanoparticles.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 50, 5808-5829 (2011).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+Upconversion+Nanoparticles+for+Dual-Modal+Imaging-Guided+Stem+Cell+Therapy+under+Remote+Magnetic+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Multifunctional Upconversion Nanoparticles for Dual-Modal Imaging-Guided Stem Cell Therapy under Remote Magnetic Control.</a> Adv Funct Mater. 23, 272-280 (2013).</li>
<li>Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+response+to+near-infrared+femtosecond+laser+pulses+in+two-photon+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two-photon microscopes.</a> Optics Letters. 22, 135-136 (1997).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De toepassing van nanotechnologie tot stamcelonderzoek is een relatief nieuwe, maar snel groeiende sector. Zoals door diverse overzichtsartikelen over dit onderwerp, kan het gebruik van nanodeeltjes worden toegepast om verschillende taken uit te voeren onderzoek, van cel volgen (zowel in vitro als in vivo), intracellulaire afgifte van eiwitten en genen, ook de creatie van biomimetic cellulaire omgevingen voor preferentiële stimulatie / inhibitie van specifieke differentiatie signaalwegen 19,20. De in...

Lineaire microscopie systemen dankzij hun inherente driedimensionale snijden capaciteiten steeds geleid vraag naar foto-stabiele fluoroforen met twee-foton absorptiebanden in het nabij-infrarood. Pas in de laatste paar jaar, om de ontwikkeling van fluorescentie gebaseerde labels (kleurstoffen, quantum dots, up-converterende nanodeeltjes), een andere beeldvorming methodiek is het benutten van het gebruik van een nieuwe familie van intrinsiek niet-lineaire nanodeeltjes als labels, dwz vullen harmonische nanodeeltjes (HNPs) die speciaal zijn ontwikkeld voor multi-foton microscopie. Deze labels, op basis van anorganische noncentrosymmetric kristallen, oefenen optisch contrast genereren van de SH van de excitatie frequentie: bijvoorbeeld door het omzetten van een fractie van nabij infrarood gepulste excitatie licht (λ = 800 nm) in zichtbaar blauw licht (λ / 2 = 400 nm) . Verschillende auteurs in het recente verleden hebben verschillende materialen getest, waaronder ijzer iodaat Fe (IO <sub&gt; 3) 3 1, kalium niobaat (KNbO 3) 2, lithiumniobaat (LiNbO3) 3, bariumtitanaat (BaTiO 3) 4,5, kalium titanyl fosfaat (KTiOPO4, KTP) 6-8, en zinkoxide (ZnO ) 5,9,10. Vergeleken met fluorescerende probes, HNPs bezit een aantal aantrekkelijke eigenschappen, zoals volledige afwezigheid van bleken en knippert, smalle emissiebanden, excitatie-golflengte tunability (van ultraviolet tot infrarood), oriëntatie ophaalmogelijkheden en coherente optische respons. Deze unieke eigenschappen zijn onlangs uitgelegd in twee uitgebreide evaluatie papers 11,12. De mogelijkheid om te werken in het infrarode gebied van het spectrum, die beeldvorming diepte toeneemt door het minimaliseren van verstrooiing en absorptie, ook drastisch beperkt sample foto degradatie 13,14. Bovendien, de oneindig foto-stabiel signaal gegarandeerd door HNPs maakt ze ideaal probes voor de lange termijn cell tracking, die ikis bijzonder aantrekkelijk voor regeneratieve geneeskunde toepassingen 15. In dit gevisualiseerd experiment worden protocol gegevens voor het in vitro merken van menselijke embryonale stamcellen (hESC) met ongefunctionaliseerde HNPs. De synthese en bereiding van colloïdale suspensies wordt beschreven in een eerdere publicatie en referenties daarin 16 en valt buiten het bestek van dit werk. Methodologieën voor hESC onderzoek door multi-foton microscopie en hun differentiatie in de hartspier clusters (gehandhaafd als lange termijn culturen lucht-vloeistof) worden gepresenteerd. Menselijke ESC kan laten differentiëren in zogenaamde embryoid organen (EBS) op twee manieren, hetzij door EB vorming van kolonie fragmenten in suspensie of anders gedwongen aggregatie van individuele cellen in EBS met de Aggrewell plaat, zie figuur 1A . kweken slaan clusters van hartcellen op polytetrafluorethyleen (PTFE) poreuze filters facilitates hun behoud op lange termijn voor verdere studies (bijvoorbeeld elektrofysiologische metingen van actiepotentialen). De excitatie bron van de scanning microscoop moet kunnen ultrakorte pulsen (met een pulsduur kleiner dan 300 FSEC in het monster) om het piekvermogen nodig zijn tweede harmonische beeldvorming van HNPs voeren bereiken. Bijvoorbeeld, de meest voorkomende FSEC-bron gebruikt voor de beeldvorming zijn afstembare Ti: saffier lasers. Als alternatief kunnen andere ultrasnelle lasers worden gebruikt, bijvoorbeeld erbium ionen 17, chroom forsteriet 18 of Ti: saffier gepompt infrarood optische parametrische oscillatoren. De microscoop kan worden uitgerust met een objectief met bij voorkeur een vrij hoge numerieke apertuur. Heel belangrijk, voorafgaand aan de metingen, en elke keer dat de doelstelling wordt vervangen, is het verplicht om de huidige spreiding in de set-up (lenzen) te minimaliseren door het optimaliseren van de instellingen van de laserpuls pre-compressor op de werkplekgolflengte van keuze. Deze procedure, beschreven in het protocol, zodat de laserpuls zo dicht mogelijk bij de transformatie beperkte duur (bijvoorbeeld kort mogelijk) en het brandvlak en maximaliseert het monster lineaire respons. Het doel van de beeldanalyse beschreven aan het einde van het protocol is het identificeren en te volgen in 3D HNPs bewegingen in verband met de ritmische samentrekkingen van het verslaan van cardiale clusters. Het bijhouden van nanodeeltjes in het beeldvlak wordt eenvoudig gerealiseerd door het identificeren van hun posities in opeenvolgende filmbeelden. Om informatie over axiale beweging extract, een voorafgaande ijking van de lineaire respons intensiteit als functie van de axiale verplaatsing is verplicht. Merk op dat voor langdurige metingen actief interferometrische controle monster axiale positie is vereist om de geldigheid van de ijkcurve in aanwezigheid van thermische en / of mechanische afwijkingen handhaven. De HNPs hier gebruikt om trace verslaan cellen in aggregaten zijn gebaseerd op kalium Niobate oxide (KNbO 3), maar andere beschikbare niet-lineaire nanomaterialen worden beoordeeld in detail beschreven in het werk van Staedler et al. 16. De lineaire optische efficiëntie van de tot nu toe onderzochte nanomaterialen zijn zeer vergelijkbaar. De keuze voor KNbO 3 werd hoofdzakelijk ingegeven door de goede stabiliteit van de colloïdale oplossing en de goede biocompatibiliteit, getest op verschillende humane cellijnen, zelfs bij vrij hoge concentratie en lange expositie tijden 16. Gezien de nieuwheid van het nanomateriaal ingezet voor dit werk worden de belangrijkste kenmerken van HNPs in vergelijking met TL / lichtgevende bio-markers weergegeven in een korte oorspronkelijke computer video-animatie gerealiseerd door de auteurs.

<table><tbody><tr><td>Microscope Incubator</td><td>OKO LAB</td><td>UNO package (top stage)</td><td>37 &deg;C, 5% CO2, bevochtigd</td></tr><tr><td>Multifotonenmicroscoop</td><td>Nikon</td><td>AR1-MP</td><td></td></tr><tr><td>Snelle scan, vier niet-fotomultiplier gescande detectoren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filters SHG en autofluorescentie</td><td>Semrock</td><td>FF01-360/12-25</td><td></td></tr><tr><td>FF01-395/11-25&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FF02-485/20-25</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscoopobjectieven</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Fluor 10X</td><td></td><td></td><td>NA 0.30, WD 16 mm</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo 20X</td><td></td><td></td><td>NA 0.75, WD 1.0 mm, VC</td></tr><tr><td>CFI Apo 40X</td><td></td><td></td><td>NA 1.25, WD 0.18 mm &lambda;S, Nano-Crystal Coat</td></tr><tr><td>Rhock-remmer&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Y-27632</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>1140</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine 200 mM&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Collageenase IV&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Roller scraper tool&nbsp;</td><td>StemPro EZPassage, Invitrogen</td><td>23181-010</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>S11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell systeem&nbsp;</td><td>StemCell Technologies</td><td>27845</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone serum&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>6-wells platen&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>24-wells platen&nbsp;</td><td>Nunclon</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Polytetrafluorethyleen (PTFE) filters</td><td>Millipore</td><td>NA76/25</td><td></td></tr><tr><td>Inserts</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr></tbody></table>

harmonische nanodeeltjes voor regeneratieve onderzoek

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

In dit gevisualiseerd experiment worden protocol gegevens voor het in vitro merken van menselijke embryonale stamcellen (hESC) met tweede harmonische generatie nanodeeltjes (HNPs). De laatste is een nieuwe familie van probes onlangs voor het labelen van biologische monsters voor multi-foton beeldvorming. HNPs kunnen verdubbelen van de frequentie van excitatielicht door lineaire optische proces van tweede harmonische generatie zonder beperking van de excitatiegolflengte. Multi-foton gebaseerde methodieken voor hESC differentiatie in de hartspier clusters (gehandhaafd als lange termijn culturen lucht-vloeistof) worden gepresenteerd in detail. In het bijzonder is het bewijs over hoe de intense tweede harmonische (SH) emissie van geïsoleerde HNPs tijdens 3D-monitoren van hartweefsel verslagen in 3D te maximaliseren getoond. De analyse van de beelden om 3D verplaatsing patronen ophalen eveneens wordt.

Voorafgaand aan beoordeling van het kloppende activiteit door confocale beeldvorming, een nauwkeurige karakterisering van de niet-lineaire optische respons van het PTFE filters werd uitgevoerd, alleen of in aanwezigheid van HNPs bij hoge concentraties (1 mg / ml). Er werd voor gezorgd dat: i) kaal metaal twee-foton aangeslagen fluorescentie is zeer zwak en kan niet voorkomen meting van de relevante biologische monsters, en ii) de SH emissie van geïsoleerde HNPs kan eenvoudig worden verkregen door beeldvorming door het s...

Protocol details worden verstrekt voor het in vitro merken menselijke embryonale stamcellen met tweede harmonischen genereren nanodeeltjes. Methodologieën voor hESC onderzoek door multi-foton microscopie en hun differentiatie in de hartspier clusters worden ook gepresenteerd.

Harmonische Nanodeeltjes voor Regeneratieve Onderzoek

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Het algemene doel van het volgende experiment is de in vitro monitoring van kloppende cardiac clusters afgeleid van menselijke embryonale stamcellen in 3D real-time en met een hoge ruimtelijke resolutie. Dit wordt bereikt door eerst embryonale stamcellen te kweken en te expanderen totdat ze embryonale lichaampjes vormen. Vervolgens worden de kloppende clusters gedisseceerd en geplaatst op POLYTETRAFLUOROETHYLEEN of PTFE poreuze filters, waardoor ze op de lange termijn aan de lucht kunnen worden gehouden.Vloeibare culturen met kloppende clusters worden vervolgens gelabeld met harmonische nanodeeltjes om realtime multifotonmicroscopie uit te voeren. De verkregen resultaten maken de analyse mogelijk van de ruimtelijke elongatie en de frequentie van cardiale contracties op microscopische schaal. Het belangrijkste voordeel van deze nanodeeltjes is dat elke golflengte gebruikt kan worden, in het bijzonder infrarood, waardoor men dieper in het weefsel kan doordringen, en dat ze bovendien zeer stabiel zijn over een langere periode.Zo kunnen we onze langdurige processen over langere tijdsperioden monitoren. Deze methode voor stamcelcultuur kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen op het gebied van de functionele contractie van cardiomyocyten in drie dimensies. In het bijzonder met betrekking tot cardiale rijping en tissue engineering.Personen die deze nieuwe ziektemethode toepassen, moeten er rekening mee houden dat de labelingsprocedure met harmonische nanodeeltjes uitsluitend kan worden gebruikt voor multifotonmicroscopie en niet kan worden overgezet naar andere soorten beeldvormingssystemen. We kregen in 2005 voor het eerst het idee om harmonische nanodeeltjes te gebruiken. Deze nanodeeltjes bieden voordelen ten opzichte van fluorescerende kleurstoffen en quantum dots.In feite vervaagt hun signaal in de loop van de tijd niet, waardoor ze kunnen worden gebruikt om ontwikkelende monsters over lange perioden te monitoren. Een visuele demonstratie van de monstervoorbereiding is cruciaal voor de efficiëntie en de reproduceerbaarheid van de verschillende stappen, in het bijzonder bij het uitvoeren van drugstesten, en zou ook kunnen worden toegepast op verschillende weefsels of ziekten. Weefselmodellering.Nadat de menselijke embryonale stamcellen of ESC's zijn gekweekt en uitgebreid volgens het tekstprotocol en zijn geïncubeerd met warme collagenase, four gedurende 10 minuten, worden de koloniefragmenten verzameld in twee milliliters vers differentiatiemedium of DM en gecentrifugeerd bij 115 ×g gedurende drie minuten. Kweek de koloniefragmenten in suspensie in ultra-low attachment six-well platen gedurende vier dagen om de vorming van embryoïde lichaampjes of ebs mogelijk te maken.Planteer vervolgens de nieuw gevormde EBS op met 0,1% gelatine gecoate 24-well platen voor 15 tot 30 dagen tot de verschijning van kloppende clusters. Verwijder de PBS en dissocieer de kolonies met behulp van acutus tot enkelvoudige cellen na centrifugatie en resuspensie; suspendeer de cellen in DM-medium, plateer twee milliliter per well-kamer en incubeer gedurende één dag bij 37 °C.Verzamel de nieuw gevormde EBS en zaai er na twee tot vier weken in cultuur drie per putje uit op 24-wells platen die zijn gecoat met 0,1% gelatine. Identificeer clusters van kloppende cardiomyocyten en disseceer deze handmatig met een verlengde, scherp afgesneden pasteurpipet. Plaats vier PTFE-filters per insert en plaats elke insert in een putje van een 6-wells plaat.Nadat er één milliliter DM aan elk is toegevoegd, wordt één gedissecteerde kloppende cluster op elk PTFE-filter geplaatst. Om de clusters te labelen, worden de PTFE-filters met de kloppende clusters overgebracht naar een glazen bodemschaal van 3,5 centimeter. Voeg één milliliter second harmonic generation-nanodeeltjes toe in een concentratie van 50 µg/mL en incubeer dit gedurende 30 minuten bij 37 °C om niet-lineaire optische beeldvorming uit te voeren.Na het overbrengen van gelabelde HEB's of kloppende cardiale clusters naar een beeldkamer, wordt wide-field imaging onder witte lichtverlichting gebruikt om structuren van belang binnen gedifferentieerde EBS of actieve kloppende clusters te identificeren. Voer een snelle driedimensionale scan met lage resolutie uit om de algemene morfologie van het cardiale cluster te reconstrueren en selecteer een beeldvlak binnen het clustervolume met meerdere zichtbare second harmonic generation-nanodeeltjes om deze in real-time te monitoren. De contracties van het cardiale cluster bepalen de instelling van de optische scanner van de microscoop op de snelste modus, waardoor acquisitie van tweedimensionale beelden met meerdere hertz mogelijk is.Analyseer de beelden met de MATLAB-software volgens het tekstprotocol zoals hier gedemonstreerd alvorens de slagactiviteit te beoordelen. De karakterisering van de niet-lineaire optische respons van de PTFE-filters wordt uitgevoerd om er zeker van te zijn dat de fotonfluorescentie van het onbehandelde substraat zeer zwak is en de meting van de relevante biologische monsters en de emissie van geïsoleerde nanoparticles voor second harmonic generation niet belemmert; deze laatste kunnen eenvoudig worden verkregen door beeldvorming via het substraat in epi-detectiemodus.In deze figuur worden cardiale structuren en EBS, gelabeld met second harmonic generation-nanodeeltjes, getoond. De rode, gele en groene kleuren komen overeen met NADH-autofluorescentie, terwijl de intense blauwe second harmonic-spots afkomstig zijn van geïsoleerde second harmonic generation-nanodeeltjes. Let op het goede optische contrast en de relatief schaarse labeling in vergelijking met quantum dots of upconversion-nanodeeltjes.Deze figuur illustreert een doorsnedeweergave van een kloppend cardiaal cluster dat is gelabeld met nanodeeltjes voor tweede harmonische generatie. Zoals in deze film te zien is, worden de 3D-structuren met hoge snelheid opgenomen om het contractiepatroon in de tweede cel te monitoren. Nanodeeltjes voor tweede harmonische generatie aggregeren om een hoge acquisitiesnelheid te behouden voor het oplossen van de beweging van de NP.De algehele acquisitiegevoeligheid was onvoldoende om celautofluorescentie met tweede harmonische emissie vanuit tweede harmonische generatie vast te leggen. Beeldanalyse van nanopartikels uitgevoerd op movie-frames geeft aan dat de verplaatsingen binnen hetzelfde cardiale cluster in de orde van enkele micrometers liggen, en dat de frequentie constant is voor de beweging van nanopartikels bij tweede harmonische generatie in en uit het vlak. Wanneer de techniek voor celpreparatie beheerst wordt, kunnen de dissectie van het cluster, de lucht-vloeistofcultuur en de lammering in 24 tot 36 uur worden voltooid als dit correct wordt uitgevoerd.Vooral bij deze techniek moeten contacten met de open lucht worden vermeden om contaminatie te voorkomen. Na deze procedure kunnen andere methoden worden toegepast, zoals elektrofysiologische registraties met multiple electrode arrays, om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het correleren van actiepotentiaalprofielen met de slagfrequentie in drie dimensies. Onze nieuwe techniek, gebaseerd op de detectie van het niet-lineaire signaal door harmonische nanodeeltjes, kan verder worden ontwikkeld voor in vivo studies, aangezien de gebruikte golflengten voor beeldvorming een diepere penetratie in weefsels mogelijk maken.Een mogelijke ontwikkeling zou het volgen van de integratie van een uit stamcellen afgeleide structuur voor toepassingen in de regeneratieve geneeskunde kunnen zijn.

harmonic-nanoparticles-for-regenerative-research

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Plasmonische pincet en fotonische kristal nanostructuren worden getoond om nuttige verbeteringen te produceren in de efficiëntie en de oriëntatie controle van optisch trapping micro-en nano-deeltjes.

Gebruik van plasmonische en fotonisch kristal nanostructuren voor Enhanced micro-en nanodeeltjes Manipulatie

Nauwkeurige modellering van nanohelical structuren is van belang voor voorspellende simulatie studies die leiden tot nieuwe toepassingen van nanotechnologie. Momenteel, softwarepakketten en codes zijn beperkt in het creëren van atomistische spiraalvormige modellen. We presenteren twee procedures ontwikkeld om atomistische nanohelical modellen te maken voor de simulaties, en een grafische interface om onderzoek door visualisatie te verbeteren.

Schaalbare Nanohelices voor Predictive Studies en Enhanced 3D Visualisatie

Hier beschrijven we een protocol voor de synthese van magneto-plasmon nanodeeltjes met een sterk magnetisch moment en een sterke nabij-infrarood (NIR) absorptie. Het protocol omvat ook antilichaam conjugatie aan de nanodeeltjes door de Fc eenheid voor diverse biomedische toepassingen die moleculaire specifieke targeting vereisen.

Synthese van Immunotargeted Magneto-plasmonische Nanoclusters

Dit protocol beschrijft hoe de tijdelijke verwarming die geassocieerd is met de optische absorptie van gouden nanostaafjes, kan worden gebruikt om differentiatie en intracellulaire calciumactiviteit in neuronale cellen te stimuleren. Deze resultaten openen mogelijk nieuwe toepassingen in neurale prothesen en fundamentele studies in de neurowetenschappen.

Goud nanorod-bijgestaan ​​Optische Stimulatie van neuronale cellen

Dit protocol beschrijft het gebruik van een inertiale-microfluidics gebaseerde buffer wisselkoersstrategie micro / nanodeeltjes gemanipuleerde cellen te zuiveren efficiënte uitputting van ongebonden deeltjes.

Microfluïdische Buffer Exchange voor Interference-free Micro / nanodeeltjes Cel engineering

In deze studies geven we nieuwe methodologie voor neonatale muizen cardiale scaffolds voor gebruik in regeneratieve studies.

Neonatale Cardiac Steigers: Novel Matrices voor Regenerative Studies

Chondrogenese uit stamcellen vereist fine tuning van de kweekomstandigheden. Hier presenteren we een magnetische aanpak voor het condenseren van cellen, een essentiële stap om chondrogenese te initiëren. Bovendien tonen wij aan dat dynamische rijping in een bioreactor zijn mechanische stimulatie van de cellulaire constructen en verbetert kraakbeenachtige extracellulaire matrix productie.

3D Magnetic Stem Cell Samenvoeging en Bioreactor rijping voor het herstel van kraakbeen

Het doel van dit protocol is om aan te tonen van een effectieve methode om decellularize en decalcify van muis cochleae voor gebruik als steigers voor weefsel waterbouwkundige toepassingen.

Een Protocol voor Decellularizing muis Cochleae voor binnenoor Tissue Engineering

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de fabricage van ijzeroxide nanodeeltjes-shelled microbubbels (NSM's) door middel van zelfassemblage, synergetische magnetische, akoestische en optische responsiviteit in één nanotherapeutisch platform voor magnetische hyperthermie en fototherme combinatie kankertherapie.

Magnetische,akoestische en optisch-drievoudig-responsieve microbubbels voor magnetische hyperthermie en pothotothermale combinatie kankertherapie

Gedetailleerde stapsgewijze protocollen worden hier beschreven voor het bestuderen van mechanische signalen in vitro met behulp van multipotente O9-1 neurale crest cellen en polyacrylamide hydrogels van verschillende stijfheid.

Een geoptimaliseerd O9-1/Hydrogel-systeem voor het bestuderen van mechanische signalen in neurale crest-cellen

Hier presenteren we een protocol voor het toepassen van nanoseconde pulse electric field (nsPEF) om Schwann-cellen in vitro te stimuleren. De synthese en secretiecapaciteit van relevante factoren en veranderingen in celgedrag valideerden de succesvolle stimulatie met behulp van nsPEF. De studie geeft een positief beeld van de perifere zenuwregeneratiemethode.

Regulering van Schwann-celgroei door nanoseconde gepulseerd elektrisch veld voor perifere zenuwregeneratie in vitro

Leer hoe je harmonische nanodeeltjes gebruikt voor het labelen van humane embryonale stamcellen en het monitoren van cardiale contracties via multi-fotonmicroscopie. Deze methode biedt diepe weefselpenetratie en stabiele beeldvorming.

Harmonische Nanodeeltjes voor Regeneratieve Onderzoek

Meer video's verkennen