Harmonische Nanodeeltjes voor Regeneratieve Onderzoek
1 mei 2014
Protocol details worden verstrekt voor het in vitro merken menselijke embryonale stamcellen met tweede harmonischen genereren nanodeeltjes. Methodologieën voor hESC onderzoek door multi-foton microscopie en hun differentiatie in de hartspier clusters worden ook gepresenteerd.
Het algemene doel van het volgende experiment is het in vitro monitoren van hartslagclusters afgeleid van humane embryonale stamcellen in 3D real time en met hoge ruimtelijke resolutie. Dit wordt bereikt door eerst embryonale stamcellen te kweken en te vermeerderen totdat ze Embry-lichamen vormen. Vervolgens worden de hartslagclusters gedisseceerd en op POLYTETRAFLUOROLETHYLEEN of PTFE poreuze filters geplaatst, waardoor ze langdurig als lucht kunnen worden onderhouden.
Vloeibare culturen worden vervolgens gelabeld met harmonische nanodeeltjes om realtime multifotonenmicroscopie uit te voeren. De verkregen resultaten maken de analyse mogelijk van ruimtelijke verlenging en frequentie van hartcontracties op microscopische schaal. Het grote voordeel van deze nanodeeltjes is dat je elke golflengte kunt gebruiken, vooral infrarood, zodat je dieper in het weefsel kunt gaan en ze zijn ook zeer stabiel in de tijd.
Zo kunnen we onze lange processen over lange tijdsperioden monitoren. Deze stamcelcultuurmethode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van functionele contractie van cardiomyocyten in drie dimensies te beantwoorden. Met name hartmaturatio en weefselengineering.
Nieuwe individuen die de ziektemethode toepassen, moeten zich ervan bewust zijn dat de labelprocedure met harmonische nanodeeltjes alleen kan worden gebruikt voor multifotonenmicroscopie en niet kan worden overgedragen naar andere soorten beeldvormingssystemen. We hadden in 2005 voor het eerst het idee om harmonische nanodeeltjes te gebruiken. Deze nanodeeltjes hebben voordelen ten opzichte van fluorescerende kleurstoffen en quantumdots.
In feite vervagen hun signaal niet na verloop van tijd en kunnen ze worden gebruikt om ontwikkelende monsters gedurende lange tijdsperioden te monitoren. Visuele demonstratie van de monstervoorbereiding is cruciaal voor de efficiëntie en de reproduceerbaarheid van de verschillende stappen, met name bij het uitvoeren van medicijntesten en kan ook worden toegepast op verschillende weefsels of ziekten. Weefselmodellering.
Na het kweken en vermeerderen van humane embryonale stamcellen of ESC's volgens het tekstprotocol en het incuberen met warme collagenase, vier gedurende 10 minuten, verzamel de koloniefragmenten in twee milliliter verse differentiatie, medium of DM en centrifugeer gedurende drie minuten bij 115 keer de zwaartekracht. Cultuur, de koloniefragmenten in suspensie in ultra lage aanhechtingen. Zes welplaten gedurende vier dagen om ze embryolichamen of ebs te laten vormen.
Plaats vervolgens de nieuw gevormde EBS op 0,1%Gelatine gecoate 24 welplates gedurende 15 tot 30 dagen tot het verschijnen van hartslagclusters. Verwijder de PBS en gebruik een cutus om de kolonies te dissociëren in enkele cellen na centrifugatie en resus, waarbij de cellen in DM-medium worden gesuspendeerd, plateer twee milliliter per agro. Wel kamer en incubeer gedurende één dag bij 37 graden Celsius.
Verzamel de nieuw gevormde EBS en plateer er drie per wel op 0,1%gelatine gecoate 24 welplates na twee tot vier weken in cultuur. Identificeer clusters van kloppende cardiomyocyten en gebruik een langwerpige, scherp gesneden plakpijp om ze handmatig te disseceren. Deponeer vier PTFE-filters per invoeg en plaats ze elk in een wel van een zes welplate.
Na het toevoegen van één milliliter DM in elk, wel, voeg een gedissecteerde hartslagcluster toe aan elke PTFE-filter. Om de clusters te labelen, breng de PTFE-filters met de kloppende clusters over in een 3,5 centimeter glazen bodemschaal. Voeg één milliliter tweede harmonische generatie nanodeeltjes toe bij 50 microgram per milliliter en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius om niet-lineaire optische beeldvorming uit te voeren.
Na het overbrengen van gelabelde HEB's of hartslagclusters naar een beeldvormingskamer, gebruikt u breedveldbeeldvorming onder wit lichtverlichting om structuren van belang te identificeren binnen gedifferentieerde EBS of actieve kloppende clusters. Voer een snelle laagresolutie driedimensionale scan uit om de algehele morfologie van de hartcluster opnieuw op te bouwen en selecteer een beeldvlak binnen het clustervolume met verschillende zichtbare tweede harmonische generatie nanodeeltjes om in realtime te monitoren. De hartclustercontracties zetten de microscoop optische scanner in de snelste modus, waardoor multi-hertz acquisitie van tweedimensionale beelden mogelijk is.
Analyseer de beelden met behulp van de MATLAB-software volgens het tekstprotocol zoals hier gedemonstreerd voorafgaand aan het beoordelen van de klopactiviteit. Karakterisering van het niet-lineaire optische antwoord van de PTFE-filters wordt uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de naakte substraat naar fotonfluorescentie erg zwak is en het meten van de relevante biologische monsters en de emissie van geïsoleerde niet kan voorkomen. Tweede harmonische generatie nanodeeltjes kunnen gemakkelijk worden verkregen door beeldvorming door het substraat in epi-detectiemodus.
In deze figuur worden tweede harmonische generatie nanodeeltjes gelabelde hartstructuren en EBS weergegeven op de snede. De rode, gele en groene kleuren komen overeen met NADH-autofluorescentie, terwijl de intense blauwe tweede harmonische vlekken afkomstig zijn van geïsoleerde tweede harmonische generatie nanodeeltjes. Merk de goede optische contrast en de relatief schaarse markering op in vergelijking met quantumdots of upconversie nanodeeltjes.
Deze figuur illustreert een doorsnede van een tweede harmonische generatie nanodeeltjes gelabelde hartslagcluster. Zoals in deze film wordt getoond, worden de 3D-structuren met hoge snelheid opgenomen om het contractiepatroon in de tweede cel te monitoren. Harmonische generatie nanodeeltjes aggregeren om een hoge acquisitiesnelheid te handhaven voor het oplossen van de NP-beweging.
De algehele acquisitiegevoeligheid was niet voldoende om celautofluorescentie op te nemen met tweede harmonische emissie van tweede harmonische generatie. Nanodeeltjesbeeldanalyse uitgevoerd op filmframes geeft aan dat binnen dezelfde hartcluster verplaatsingen van enkele micrometers zijn en de frequentie constant is voor in en uit vlak tweede harmonische generatie nanodeeltjesbeweging. Wanneer de celvoorbereidingstechniek wordt beheerst, kan de sectie van de kloppende cluster, de lucht-vloeistofcultuur en het lam in 24 tot 36 uur worden uitgevoerd als dit correct wordt uitgevoerd.
Met name met deze techniek moet
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor in vitro markering van menselijke embryonale stamcellen (hESCs) met behulp van tweede harmonischegenererende nanodeeltjes. Het beschrijft methodologieën voor het onderzoeken van hESCs via multifotonmicroscopie en hun differentiatie naar hartclusters.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Stamcellenonderzoek
- Cardiale biologie
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- Menselijke embryonale stamcellen kunnen differentiëren in verschillende celtypen.
- Het monitoren van cardiale parelketens is cruciaal voor het begrijpen van de hartontwikkeling.
- Tweede harmonischegenererende nanodeeltjes bieden voordelen bij beeldvorming.
- Multifotonmicroscopie biedt hoge ruimtelijke resolutie voor realtime analyse.
Doel van het onderzoek
- Om cardiale parelketens afkomstig van hESCs in realtime te monitoren.
- Om de ruimtelijke verlenging en frequentie van hartcontracties te analyseren.
- Om nanodeeltjes te gebruiken voor dieper weefselbeeldvorming.
Gebruikte methoden
- Het kweken en uitbreiden van hESCs om embryoïde lichamen te vormen.
- Het dissecteren en plateren van kloppende clusters op PTFE poreuze filters.
- Het markeren van kloppende clusters met harmonische nanodeeltjes.
- Het uitvoeren van realtime multifotonmicroscopie voor analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle monitoring van hartcontracties op microscopische schaal.
- Aangetoonde stabiliteit van nanodeeltjes in de tijd.
- Mogelijkheid om verschillende golflengten te gebruiken voor diepere weefselpenetratie.
- Inzichten in de dynamica van cardiaal clustergedrag.
Conclusies
- De methodologie maakt effectieve in vitro monitoring van cardiale clusters mogelijk.
- Tweede harmonischegenererende nanodeeltjes verbeteren de beeldvormingscapaciteiten.
- Deze benadering kan de begrip van cardiale ontwikkeling van stamcellen bevorderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Labeling human embryonic stem cell-derived cardiac clusters with second harmonic generation nanoparticles (HNPs) enables high-resolution, real-time 3D monitoring of tissue dynamics critical for regenerative research. This approach provides stable, deep-tissue imaging for extended observation of cardiac maturation and functional contraction, supporting predictive confidence in early discovery and tissue engineering workflows. The method advances portfolio decision-making by enabling quantitative, reproducible analysis of stem cell-derived tissue constructs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of cardiomyocyte function and maturation in 3D tissue models.
- Supports mechanistic de-risking by providing direct visualization of contractile behavior in stem cell-derived systems.
- Facilitates functional target validation for cardiac tissue engineering and regenerative medicine research.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, labeled cardiac clusters for downstream multiphoton imaging assays.
- Delivers reproducible, quantitative readouts of contraction frequency and displacement patterns.
- Supports assay standardization and scalability for compound evaluation in disease-relevant systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling 3D functional analysis of cardiac constructs.
- Provides continuity from discovery-stage tissue modeling to preclinical validation of regenerative therapies.
- Reduces biological risk by supporting predictive assessment of tissue integration and function.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, functional validation, and quantitative analysis of stem cell-derived cardiac tissues.
- Discovery Biology: Supports mechanistic studies of cardiac differentiation and contractility in engineered tissues.
- Screening: Provides robust, quantitative imaging outputs for evaluating functional endpoints.
- Analytics: Enables measurement of displacement and contraction frequency for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro tissue modeling with preclinical assessment of regenerative strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis platform for diverse tissue engineering applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac tissue research.
- Operational Value: Delivers stable, reproducible imaging over long-term experiments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency in regenerative portfolio development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of tissue engineering and regenerative medicine programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, tissue engineering, and multiphoton microscopy.
- Needs access to advanced imaging platforms and quantitative analysis software (e.g., MATLAB).
- Demands cross-team standardization of labeling and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptation to other tissue types or disease models may require protocol optimization.
- Labeling with HNPs is limited to multiphoton microscopy and not transferable to other imaging modalities.
