Detectie van TL Nanoparticle Interacties met Primary Immune celtypes door flowcytometrie
28 maart 2014
Analyse van nanodeeltjes interactie met gedefinieerde subpopulaties van immune cellen door flowcytometrie.
Het algemene doel van deze procedure is om interacties van fluorescerende nanodeeltjes met primaire immuuncelsubpopulaties te detecteren door middel van flowcytometrie. Dit wordt bereikt door de cellen van belang eerst te behandelen met de nanodeeltjes. In de volgende stap worden de cellen gelabeld met antilichamen tegen celspecifieke oppervlaktemarkers en vervolgens geanalyseerd door middel van flowcytometrie.
Uiteindelijk kan de interactie van de nanodeeltjes met individuele immuuncelpopulaties worden gemeten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals microscopie is dat met deze techniek variaties in fluorescentie-intensiteiten geïnduceerd door nanodeeltjes kunnen worden gekwantificeerd in niet-aderente celpopulaties Voor nanodeeltje-internalisatie in bloedleukocyten of gezuiverde monocyten begint men met het platen van vijf maal 10 tot de vijfde van de cellen van belang in één milliliter per putje. In elke putje van een 12-putjesplaat.
Voeg vervolgens 10 microliter vers bereide werkende suspensie van fluorescerende siliciumdioxide-nanodeeltjes toe aan elke experimentele putje, en voeg tegelijkertijd een gelijk volume volledig medium toe aan de onbehandelde controleputjes. Na een uur internalisatie bij 37 graden Celsius, breng de monsters over in individuele 1,5 milliliter polypropyleenbuisjes, en draai vervolgens de monsters drie minuten bij 6.000 keer G en kamertemperatuur om de cellen te kleuren met CD 14 via blauw. Incubeer 100 microliter van elke celsuspensie in 10 microliter van het humane antilichaam in een verhouding van een op 11 in loopbuffer gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Na het wegspoelen van de ongebonden antilichamen in één milliliter loopbuffer, resuspendeer de cellen in 200 microliter verse loopbuffer voor flowcytometrische analyse.
Vervolgens, om de spectrale overloopcompensatie in te stellen, opent u het instrumentinstellingenvak in de flowcytometriesoftware en verwerft u een antilichaam vrij van ongelabelde nanodeeltjes monster bij lage fluïdische snelheid. Het aanpassen van de compensatie-instellingen in aanwezigheid van fluorescerende nanodeeltjes is het lastigste deel van de procedure, aangezien de nanodeeltjes kunnen interfereren met de zijwaartse verstrooiing. Om succes te garanderen, moet een poort van de celpopulatie van belang worden gedefinieerd. Pas handmatig de voorwaartse en zijwaartse verstrooiing aan door de spanningskanalen te regelen. Trek vervolgens een geschikte grote poort rond de gewenste celpopulatie.
Laad een ander ongelabeld monster en open het compensatietabblad in het instrumentinstellingenvak. Pas de compensatiefactor aan tijdens de verwerving tot de fluorescentie-intensiteit in het overloopkanaal ongeveer hetzelfde is voor de fluorochroom-positieve en negatieve populaties. Ten slotte, na het aanpassen van de compensatie voor elke enkel gekleurde fluorochroom-controlebuis, leest u de met nanodeeltjes behandelde monsters in een poging om het gedrag van witte bloedcellen in reactie op nanodeeltjes beter te karakteriseren, werden internalisatie-assays uitgevoerd zoals zojuist is aangetoond.
Bijvoorbeeld, in dit representatieve experiment werden drie belangrijke bloedleukocytensubpopulaties duidelijk geïdentificeerd door voorwaartse en zijwaartse verstrooiing na PBMC-isolatie. Bovendien, na behandeling met fz siliciumdioxide, vertoonden lymfocyten, monocyten en granulocyten verschillende nanodeeltjesinternalisatiepercentages zoals aangegeven door hun fluorescentie-intensiteit. In deze afbeeldingen wordt nanodeeltjesinternalisatie aangetoond in primaire CD 14-positieve monocyten gezuiverd uit PBMC.
Deze spreidingsgrafieken tonen CD 14-positieve monocyten in aanwezigheid van fitz's siliciumdioxidenanodeeltjes. De histogram toont de kwantificering van de fitzy-positieve cellen uitgedrukt als fluorescentie-intensiteit. Vergelijkbare internalisatie-experimenten werden uitgevoerd met TP een monocyten behandeld met toenemende concentraties van fitz's siliciumdioxidenanodeeltjes met onbehandelde cellen als negatieve controle.
De stipplots illustreren de dosisafhankelijke toename van zijwaartse verstrooiing met een onveranderde voorwaartse verstrooiing in de TP een cellijn na nanodeeltjesinternalisatie. De gegevens uit deze grafieken suggereren dat behandeling met fitz's siliciumdioxidenanodeeltjes een dosisafhankelijke internalisatie induceert in monocyten, gemarkeerd door de verbetering van de intracellulaire granulariteit om verder inzicht te krijgen in de interacties tussen immuuncellen en nanodeeltjes, werden microglia gedurende zeven dagen in vitro gekweekt en gedurende een uur met nanodeeltjes geïncubeerd. Fluorescentiemicroscopie wees op een gemengde primaire gliacellencultuur met een groot aantal GFP-negatieve niet-aderente astrocyten en enkele GFP-positieve cellen.
In dit representatieve experiment konden drie gliacellensubpopulaties worden onderscheiden door flowcytometrie met een enkele CD 11 B antilichaamkleuring CD 11 B, negatieve GFP-negatieve astrocyten en andere gliacellen microgliale CD 11 B-positieve GFP-negatieve cellen en een CD 11 B-positieve GFP-positieve subpopulatie. De laatste twee subpopulaties zijn in staat om nanodeeltjes te internaliseren met een licht verhoogde deficiëntie door de GFP-positieve populatie. Nanodeeltjesinternalisatie kan verder worden geverifieerd door confocale microscopie zoals gedemonstreerd in deze afbeelding met behulp van rod domine siliciumdioxidenanodeeltjes.
Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de monsters in het donker te houden om verbleking van de fluorescerende kleurstoffen te voorkomen en de monsters gedurende de antilichaamsincubaties op vier graden te houden. Na dit proces kunnen andere methoden zoals confocale microscopie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de intracellulaire lokalisatie van de nanodeeltjes.
Overzicht
Deze studie richt zich op de interactie van fluorescerende nanodeeltjes met primaire immuuncel-subpopulaties met behulp van flowcytometrie. De methode maakt kwantificering van nanodeeltje-internalisatie in verschillende immuuncellen mogelijk, waardoor inzichten in hun gedrag worden geboden.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Nanotechnologie
- Flow Cytometrie
Achtergrond
- Nanodeeltjes kunnen worden gebruikt om interacties tussen immuuncellen te bestuderen.
- Flowcytometrie biedt voordelen ten opzichte van microscopie voor het kwantificeren van fluorescentie.
- Inzicht in nanodeeltje-internalisatie kan therapeutische strategieën informeren.
- Verschillende soorten immuuncellen kunnen verschillende reacties op nanodeeltjes vertonen.
Doel van het onderzoek
- Om de interactie van nanodeeltjes met immuuncel-subpopulaties te analyseren.
- Om internalisatiepercentages van nanodeeltjes in verschillende celtypen te kwantificeren.
- Om het begrip van immuunreacties op nanodeeltje-behandeling te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Primaire immuuncellen werden behandeld met fluorescerende siliciumdioxide nanodeeltjes.
- Cellen werden gelabeld met specifieke antilichamen voor flowcytometrische analyse.
- Compensatie-instellingen werden aangepast om rekening te houden met nanodeeltje-interferentie.
- Internalisatie-assays werden uitgevoerd om nanodeeltje-opname te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Verschillende immuuncelpopulaties vertoonden verschillende internalisatiepercentages van nanodeeltjes.
- Flowcytometrie onderscheidde effectief tussen celtypen op basis van fluorescentie-intensiteit.
- Internalisatie werd bevestigd door aanvullende microscopietechnieken.
- Resultaten gaven een dosisafhankelijke relatie aan in monocyt nanodeeltje-opname.
Conclusies
- De studie toont de bruikbaarheid van flowcytometrie bij het analyseren van nanodeeltje-interacties met immuuncellen.
- Bevindingen dragen bij aan het begrip van hoe nanodeeltjes immuunreacties kunnen beïnvloeden.
- Verder onderzoek kan therapeutische toepassingen van nanodeeltjes in de immunologie verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables quantitative assessment of nanoparticle internalization in primary immune cell subpopulations, supporting target validation and mechanistic de-risking in nanotherapeutic development. By providing dose-dependent and cell-type-specific uptake data, it enhances predictive confidence in early discovery and informs go/no-go decisions for nanoparticle-based interventions. The approach addresses a key discovery-stage challenge: translating nanoparticle-cell interactions into actionable, reproducible metrics for portfolio prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying nanoparticle uptake across immune subsets, clarifying which cell populations engage with nanocarriers.
- Operational Value: Enables biological de-risking through standardized, reproducible measurement of internalization via fluorescence intensity and side-scattered light shifts.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying cell types with high or low nanoparticle affinity, guiding target selection for immunomodulatory nanotherapies.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated immune cell systems for downstream screening by establishing baseline nanoparticle interaction profiles.
- Quantitative Outputs: Generates fluorescence intensity and SSC metrics that enable standardized, comparable readouts across conditions and time points.
- Platform Reuse: Supports scalable screening workflows through consistent gating, compensation, and antibody labeling protocols applicable to diverse nanoparticle formulations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Extends to primary microglia from mutant mice, enabling CNS-targeted nanoparticle studies in disease-relevant immune models.
- Translational Continuity: Connects flow cytometry findings to confocal microscopy confirmation, strengthening mechanistic interpretation for preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs advancement decisions by revealing differential internalization rates, such as GFP-positive microglial subpopulations showing altered nanoparticle uptake.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target engagement screening to preclinical mechanistic evaluation, particularly for immunomodulatory nanotherapies where immune cell interaction profiles are critical.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking nanoparticle exposure to measurable changes in cell granularity and fluorescence, clarifying mechanisms of immune cell activation or modulation.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized isolation, labeling, and compensation steps that ensure reproducible quantification of nanoparticle-cell interactions.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (fluorescence intensity, SSC shifts) that enable comparison of internalization across cell types, concentrations, and time points.
- Translational Research: Connects to preclinical validation via orthogonal confirmation with confocal microscopy, aligning with biomarker-aligned mechanistic de-risking.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across nanoparticle formats (e.g., FITC-SiO₂, Rhodamine-SiO₂) and immune models (human blood leukocytes, murine microglia), reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by delivering cell-resolved, quantitative data on nanoparticle internalization, improving target confidence in immunomodulatory strategies.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined compensation protocols and antibody panels, minimizing variability across users and sites.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying early which immune subsets are prone to nanoparticle engagement, reducing late-stage biological risk in nanotherapeutic development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by highlighting nanoparticle formulations with favorable or undesirable immune cell interaction profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry compensation, particularly to address nanoparticle-induced side-scattering interference during spectral overlap correction.
- Dependent on access to flow cytometers with fluorescence and scatter detection capabilities, along with antibody panels for immune cell subset identification.
- Necessitates cross-team standardization of gating strategies and compensation settings to ensure consistent data interpretation between discovery and preclinical groups.
- Requires adaptation when applied to different model systems (e.g., adherent vs. non-adherent cells, human vs. murine primary cells) to maintain assay fidelity.
- Practical limitation: Nanoparticle fluorescence or scatter properties may interfere with certain fluorochromes, requiring careful panel design and compensation validation as noted in the protocol.
