Cell Labeling en Injectie in ontwikkelingslanden Embryonale Mouse Hearts

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van injectie van cellen die sterven, of DNA in embryonale muisharten. Om vetcellen te onderzoeken of om lokaal genexpressie te manipuleren, wordt dit bereikt door eerst de embryo's uit een zwangere muis te disseceren en het embryonale hart bloot te leggen. Vervolgens worden DNA-kleurstof of cellen geïnjecteerd in het beoogde gebied in het hart.

Nadat het embryo is geïncubeerd, wordt het hart verwijderd en in cultuur geplaatst. Ten slotte wordt het lot van geïnjecteerde of gelabelde cellen bepaald via microscopie. Uiteindelijk wordt het lot van geïnjecteerde, gelabelde of genetisch gemodificeerde cellen gemonitord door confocale microscopie of licht- en epifluorescentiemicroscopie, waardoor de functionele belangrijkheid van specifieke genen en cellen tijdens de hartontwikkeling wordt onthuld.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals transgenese bij muizen, is dat we lokaal en nauwkeurig laboratorium- of genetisch gemodificeerde cellen in vivo kunnen injecteren. Dit maakt het mogelijk om deze cellen in de juiste omgeving te onderzoeken. Het demonstreren van deze procedure zal door mij en Emily aar, een PhD-student uit een laboratorium, worden gedaan.

Na het voorbereiden van apparatuur, reagentia en oplossingen, volgens het tekstprotocol, verzamel E 9,5 en E 10,5 embryo's van een geëuthanaseerd zwangere muis door eerst 70% ethanol te gebruiken om de borst te steriliseren, een ventrale midline-incisie te maken om de buik te openen en het baarmoederhoorn te verwijderen voordat het wordt overgebracht naar PBS op kamertemperatuur. Na twee extra wasbeurten in PBS, breng het over naar een met siliconen gevulde petrischaal. Gebruik M 16-medium, gebruik insectenpinnen om het baarmoederhoorn aan de siliconenlaag vast te pinnen, zodat de vaatwand van de baarmoeder eronder ligt.

Gebruik vervolgens fijne pincetten om het oppervlak van de baarmoeder te snijden en het decidua op één millimeter onder het oppervlak af te dekken. Spreid de wanden van de decidua uit en haal voorzichtig het embryo in de dooierzak eruit. Bewaar het in M 16-medium bij 37 graden Celsius voorafgaand aan celinjectie om injecties uit te voeren.

Gebruik eerst een Hamilton-spuiten om een glazen pipet van achteren te vullen met DNA of cellen, en schud de pipet om luchtbellen te verwijderen. Plaats de pipet op de micro-injectiehouder en stel de injector in volgens de volgende instellingen. Speld vervolgens het embryo aan de siliconenbodem vast door de dooierzak zonder het embryo zelf te raken.

Identificeer vervolgens het gebied van het hart en open de zak net boven dit gebied. Plaats vier pinnen rond het embryo om enige beweging tijdens celinjectie te voorkomen. Gebruik de micro-manipulator ingesteld op handmatig, positioneer de pipettip langzaam onder een hoek van 45 graden boven het pericardium, net boven het gebied van het hart dat moet worden geïnjecteerd.

Beweeg de pipet naar het gewenste gebied, activeer de injectie en verwijder de pipet zo snel mogelijk. Zorg ervoor dat het hart goed klopt na de DNA- of celinjectie. Gebruik het injectieprotocol dat in deze video wordt beschreven om de epitheel-mesenchymale transitie en E 9,5 A VC explan te bestuderen, werd geïnjecteerd met een S-H-R-N-A die een eiwit downreguleerd dat vereist is voor endotheliale mesenchymale overgang van endocardiale cellen. Het controle-embryo werd geïnjecteerd met een lege ruggengraatvector, evenals HUES-cel-afgeleide endotheliale pre-valvulaire cellen die GFP tot expressie brengen onder controle van de SOX negen-promotor werden geïnjecteerd in de A VC bij E 10,5, gevolgd door 48 uur van explantaathartcultuur.

Deze cellen verwerven markers van EMT, zoals periostijn, vergelijkbaar met de endogene endocardiale cellen. De ex vivo-benaderingen die hier worden gedemonstreerd, zijn relatief eenvoudig, maar beperkt tot een maximaal kortetermijnopvolging van 48 tot 72 uur. Echter, de door echografie geleide injectieprocedure die in het tekstprotocol wordt beschreven, biedt een technisch meer uitdagende benadering, maar met de optie van lange postnatale in utero-opvolging.

De in utero-injectie van kleurstof of virale vectoren om cellen in specifieke hartregio's te labelen, wordt hier getoond. Met deze methode kan specifieke markering van epicardiale cellen worden bereikt met fluorescerende kleurstoffen of virus, en de methode kan worden uitgebreid met cellen of alternatieve injecteerbare stoffen. Door deze procedure te volgen, kan een methode zoals bryocultuur worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het langetermijneffect van een gen, een molecuul of lange lijstlezing, zoals weefselmorfogenese na zijn ontwikkeling.

Deze techniek heeft de weg gebaand voor onderzoekers op het gebied van hartontwikkelingsbiologie en genetica. Het stelt ons in staat om de wereld van nieuwe genen te verkennen, evenals om het lot van menselijke cellen in de juiste embryonale context te onderzoeken. Dit is erg handig wanneer een transgene muislijn niet beschikbaar is.