Langdurige Intravitale Immuunfluorescentie beeldvorming van Tissue Matrix Bestanddelen met Epifluorescentie en twee-foton microscopie

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van intravitale immunofluorescentie-beeldvorming van het oor van muizen met een melanoma om de dynamiek van matrixcomponenten van tumorweefsel te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst een muisoor te inoculeren met GFP-expresserende B 16 F 10 melanomcellen. Vervolgens wordt er een chirurgische ingreep aan het muisoor verricht om de ventrale van de dorsale oorhuid te scheiden en het tumorweefsel bloot te leggen.

Vervolgens wordt immunovleuring uitgevoerd op het blootgestelde weefsel van het dorsale oor. Ten slotte wordt het dier voorbereid voor intravitale beeldvorming. Uiteindelijk wordt fluorescente stereomicroscopie of multifotonmicroscopie gebruikt om de lokalisatie en het dynamische gedrag van tumorcellen en hun matrixcomponenten aan te tonen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden voor live-imaging is dat we de dynamische interacties van tumorcellen met stroma-geassocieerde cellen, zoals immuuncellen, kunnen visualiseren, maar dan in de context van een fibrillaire en netwerkachtige extracellulaire matrix. Deze methode kan u dus helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de tumorbiologie, zoals de wijze waarop tumorcellen interageren met hun fysieke micro-omgeving, wat op zijn beurt belangrijke inzichten kan verschaffen in de progressie van tumoren. Een deel van de procedure zal worden gedemonstreerd door Vita Kki, senior wetenschapper in ons laboratorium. Begin met het kweken van B 16 F 10 GFP melanomacellen om de tumorcellen voor injectie voor te bereiden.

Overbreng de cellen na centrifugatie naar een eppendorfbuisje van 1,5 milliliter en centrifuger opnieuw. Verwijder alle supernatant, behalve een dunne laag medium die net boven het pellet blijft. Resuspendeer de cellen tot een dik cellenslurry om deze vervolgens in een Hamilton-spuit met een volume van 10 microliter te laden. Verwijder de dop van een aangekoppelde naald van 33 gauge en laad 20 microliter van de slurry bovenop de tipkamer.

Trek vervolgens de zuiger naar achteren tot er 5 µL suspensie in de spuit is geladen. Nadat een C 57 black six muis is gebouteerd met injecteerbare anesthesie, scheert u de kop van de muis, verwijdert u de haren op de kop en rond het oor, en spoelt u dit af met water. Fixeer de proximale rand van het oor met plakband op de top van een wijsvinger.

Steek de naald van de Hamilton-spuit tussen de dorsale dermis en het kraakbeen van het oor van een C 57 black six-muis, waarbij het oor van proximaal naar distaal over ongeveer twee tot drie millimeter wordt gepenetreerd. Injecteer de cel-slurry en trek de naald langzaam uit de huid terug. Laat de tumorcellen gedurende zeven tot negen dagen een solide tumor vormen, waarbij een fluorescentiemicroscoop wordt gebruikt om de tumorgroei te volgen.

Nadat de muis is genaesthetiseerd met een mengsel van bevochtigde zuurstof en isofluraan, plaatst u de muis op een warmtemat van 37 °C en voert u een zachte knijptest bij de teen uit om te bevestigen dat het dier voldoende is genaesthetiseerd. Breng oogzalf aan op de ogen en houd de muis gedurende de gehele procedure op een warmtemat die wordt geregeld door een rectale thermistor.

Plaats vervolgens het oor met de tumor voorzichtig op een stapel objectglazen. Gebruik daarna kleine strookjes plakband om de voor- en achterzijde van het oor met een scalpel aan de stapel te fixeren; snijd de ventrale huid van het oor langs de antihelix van de muzenoppen. Verwijder de plakbandjes van het oor met behulp van gebogen pincetten.

Pel voorzichtig de ventrale dermis en het kraakbeen van de dorsale dermis af. Gebruik Ringer-buffer om het oor te wassen ter voorbereiding op de immunofluorescentiekleuring. Breng primaire antilichamen tegen extracellulaire matrixmoleculen in blokkeringsbuffer aan op het blootgestelde oor en plaats daarop een dekglas.

Incubeer gedurende 15 minuten en gebruik vervolgens ongeveer vijf milliliter Ringersbuffer om het oor twee keer te wassen. Breng de passende secundaire antilichamen of strep Aden aan in blokkeringsbuffer. Plaats een dekglas en incubeer gedurende 15 minuten alvorens opnieuw twee keer te wassen. Vouw het open dermale gebied in de EM mencia conki en gebruik steriele doekjes om de buitenste, niet-geopende dermis van het oor te drogen.

Plaats het oor op een stapel glazen objectglaasjes en breng 0,5 µL chirurgische lijm aan op de anterieure en posterieure dorsale randen om het te immobiliseren voor kortstondige beeldvorming van twee uur of minder. Voeg vers bereide steriele as sorbate ringers-buffer toe bovenop het geïmmobiliseerde oor en breng een dekglas aan. Gebruik vervolgens een fluorescent stereomicroscoop met een dubbele lens om het oor te beelden.

Voor langetermijnbeeldvorming. Plaats de uitlaat van een naald, verbonden met een reservoir met sorbaat-Ringer, onder het dekglas op ongeveer 0,5 centimeter afstand van het oor. Gebruik een peristaltische pomp met een snelheid van 1 µL per minuut om de buffer constant in de kamer toe te dienen.

Open de acquisitiesoftware. Stel de fluorescentie-gain, de vergroting en de belichtingstijd van de afbeelding in voor verschillende velden die tumorcellen en gekleurde extracellulaire matrixeiwitten bevatten, om intravitale beeldvorming uit te voeren met multifotonmicroscopie en siliconenvet. Begin bij de basis van het oor.

Bouw een cirkelvormige wand van ongeveer twee centimeter diameter en twee tot drie millimeter hoogte rond het oor. Vul de cirkel met sorbaat-ringers. Plaats de muis op de objecttafel op een verwarmingsmat, ingesteld op 37 °C, en configureer de instellingen van de microscoop volgens het tekstprotocol.

Zoals in deze figuur wordt getoond, kunnen veel structuren op basis van hun morfologie na immunokleuring worden onderscheiden. Dit geldt voor componenten van het basaalmembraan zoals collageen IV of proleane, en in het bijzonder voor structurele eiwitten die normaal gesproken niet met SHG kunnen worden gedetecteerd. De klassieke methode voor matrixdetectie kan worden gevisualiseerd.

We stelden bijvoorbeeld vast dat tenascine-C op verschillende locaties in het tumorstroma wordt afgezet vanuit fibrillaire collagenen; krachten die zich ontwikkelen binnen de tumormicro-omgeving kunnen leiden tot expansie of contractie van de tumormatrix en bijgevolg tot remodellering van de tumorvasculatuur, vergelijkbaar met wondgenezing. Hier tonen we aan dat we twee-foton time-lapse microscopie kunnen uitvoeren, terwijl we gelijktijdig immuungekleurde tenascine-C matrix in beeld brengen met minimale fotobleking van fluorforen, zelfs bij de hoge fotonendichtheid van twee-foton microscopie. In deze video hechtten tumorcellen, die op de blootgestelde dermis waren geplaatst en vooraf waren gekleurd voor collageen IV, zich aan het weefsel en begonnen ze in groepen collectief te migreren langs het basaalmembraan van bloedvaten en adipose sites.

Zodra de volledige procedure voor het openen van het oor en de immunokleuring onder de knie is, duurt dit twee uur. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u intravitale immunokleuring uitvoert om cel-matrixinteracties in tumoren te bestuderen met behulp van epifluorescentie of tweefotonmicroscopie.