Langdurige Intravitale Immuunfluorescentie beeldvorming van Tissue Matrix Bestanddelen met Epifluorescentie en twee-foton microscopie
22 april 2014
De extracellulaire matrix ondergaat ingrijpende verbouwing tijdens de wondgenezing, ontsteking en het ontstaan van tumoren. Wij presenteren een nieuwe intravitale immunofluorescentie microscopie benadering van de dynamiek van fibrillaire en mesh-achtige matrix componenten met hoge ruimtelijke en temporele resolutie met behulp van epifluorescentie of twee-foton microscopie visualiseren.
Het algemene doel van deze procedure is om intra vitale immunofluorescentiebeeldvorming van het oor van melanoombestende muizen uit te voeren om de dynamica van matrixcomponenten van tumorweefsel te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst een muizenoor te inoculeren met GFP-expresserende B 16 F 10 melanoomcellen. Vervolgens wordt er een operatie uitgevoerd aan het muizenoor om de ventrale van de dorsale oorschilden te scheiden en het tumorweefsel bloot te leggen.
Daarna wordt immunokleuring uitgevoerd op het blootgelegde weefsel van het dorsale oor. Ten slotte wordt het dier voorbereid op intra vitale beeldvorming. Uiteindelijk wordt fluorescente stereomicroscopie of multifotonmicroscopie gebruikt om lokalisatie en dynamisch gedrag van tumorcellen en hun matrixcomponenten te tonen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek in vergelijking met de andere live-beeldvormingsmethoden is dat we de dynamische interacties van tumorcellen met de stroma-geassocieerde cellen zoals immuuncellen kunnen beeldvormen, maar dit gebeurt in de context van fibrillaire en netvormige extracellulaire matrix. Dus deze methode kan u helpen sleutelvragen op het gebied van tumorbiologie aan te pakken, zoals hoe tumorcellen interageren met hun fysieke micro-omgeving, wat op zijn beurt belangrijke inzichten kan opleveren in hoe tumoren progresseren. Een deel van de procedure zal worden gedemonstreerd door Vita Kki, een senior wetenschapper van ons laboratorium. Om tumorcellen voor injectie voor te bereiden, begint u met het cultiveren van B 16 F 10 GFP melanoomcellen.
Na het centrifugeren van de cellen, brengt u ze over in een 1,5 milliliter einorbuis en centrifugeert u opnieuw, verwijdert u alle supernatant behalve een dunne laag medium dat net boven het pellet blijft, suspendeert u de cellen in een dikke cellenslurry en laadt u de cellenslurry vervolgens in een volume van 10 microliter. Hamilton spuit. Verwijder de tipdop van een aangesloten 33 gauge naald en laad 20 microliter van de slurry bovenop de tipkamer.
Trek vervolgens terug op de zuiger totdat vijf microliter van de slurry in de spuit is geladen. Na het anesthesieren van een C 57 black zes muis met injecteerbare anesthesie, scheer het muishoofd, verwijder de haren op het hoofd en rond het oor en spoel af met water. Gebruik plakband om de proximale rand van het oor op de punt van een wijsvinger te bevestigen.
Bring de Hamilton spuitnaald tussen de dorsale dermis en het kraakbeen van het oor van een C 57 black zes muis in, penetreer het oor van proximaal tot distaal gedurende ongeveer twee tot drie millimeter. Injecteer de cellenslurry en trek de naald langzaam uit de huid. Laat de tumorcellen gedurende zeven tot negen dagen een solide tumor vormen, gebruik een fluorescentiemicroscoop om de tumorgroei te volgen.
Na het gebruik van een mengsel van bevochtigde zuurstof en iso fluorine om de muis te anesthesieren, plaats de muis op een verwarmingskussen van 37 graden Celsius en voer een zachte teenprik uit. Om te bevestigen dat het dier voldoende is verdoofd. Breng oogzalf aan op de ogen en houd de muis gedurende het hele proces op een rectale thermistor-gestuurde verwarmingskussen.
Plaats vervolgens het tumordragende oor voorzichtig op een stapel glazen platen. Gebruik vervolgens kleine stroken plakband om de voorste en achterste randen van het oor aan de stapel te bevestigen. Gebruik een scalpel om de ventrale huid van het oor langs de anti-helix van de muisoor te snijden. Verwijder de plakband van het oor met behulp van gebogen pincetten.
Verwijder voorzichtig de ventrale dermis en het kraakbeen van de dorsale dermis. Gebruik ringer's buffer om het oor te wassen om immunofluorescente kleuring uit te voeren. Breng primaire antilichamen die zich richten op extracellulaire matrixmoleculen in blokkeringsbuffer aan op het blootgestelde oor en plaats een dekglas erop.
Incubeer gedurende 15 minuten voordat u ongeveer vijf milliliter ringer's buffer gebruikt om het oor twee keer te wassen. Breng geschikte secundaire antilichamen of strep Aden aan in blokkeringsbuffer. Breng een dekglas aan en incubeer gedurende 15 minuten voordat u twee keer wast. Vouw zoals eerder de open dermale zone in de EM mencia conki en gebruik steriele doekjes om de buitenste ongeopende oordermis te drogen.
Plaats het oor op een stapel glazen platen en breng 0,5 microliter chirurgische lijm aan op de voorste en achterste dorsale randen om het te immobiliseren voor kortdurende beeldvorming van twee uur of minder. Voeg vers bereide steriele assorbaat ringer's buffer toe bovenop het geïmmobiliseerde oor en breng een dekglas aan. Gebruik vervolgens een fluorescente stereomicroscoop met een twee lens om het oor te beeldvormen.
Voor langdurige beeldvorming. Plaats de uitlaat van een naald die is bevestigd aan een reservoir met een assorbaat ringer's onder het dekglas, ongeveer 0,5 centimeter van het oor verwijderd. Gebruik een peristaltische pomp met een snelheid van één microliter per minuut om de buffer constant naar de kamer te leveren.
Open de acquisitiesoftware. Pas de fluorescentie-intensiteit, vergroting en belichtingstijd van het beeld aan, meerdere velden die tumorcellen bevatten, evenals gekleurde extracellulaire matrixeiwitten om intra vitale beeldvorming uit te voeren met behulp van multifotonmicroscopie met siliciumvet. Beginnend aan de basis van het oor.
Bouw een cirkelvormige muur van ongeveer twee centimeter diameter en twee tot drie millimeter hoogte rond het oor. Vul de cirkel met een sorbaat ringer's. Plaats de muis op het podium op een verwarmingskussen, ingesteld op 37 graden Celsius en configureer de instellingen van de microscoop volgens het tekstprotocol.
Zoals in deze figuur te zien is, kunnen veel structuren worden onderscheiden op basis van hun morfologie na immunokleuring. Voor basementmembraancomponenten zoals collageen vier of prolean, vooral structurele eiwitten die normaal niet kunnen worden gedetecteerd door SHG. De klassieke matrixdetectiemethode kan worden gevisualiseerd.
Bijvoorbeeld, we ontdekten dat tens en C worden afgezet op verschillende locaties van tumorstroma van fibrillaire collageenkrachten die zich on
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe intravitale immunofluorescentiemicroscopietechniek om de dynamiek van componenten van de extracellulaire matrix in tumorweefsel te visualiseren. Met behulp van muizen met melanomen beoogt het onderzoek de interacties tussen tumorcellen en hun micro-omgeving te verduidelijken.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Oncologie
Achtergrond
- De extracellulaire matrix (ECM) is van cruciaal belang bij wondgenezing, ontsteking en tumorigenese.
- Het begrijpen van de dynamiek van de ECM kan inzicht bieden in tumorprogressie.
- Intravitale beeldvorming maakt real-time observatie van cellulaire interacties mogelijk.
- Eerdere methoden boden onvoldoende mogelijkheden om ECM-componenten effectief te visualiseren.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het in vivo beelden van ECM-dynamiek.
- Om de interacties tussen tumorcellen en stromale cellen te bestuderen.
- Om inzicht te krijgen in hoe tumoren interageren met hun fysieke micro-omgeving.
Gebruikte methoden
- Inoculatie van muizen met GFP-expresserende B16 F10 melanoomcellen.
- Chirurgische blootstelling van tumorweefsel in de muisoor.
- Immunofluorescente kleuring van ECM-componenten.
- Gebruik van multi-fotonmicroscopie voor beeldvorming.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van dynamische interacties tussen tumorcellen en de ECM.
- Identificatie van specifieke ECM-componenten in de tumormicro-omgeving.
- Demonstratie van het vermogen van de methode om cellulaire dynamiek in real-time vast te leggen.
- Inzichten in de remodellering van de tumorvasculatuur.
Conclusies
- De ontwikkelde methode vergroot het begrip van de tumrobiologie.
- Het biedt een platform voor het beantwoorden van kernvragen in het kankeronderzoek.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze techniek om de rol van de ECM bij tumorprogressie te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Deze methode maakt directe visualisatie mogelijk van zowel fibrillaire als niet-fibrillaire componenten van de extracellulaire matrix in levend tumorweefsel, waarmee een kritisch hiaat wordt opgevuld in huidige beeldvormingsbenaderingen die primair vertrouwen op second harmonic generation voor de detectie van collageen. Door dynamische interacties tussen tumorcellen, stromale matrix en immuuncellen over langere perioden vast te leggen, biedt deze techniek mechanistische inzichten in tumorprogressie en therapierespons, die bijdragen aan targetvalidatie en strategieën voor preklinische risicoreductie. De mogelijkheid om matrixremodellering en cellulaire migratie longitudinaal te monitoren, ondersteunt voorspellende modellering van tumorgedrag en vasculaire veranderingen die relevant zijn voor de ontwikkeling van oncologische geneesmiddelen.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om tumor-stromale interacties te onderzoeken door de ruimtelijk verschillende depositie van matrixeiwitten, zoals tenascine C, ten opzichte van fibrillair collageen te visualiseren, wat bijdraagt aan de functionele validatie van targets.
- Operationele waarde: Biedt een platform voor live-imaging om in real-time te beoordelen hoe kandidaat-therapeutica de matrixremodellering en tumorcelmigratie beïnvloeden.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste read-outs van de lokalisatie en dynamiek van matrixeiwitten, wat standaardisatie van assays mogelijk maakt voor het screenen van verbindingen die op het stroma gericht zijn.
- Operationele waarde: Ondersteunt de reproduceerbare preparatie van immuungekleurd tumorweefsel voor consistente imaging read-outs over verschillende experimentele condities.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppelt matrixcontractie en vasculaire remodellering aan tumorprogressie, waardoor een ziekterellevant systeem wordt geboden voor de evaluatie van stroma-modulerende middelen.
- Operationele waarde: Faciliteert longitudinale beeldvorming (tot 12 uur) om de temporele dynamiek van immuuncelactivatie en tumorcelinvasie vast te leggen, wat risico-gecorrigeerde preklinische besluitvorming ondersteunt.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm door hypothese-gestuurde analyse van de dynamiek van de tumormicro-omgeving mogelijk te maken, van vroege targetvalidatie tot preklinische beoordeling van de werkzaamheid, in het bijzonder voor middelen die gericht zijn op stromale interacties of matrixdepositie.
- Discovery Biology: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door te visualiseren hoe tumorcellen migreren langs specifieke matrixcomponenten zoals collageen IV van het basaalmembraan, waardoor invasiepaden worden verduidelijkt.
- Screening: Maakt assay-ontwikkeling mogelijk via gestandaardiseerde immunofluorescente labeling en imaging van matrixeiwitten, wat kwantitatieve resultaten oplevert voor de evaluatie van het effect van verbindingen.
- Analytics: Genereert gemultiplexte fluorescentie-read-outs (bijv. GFP-tumorcellen, immunogekleurd tenascine C, SHG-collageen) die een vergelijkende analyse van stroma-tumorinteracties onder verschillende condities mogelijk maken.
- Translational Research: Verbindt matrixremodellering met vasculaire veranderingen en biedt een preklinisch model om stroma-gerichte therapieën te beoordelen met relevantie voor het menselijke tumorstroma.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare intravitale imaging-capaciteit voor longitudinale studies naar stromale en cellulaire dynamiek over meerdere oncologieprojecten heen.
Operationele en Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in tumor-stroma-interacties door directe visualisatie van niet-fibrillaire matrixcomponenten die onzichtbaar zijn voor conventionele SHG-gebaseerde methoden.
- Operationele waarde: Standaardiseert workflows voor weefselpreparatie, immunokleuring en beeldvorming voor reproduceerbare matrixanalyse van levende cellen in muismodellen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroegtijdige, matrix-opgeloste fenotypische gegevens te leveren over de effecten van verbindingen op tumorinvasie en stromale remodellering.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde voortgang van stroma-gerichte kandidaten door target engagement en micro-omgevingsfactoren in vivo aan te tonen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in muize tumor modellering, microsurgie voor blootstelling van oorweefsel en multiplex immunofluorescentiekleuring.
- Afhankelijk van toegang tot epifluorescentie- en twee-fotonmicroscopiesystemen met omgevingscontrole voor langdurige intravitale beeldvorming.
- Noodzaak tot standaardisatie van antilichaampanels en kleuringsprotocollen tussen laboratoria om reproduceerbare detectie van matrixeiwitten te garanderen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie naar verschillende tumormodellen en matrixdoelen buiten melanoom en tenascin C/collageen IV.
- Beperkt door het beeldvormingsvenster van 12 uur en potentiële fototoxiciteit, wat optimalisatie van laservermogen en bufferperfusie vereist voor uitgebreidere studies.
