Cel-gebaseerde therapie voor hartfalen bij Rat: Dubbele Thoracotomie voor myocardinfarct en Epicardiale Implantatie van Cellen en Biomatrix

Het doel van deze procedure is het uitvoeren van een dubbele thoracotomie bij ratten om coronaire ligatie en epicardiale applicatie mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door eerst een thoracotomie uit te voeren bij de vierde intercostale ruimte. Vervolgens wordt de linker anterior descending coronaire arterie of LAD geligeerd.

Vervolgens wordt twee weken later een tweede thoracotomie uitgevoerd ter hoogte van de vijfde intercostaalruimte. Ten slotte worden de cellen en de matrix aangebracht op het oppervlak van het kloppende, geïnfarceerde hart. Tot slot wordt echocardiografie uitgevoerd om de hartfunctie te beoordelen en wordt histologie uitgevoerd door middel van metingen van de infarctgrootte.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals sternotomie is dat het een minimaal invasieve benadering is die aantoont dat de procedure zal worden uitgevoerd door Lopez en collaborateurs uit ons laboratorium. Alle dieren werden behandeld in overeenstemming met de aanbevelingen van de F-E-L-A-S-A en de Zwitserse wet op de dierbescherming. Nadat een rat is bloedloos gemaakt en de dijbeenderen volgens het tekstprotocol zijn geïsoleerd en gereinigd, gebruikt u een schaar om beide uiteinden van de beenderen af te knippen.

Inject vervolgens steriel PBS in de kern van het bot om het beenmerg uit te spoelen en verzamel het merg in een buis van 15 milliliter. Centrifugeer het verzamelde beenmerg zeven minuten bij 300 ×g. Verwijder het supernatant en voeg drie milliliter lysebuffer voor rode bloedcellen toe. Resuspendeer de pellet en incubeer de suspensie één minuut bij kamertemperatuur voordat deze opnieuw zeven minuten bij 300 ×g wordt gecentrifugeerd.

Het resuspenderen van de pellet in steriel kweekmedium. Voeg extra celkweekmedium toe aan een kweekfles van 150 milliliter en zaai de cellen uit op de tweede dag van incubatie. Verschangel het medium om niet-adherente cellen te verwijderen en blijf het medium elke tweede dag vervangen gedurende twee tot drie weken totdat de gewenste celdichtheid is bereikt.

Om de eerste T-thoracotomie uit te voeren, begint u met het wegen van de rat en stelt u de ventilatorparameters dienovereenkomstig in. De uitstroom van de ventilatie wordt automatisch gedefinieerd. Scheer vervolgens het linkergedeelte van de thorax, zet een warmtemat aan en stel deze in op 37 °C.

Nadat de rat volgens het tekstprotocol is geanestheseerd, wordt er een knijptest bij de teen of staart uitgevoerd voordat de rat in rugligging op het warmtekussen wordt geplaatst. Intubeer het dier met een 14 gauge IV-katheter en sluit de intubatiekatheter vervolgens aan op een knaagdierventilator. Stel deze in op 2,5 liter per minuut zuurstof, 2,5% isofluraan, een tidal volume van 2 mL en een ademhalingsfrequentie van 90 ademhalingen per minuut. Bereid een spuit voor met buprenorfine 0,1 mg/kg voor subcutane toediening, injecteer één derde van de oplossing en desinfecteer vervolgens het gebied met een 1% Betadine-oplossing.

Maak vervolgens een incisie in de huid loodrecht op het sternum ter hoogte van de vierde intercostaalruimte en scheid de drie lagen borstspieren. Open daarna de vierde intercostaalruimte tussen de vierde en vijfde rib. Gebruik een kleine retractor om de ribben te spreiden en het hart bloot te leggen.

Open vervolgens voorzichtig het pericardium en lokaliseer de linker anterior descenderende coronaire arterie (LAD), en gebruik een 7.0 hechtdraad om deze vier millimeter onder het atrium af te binden. Controleer daarna de kleurverandering van het ischemische gebied met 3-0 hechtingen die bij benadering en distaal van het sternum zijn geplaatst. Zet twee hechtingen om de intercostale ruimte te sluiten.

Trek de distale hechting aan. Klem de uitlaatslang van de ventilator gedurende twee seconden om de borstkas op te blazen en pneumothorax te voorkomen. Trek vervolgens de tweede hechting aan.

Plaats de spierlagen terug op hun oorspronkelijke positie. Sluit vervolgens de huid met een 5-0 hechtdraad en 1% Betadine-oplossing. Desinfecteer de hechting en injecteer de resterende buprenorfine-oplossing.

Schakel het anesthesiesysteem uit en verwijder de intubatiekatheter. Houd de rat één tot twee uur in een kooi onder een warmtelamp voordat deze wordt teruggeplaatst in een IVC-eenheid. Twee weken na de eerste thoracotomie is de genezing voltooid en is het litteken nauwelijks zichtbaar.

Volg de eerder in deze video beschreven procedure voor het voorbereiden van de rat op de operatie en maak een incisie in de huid loodrecht op het sternum bij de vijfde intercostaalruimte. Scheid de drie spierlagen en open de vijfde intercostaalruimte tussen de vijfde en zesde rib. Gebruik een kleine retractor om de ribben te spreiden en het hart bloot te leggen.

Indien er sprake is van adhesies, gebruik dan een fijne pincet om deze voorzichtig te verwijderen. Lokaliseer vervolgens het infarctgebied, dat zichtbaar is als een bleek gebied onder de ligatuur. Indien nodig, breng dan een stukje 7-0 hechtdraad van 10 centimeter aan bij de apex en trek hier voorzichtig aan om de linker ventrikel beter in beeld te brengen.

Breng vervolgens de cellen en de matrix aan op het oppervlak van het ischemische gebied van het hart. Na het pelleten worden vier keer 10⁶ cellen, zoals beschreven in het tekstprotocol, op het hart geplaatst, waarna een fibrinisealant wordt gebruikt om deze te bedekken. De lijmlaag fixeert de cellen aan het hartoppervlak.

Nadat het stuk hechtdraad uit de apexpositie is verwijderd, worden de spierlagen weer op hun plaats gehecht en wordt het dier gedesinfecteerd. Zoals eerder in de video wordt aangetoond en hier wordt getoond. Na de chirurgische ingreep verloren de dieren gewicht en herstelden ze snel voordat ze weer aankwamen, onafhankelijk van de toegepaste behandeling. Zoals blijkt uit deze Kaplan-grafiek is de overlevingskans hoog na de eerste thoracotomie; dieren die behandeld zijn met fibrine en/of cellen vertoonden lagere overlevingskansen dan de andere groepen, zoals te zien is in deze grafiek.

Desalniettemin bleven de algehele overlevingspercentages hoog na een tweede thoracotomie en behandeling; de hartfunctie werd geëvalueerd via echocardiografie. Deze representatieve M-mode beelden van gezonde en geïnfarceerde dieren illustreren dat de contractiliteit van de LV-wand is verdwenen twee weken na de LAD-ligatie; de fractionele verkorting werd twee weken na de LAD-ligatie vastgelegd bij in totaal 104 dieren.

De frequentieverdeling laat redelijk reproduceerbare methoden zien met een variatiecoëfficiënt van 17%. Deze figuur toont een grafische weergave van de hartfunctie op basis van de gemeten ejectiefractie twee en zes weken na LAD-ligatie. De hartfunctie blijft in deze periode afnemen. Tijdens deze periode vindt er ook hartremodellering plaats, wat hier wordt weergegeven door een toename in LV-volumes gemeten in zowel systole als diastole. Ten slotte onthulde goudkleuring op hartcoupes dat er tegen zes weken na de LAD-ligatie fibrotisch weefsel en uiteindelijk een transmuraal litteken waren ontstaan. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in 30 tot 40 minuten worden uitgevoerd mits deze correct wordt uitgevoerd.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe een minimaal invasieve dubbele thoracotomie moet worden uitgevoerd.