BEST: Barcode Enabled Sequencing van Tetrads

Het algemene doel van deze procedure is om een groot aantal recombinante nakomelingen te verkrijgen uit een gistkruising op een manier die de informatie behoudt over welke nakomelingen afkomstig waren van dezelfde oorspronkelijke tetrade. Dit wordt bereikt door eerst de heterozygote diploïde stam die in de kruising wordt gebruikt te transformeren met een plasmidenbibliotheek die een tetrade-specifieke barcode en een sporulatie-specifieke fluorescente reporter bevat. De tweede stap is het overbrengen van de gebarcodeerde cellen naar sporulatiemedium.

Dit stelt de tetraden in staat om zich te vormen en induceert de expressie van de GFP-fluorescente reporter in tetraden, maar niet in cellen die niet sporuleren. Vervolgens scheidt een FACS-sorter de fluorescentielabelde tetraden van andere cellen en plaatst deze direct op een agarplaat, waar de buitenste laag van de tetraden enzymatisch wordt afgebroken. De laatste stap is het gebruik van glasparels om de sporen van de afgebroken tetraden te scheiden en te verspreiden over het oppervlak van de agarplaat, zodat elke spore een enkele kolonie kan vormen.

Uiteindelijk zullen de met deze methode verkregen stammen worden geg genotypeerd met gebruik van een high-throughput gemultiplexeerd DNA-sequencingprotocol, waarmee de tetra-specifieke barcode van elke stam wordt uitgelezen. De barcodes worden vervolgens gebruikt om elk van de vier stammen te identificeren die het resultaat zijn van een enkel meiotisch event. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals handmatige tetrade-dissectie met een micromanipulator, is dat één onderzoeker in slechts enkele uren meerdere duizenden recombinante nakomelingen kan isoleren.

De diploïde gistcellen die in deze studie zijn gebruikt, zijn eerder getransformeerd met een bibliotheek van gebarcodeerde plasmiden zoals beschreven in het bijbehorende manuscript en bewaard bij -80 °C om cellen uit de bevroren stokken te revitaliseren. Kweek deze gedurende de nacht in 5 mL YPD plus 200 µg/mL G418 bij 30 °C met agitatie. Was de cellen uit de nachtculturen drie keer in PBS en resuspendeer de cellen vervolgens tot een eindvolume van 2 mL in sporulatiemedium, plus 200 µg/mL.

Schud de sporulatieculturen bij kamertemperatuur. Controleer dagelijks de voortgang van de sporulatie totdat er geen nieuwe tetraden meer worden gevormd. Gewoonlijk duurt dit twee tot vier dagen nadat de culturen goed gevormde tetraden en relatief weinig dyaden bevatten.

Haal de culturen uit de agitatie en laat ze ten minste zeven dagen bij kamertemperatuur staan voordat de tetraden worden gesorteerd. Het meest uitdagende aspect van deze procedure is het verkrijgen van een goede scheiding van de sporen. We hebben empirisch vastgesteld dat het laten staan van de sporulerende culturen bij kamertemperatuur zonder agitatie gedurende ten minste een week vóór de tetradensortering de scheiding van de sporen aanzienlijk verbetert.

De tetraden uit de sporulatiecultuur kunnen worden gedetecteerd en geïsoleerd middels fluorescence-activated cell sorting of FACS, omdat de gebarcodeerde plasmiden in de diploïde cellen ook een sporulatiespecifiek GFP-fusie-eiwit dragen. Het hier beschreven protocol is ontwikkeld voor een FACS Aria II. Om deze procedure te starten, wordt de gesporuleerde cultuur in de FACS-sorter geladen en worden er twee forward scatter- en side scatter-gates ingesteld om debris, geaggregeerde cellen en meerdere cellen per druppel uit te sluiten.

Er zou een populatie fluorescerende cellen moeten zijn, die bij gebruik van het PS twee GFP-reporterconstruct dyaden en tetraden omvat; gebruik de GFP versus FSC-gate om deze fluorescerende events te selecteren. Afhankelijk van de stamachtergrond kan het nodig zijn om een extra gate toe te voegen om klonten te verwijderen die tetraden en andere cellen bevatten. Inspecteer een FSC-histogram van de fluorescerende events.

In dit voorbeeld zijn de events in de linkerpiek primair tetraden, en de events in de rechterpiek zijn over het algemeen tetraden met een aangehechte knop; pas een laatste gate toe die events met een lagere FSC bevat die hoofdzakelijk tetraden zijn, aangegeven door de rode balken. Controleer de efficiëntie van het gating-regime door ongeveer 1.500 tetraden op een microscoopglas te sorteren en de proportie tetraden ten opzichte van niet-tetraden te tellen. Met een fasecontrastmicroscoop bij een vergroting van 400 keer kan het percentage tetraden nauwkeurig worden geschat door slechts ongeveer 200 gesorteerde events te tellen, maar het sorteren van ongeveer 1.500 vermindert de tijd die wordt besteed aan het zoeken naar cellen op het microscoopglas.

Deze brightfield-beelden hebben een 600-voudige vergroting. Ze tonen voorbeelden van tetraden links en niet-tetraden rechts na de sortering. Controleer periodiek of de sorter het aantal events nauwkeurig rapporteert door 25 tetraden op een microscoopglaasje te sorteren en de cellen in de druppel te onderzoeken met een fasecontrastmicroscoop bij een 400-voudige vergroting.

Er zouden 25 tetraden in de druppel moeten zijn. Herhaal dit drie of vier keer om de variantie van het FACS-instrument in die run te beoordelen. Bereid de agarplaatjes voor deze procedure voor door het gewenste aantal YPD plus G four 18 plaatjes gedurende ten minste 1,5 uur op te warmen in een incubator van 37 °C die zich in de buurt van de FACS-sorter bevindt.

Een essentieel kenmerk van het sorteerprotocol is de mogelijkheid om via fax-sortering tetraden nauwkeurig naar een specifieke locatie op een agarplaat te richten die een pool van X-oplossing bevat. Plaats hiervoor eerst een landmark 96-wellplaat op de geautomatiseerde celdepositie-eenheid van de sorter. Stel vervolgens een sorteerlay-out op waarmee 25 tetraden in één well van een 96-wellplaat worden gesorteerd.

Sorteerformaat van 25 tetras per plaat levert goed gescheiden kolonies op. Kies een well nabij het midden van de plaat. Bijvoorbeeld well D5.

Breng een stapel van 10 agarplaten vanuit de incubator van 37 °C naar de sorteermachine. Neem één agarplaat en pipetteer 25 µL zy-oplossing op de agar nabij het centrum van de plaat. Plaats de plaat vervolgens op de landmark 96-well plaat, waarbij de X-druppel over het doelwit wordt uitgelijnd.

Dat was eerder gekozen. Nou, D vijf. Start de sortering en deponeer 25 tetras in het midden van de zy-druppel op de agarplaat.

Verwijder de plaat en dek deze af. Herhaal het sorteren voor elke plaat totdat er op elke plaat in de stapel 25 tetraden in zamo-druppels zijn gesorteerd. Plaats de stapel platen met tetraden terug in de incubator van 37 °C.

Breng de volgende stapel van 10 platen naar de sorteerder en herhaal de sorteerprocedure. Sporen kunnen worden gescheiden nadat de platen met agar die tetraden bevatten 1,5 uur zijn geïncubeerd bij 37 graden Celsius. Om deze procedure te starten, voegt u 15 tot 25 steriele glazen kraaltjes van drie millimeter toe aan elke plaat, en schudt u de platen als twee stapels van vijf platen gedurende drie tot vijf minuten.

De beste scheiding van sporen wordt bereikt door de platen stevig van links naar rechts of van voor naar achteren te bewegen. Beweeg de platen niet zodanig dat de kraaltjes langs de buitenrand van de plaat draaien. Laat de kraaltjes op de platen liggen wanneer u klaar bent.

Plaats de stapel platen met de kralen naar boven in een incubator van 30 °C. Haal de volgende stapel platen uit de incubator van 37 °C en herhaal de procedure voor sporenscheiding met behulp van de kralen. Incubeer alle platen de dag na de sporenscheiding een nacht bij 30 °C.

Haal de platen voorzichtig uit de incubator van 30 degrees Celsius zonder de glasparels te verstoren. Er zouden kleine kolonies op de platen gevormd moeten zijn. Verwijder de glasparels door de platen voorzichtig en snel om te keren boven een diepe bak.

Het tikken tegen de onderkant van de plaat terwijl deze is omgekeerd, kan helpen om kralen die aan de plaat kleven los te maken. De bakjes moeten diep genoeg zijn om de kralen op te vangen zonder dat ze omhoog springen en de agarplaat raken. Tel het aantal kolonies op elke plaat en gebruik dit aantal om de efficiëntie van de sporenscheiding en het herstel te schatten.

Bijvoorbeeld, 25 tetraden per plaat voor een kruising met een levensvatbaarheid van bijna 100% kan resulteren in een totaal van 100 kolonies per plaat, uitgaande van platen met een voldoende aantal kolonies, zoals meer dan 65 voor een hoge levensvatbaarheid. Transfer cellen van elke kolonie naar een aparte put van een 96-well plaat met YPD vloeistof plus G four 18. Noteer daarnaast welke putten kolonies van dezelfde agarplaat bevatten.

Deze informatie zal later worden gebruikt om de tetra-toewijzing te ondersteunen. Software best kan de snelheid waarmee sporen uit tetraden kunnen worden geïsoleerd, aanzienlijk verbeteren. Hoewel de huidige iteratie van de methode een zeker verlies aan efficiëntie vertoont vergeleken met handmatige dissectie, is de binomiale verdeling gebruikt om de verwachte fractie tetraden te berekenen met minstens één succesvol teruggewonnen spore die 1, 2, 3 of vier kolonies produceert, gebaseerd op de proportie van alle succesvol teruggewonnen sporen.

Deze grafiek kan dienen als een ruwe richtlijn voor het aantal stammen dat uiteindelijk zal worden samengevoegd tot drie of vier sporetetraden, zoals hier waargenomen. Het aantal teruggewonnen volledige tetraden neemt toe naarmate het aantal kolonies per plaat in deze studie toeneemt. 25 rads van over het hele bereik met een sporeviabiliteit van bijna 100%, zoals bepaald via handmatige dissectie, werden geplaatst op 149 agarplaten.

Het maximale aantal waargenomen kolonies per plaat was 80, wat aantoont dat 20 sporen geen afzonderlijke kolonies vormden. Het gemiddelde aantal kolonies per plaat was 62. Er werden 4.354 kolonies geoogst en gesequenced van 61 platen die 65 of meer kolonies bevatten. Van de 3.700 stammen die de kwaliteitscontrole voor sequencing doorstonden, konden er 2.665 of 72% computationeel worden toegewezen aan drie of vier sporetetraden nadat deze waren beheerst.

Deze techniek kan worden gebruikt om meer dan duizend tetraden per uur te verwerken. Hoewel u bij procedures die langer dan drie uur duren, assistentie nodig zult hebben.