Name: Capture Compound Massaspectrometrie - een krachtig hulpmiddel om het identificeren van nieuwe c-di-GMP effectoreiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Ontdek Capture Compound Mass Spectrometry om c-di-GMP-bindende eiwitten in bacteriën te identificeren met hoge specificiteit. Deze methode maakt rigoureuze wascondities mogelijk dankzij covalente kruisverbindingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Alberto Reinders voor zijn werk aan het optimaliseren van de CCMS-condities voor P. aeruginosa. We bedanken ook Pablo Manfredi voor de annotatie van de P. aeruginosa-eiwitten. Dit werk werd ondersteund door de Swiss National Science Foundation (SNF) Sinergia-subsidie CRSII3_127433.

1. Lysate Voorbereiding <ol><li> Groeien P. aeruginosa cellen in LB aan de gewenste OD. LET OP: Voor de begeleiding: gebruik ≈ 100 ml cultuur / monster voor stationaire fase culturen en ≈ 500 ml cultur / monster voor logfase culturen (OD 600 nm = 0,5). </li><li> Pellet door centrifugatie gedurende 20 min bij 5000 x g. </li><li> Hersuspendeer 0,5-1 g pellet in 1 ml lysis buffer (6,7 mM MES, 6,7 mM HEPES, 200 mM NaCl, 6,7 mM KAc, DDT 1 mM, pH 7,5) en voeg proteaseremmer (compleet mini, EDTA-vrij) alsook als DNasel. </li><li> Lyse de cellen door 3 passages door een Franse druk cel, 20.000 psi (zie Materials List). </li><li> Ultra-centrifuge het cellysaat bij 100.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C. </li><li> Sla het supernatant (ga naar stap 2). </li><li> Was de pellet met 1x lysis buffer 1 ml op en neer te pipetteren. </li><li> Ultracentrifuge bij 100.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C. </li><li> Flash-bevriezen de pellet invloeibare stikstof en bewaar bij -20 ° C tot gebruik voor de vangst van membraaneiwitten (zie stap 3). </li></ol> 2. verwijdering van vrije c-di-GMP en andere nucleotiden (oplosbare fractie Only) <ol><li> Was een PD10 ontzoutingskolom (zie Materials List) met 10 ml koude lysisbuffer. </li><li> Giet het supernatans (≈ 1 ml) op de PD10 om nucleotiden te verwijderen. </li><li> Elueer met 4 ml koude lysisbuffer (500 ui treden). </li><li> Selecteer de meest geconcentreerde fracties zoals bepaald door Bradford assay, en bundelen ze. </li></ol> 3. Pellet Resuspensie en Oplossen (membraanfractie Only) <ol><li> Resuspendeer de pellet in 500 tot 1000 pl 1x capture buffer (zonder detergens) (zie tabel 1). OPMERKING: De pellet is moeilijk te mengen. Het is aangeraden om eerst pipet op en neer met een pipet om ruwweg resuspendeer de pellet, dan naar een spuit 27 G gebruiken om goed te homogeniseren van de oplossing. </li><li> Voeg 1% (w / v) n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM). </li><li> Incubeer bij 4 ° C gedurende ten minste 2 uur (of O / N) op een roterend wiel. </li><li> Ultracentrifuge bij 100.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C. </li><li> Oogst van het bovenstaande. </li></ol> 4. Eiwit meting van de concentratie <ol><li> Meet de eiwitconcentratie van Bradford assay (door BCA assay voor de membraanfractie). </li><li> Stel het totale eiwitconcentratie 10 mg / ml. </li></ol> 5. Capture <ol><li> Meng 300 ug eiwit met 1 mM BBP, GTP, ATP, CTP, en 20 gl 5x capture buffer (100 mM HEPES, 250 mM KAc, 50 mM MgAc, 5% glycerol, pH 7,5) (Tabel 1). Stel het reactievolume van 100 ul met H2O Opmerking: het totale volume omvat het volume van de CDG-CC en C-di-GMP bij de controle concurrentie (zie stap 5.3 en Tabel 2). Opmerking: Alle experimenten werden uitgevoerd in 200 &amp;# 181; l 12-tube PCR-strips (Thermo Scientific). LET OP: voor het membraan fractie, zorg ervoor om altijd de DDM concentratie boven de kritische micel concentratie (0,01% w / v) totdat het eiwit solubilisatiestap in 8 M ureum (Stap 7.1). </li><li> Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 min op een roterend wiel. </li><li> Voeg 10 uM CDG-CC (eindconcentratie). OPMERKING: onder controle zonder CDG-CC (aangeduid als &quot;bead control&quot;), en een controle aangevuld met 1 mM c-di-GMP (&quot;competitie control&quot;) (zie tabel 2). OPMERKING: de CDG-CC concentratie kan worden ingesteld van 1 tot 10 uM. </li><li> Incubeer bij 4 ° C gedurende ten minste 2 uur (O / N voor de membraanfractie) op een roterend wiel in het donker. </li><li> Na een korte centrifuge, verknopen door activering van de reactieve eenheid van de CDG-CC met UV-licht gedurende 4 minuten, met behulp van een CaproBox (zie Materials List, λ = 310 nm, Bestralingssterkte ≥10 mW / cm², afstand van de bron = 2 cm). OPMERKING: verwijder het deksel van de stroken voorafgaande verknoping. </li><li> Voeg 25 ul 5x wasbuffer (5 M NaCl, 250 mM Tris, pH 7,5) en 50 pi goed geresuspendeerde streptavidine magnetische korrels, zacht homogeniseren. </li><li> Incubeer bij 4 ° C gedurende 1 uur op een roterend wiel. </li></ol> 6. Wassen Stappen LET OP: (Magnet: zie Materials List). Begin met een capture van de magnetische korrels in de PCR strip deksel, met de magneet. Vervang dan de PCR-strip door een nieuwe met daarin de volgende wasbeurt oplossing. Verwijder de magneet en resuspendeer de kralen en incubeer 2 minuten. Spin down en plaats het deksel door een frisse deksel. <ol><li> Wassen stappen (oplosbare fractie alleen) <ol><li> Spoel 6 keer in 200 gl 1 x wasbuffer. </li><li> Was eenmaal met 200 ui HPLC kwaliteit H2O </li><li> Spoel 6 keer in 200 pl 80% acetonitril. </li><li> Was 2 keer in 200 pl HPLC kwaliteit H2O </li></ol></li><li> Wassen stappen (membrane fractie alleen) <ol><li> Was 5 keer in 200 gl 1 x wasbuffer + 0,1% DDM. </li><li> Was 2 keer in 200 gl 1 x wasbuffer + 0,05% DDM. </li><li> Was eenmaal met 200 ui 1 x wasbuffer + 0,025% DDM. </li><li> Was eenmaal in 200 ul 1x wassen buffer + 0,0125% DDM. </li><li> Was 3 maal in 200 ul 100 mM ABC (ammoniumbicarbonaat, NH4 CO 3) + 2 M ureum. </li></ol></li></ol> 7. MS Monstervoorbereiding <ol><li> Resuspendeer de kralen (direct in het deksel) in 20 pi 100 mM ABC (100 mM ABC + 8 M ureum voor de membraanfractie) en zetten in 1,5 ml buizen. </li><li> Alleen membraanfractie: incuberen bij 60 ° C gedurende 5 minuten schudden bij 500 rpm. </li><li> Voeg 0,5 gl 200 mM TCEP (tris (2-carboxyethyl) fosfine) en incubeer bij 60 ° C gedurende 1 uur schudden bij 500 rpm. Afkoelen tot 25 ° C. </li><li> Voeg 0,5 ul van vers bereide 400 mM joodacetamide en incubeer bij 25 ° C gedurende 30 min schudden van eenT 500 rpm en in het donker. </li><li> Voeg 0,5 gl 0,5 M N-acetyl-cysteïne en incubeer bij 25 ° C gedurende 10 minuten schudden bij 500 rpm. </li><li> Membraanfractie slechts: voeg 1 pl Lys-C en incubeer bij 37 ° C, O / N. </li><li> Voeg 2 ug trypsine en incubeer O / N bij 37 ° C, onder schudden bij 500 rpm (wrap in Parafilm om uitdroging te voorkomen). OPMERKING: de monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C in dit stadium. OPMERKING: membraanfractie alleen: voeg 100 mM ABC aan de ureumconcentratie op &lt;2 M te passen voor toevoeging van trypsine. </li><li> Kort spin down de buizen en het verzamelen van kralen met de magneet. </li><li> Breng de bovenstaande in een nieuwe 1,5 ml buis (herhaal deze stap over als kralen worden gelaten). </li><li> Voeg 5 ul 5% TFA (trifluorazijnzuur) + 1 gl 2 M HCl (15 pl 5% TFA + 5 gl 2 M HCl gedurende de membraanfractie). </li><li> Voorwaarde C18 MicroSpin kolommen (The Nest Group, MA, USA) met 150 ul acetonitril (spin 20 sec bij 2.400 tpm). </li><li> Equitrillen de C18 kolommen 2 maal met 150 ui 0,1% TFA (spin 20 sec, 2400 rpm). </li><li> Laad het monster en spin 2 min, 2000 rpm. </li><li> Laad de doorstroming op de kolom en herhaal de draaiende stap (2 min, 2000 rpm). </li><li> Was 3 maal met 150 ui 0,1% TFA, 5% azijnzuurnitril (20 sec, 2400 rpm). </li><li> Neem een ​​nieuwe buis en elueer tweemaal met 150 pl 0,1% TFA, 50% acetonitril (2 min, 2000 rpm). </li><li> Droog de peptiden in een speed-vac. </li><li> Resuspendeer in 40 ui 98% H2O, 2% acetonitril, 0,15% mierenzuur. </li><li> Sonicaat 20 sec (pulscyclus 0.5, amplitude 100%; zie Materials List) en spin down 5 sec, 12.000 rpm (tafelcentrifuge). Vortex 10 sec, en spin down 5 sec, 12.000 rpm. Transfer in een HPLC flesje voor LC-MS / MS analyse. </li><li> Invriezen bij -20 ° C. OPMERKING: de monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C in dit stadium. </li></ol> 8. LC-MS / MS-analyse <ol><li> Voer een nano-LC (nano-LC-systemen) equipped met een RP-HPLC-kolom (75 urn x 37 cm) gepakt met C18 hars (Magic C18 AQ 3 urn) met een lineaire gradiënt van 95% oplosmiddel A (0,15% mierenzuur, 2% acetonitril) en 5% solvent B ( 98% acetonitril, 0,15% mierenzuur) tot 35% oplosmiddel B over 60 minuten bij een stroomsnelheid van 0,2 ul / min. </li><li> Analyseer de peptiden met LC-MS / MS (dubbeldrukschakelaar LTQ-Orbitrap Velos massaspectrometer verbonden met een electrospray ionenbron). OPMERKING: De data acquisitie actief was een hoge resolutie MS scannen in de FT van de massa spectrometer met een resolutie van 60.000 FWHM gevolgd door MS / MS scans in de lineaire ionenval van de 20 meest intense ionen te verkrijgen. Om de efficiëntie van MS / MS pogingen te verhogen, werd de geladen toestand screening modus ingeschakeld toegewezen te sluiten en alleen laadt ionen. Collusie geïnduceerde dissociatie werd geactiveerd als de voorloper overschreden 100 ion telt. De dynamische duur uitsluiting werd ingesteld op 30 sec. De ion-accumulatie tijd was ingesteld op 300 msec (MS) en 50msec (MS / MS). </li></ol> 9. Database Zoeken <ol><li> Download de P. aeruginosa NCBI-databank via de NCBI homepage ( <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/</a> ). </li><li> Omzetten van de MS ruwe spectra in mascotte generieke bestanden (MGF) met behulp van de MassMatrix conversie-tool ( <a href="http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py">http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py</a> ). </li><li> Zoek door deze mgf bestand met behulp van MASCOT versie 2.3 ten opzichte van de P. aeruginosa NCBI-database met daarin vooruit en achteruit-decoy eiwit inzendingen. </li><li> Voer een in silico trypsinedigestie na lysine en arginine (tenzij gevolgd door proline) tolereren twee gemiste breuklijnen in volledig tryptische peptiden. </li><li> Stel de database aan naar geoxideerd methionines (15,99491 Da) als variabele wijzigingen en carboxyamidomethylation (57,021464 Da) van cysteïne residuen als vaste modificatie mogelijk te maken. Voor MASCOT zoekt onsing hoge-resolutie scans, stel de voorloper massa tolerantie tot 15 ppm en stel het fragment massa tolerantie tot 0,6 Da. Tenslotte stelt het eiwit FDR tot 1%. </li><li> Importeer de Mascot zoekopdrachten van P. aeruginosa CCMS experimenten in Steiger (Proteomesoftware, versie 3), de parameters aan een eiwit FDR dicht bij 1% te verkrijgen, en haal de totale spectrale telt. </li><li> Voor de representatieve resultaten in dit document, gebruikten we een gepaarde T-test om te vergelijken het experiment met de controle concurrentie, en alleen beschouwd hits met een p-waarde van minder dan 0,1, en ​​een spectrale telling verhouding boven de 2 (experimenteren spectrale tellingen / competition controle spectrale tellingen). </li><li> Gegevens kunnen worden geëxporteerd in een spreadsheet-software voor verdere analyse. </li></ol> 10.-Label gratis Kwantificering <ol><li> Importeer de raw-bestanden in Progenesis LC-MS-software (niet-lineaire dynamica, Versie 4.0). </li><li> Voeren LC-MS uitlijning en functie detectie in gebreke settiNGS. </li><li> De gegevens in MGF-formaat te exporteren uit Progenesis LC-MS. </li><li> Zoeken in de MS / MS spectra met behulp van de MASCOT tegen de NCBI P. aeruginosa database met daarin vooruit en achteruit-decoy eiwit inzendingen. </li><li> De database zoekresultaten in Progenesis LC-MS te importeren en in kaart de peptiden identificaties te MS1 functies. </li><li> Voor de evaluatie van gegevens (berekening van betekenis niveaus, vouw-verandering ratio) de ProteinSQAnalysis script van SafeQuant werd gebruikt (drempel: q-waarde onder de 0,1, spectrale telling verhouding boven de 2). </li></ol>

<ol><li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).</li>
<li>Hengge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+c-di-GMP+signalling+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Principles of c-di-GMP signalling in bacteria.</a> Nature reviews. Microbiology. 7, 263-273 (2009).</li>
<li>Sondermann, H., Shikuma, N. J., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((You%27ve+come+a+long+way%3A+c-di-GMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">You've come a long way: c-di-GMP signaling.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 140-146 (2012).</li>
<li>Schirmer, T., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+mechanistic+determinants+of+c-di-GMP+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signalling.</a> Nature reviews. Microbiology. 7, 724-735 (2009).</li>
<li>Furukawa, S., Kuchma, S., O'Toole, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+their+options+open%3A+acute+versus+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Keeping their options open: acute versus persistent infections.</a> J. Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).</li>
<li>Christen, M., Christen, B., Folcher, M., Schauerte, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+cyclic+di-GMP-specific+phosphodiesterase+and+its+allosteric+control+by+GTP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a cyclic di-GMP-specific phosphodiesterase and its allosteric control by GTP.</a> J. Biol. Chem. 280, 30829-30837 (2005).</li>
<li>Ryan, R. P., Fouhy, Y., Lucey, J. F., Dow, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+di-GMP+signaling+in+bacteria%3A+recent+advances+and+new+puzzles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cyclic di-GMP signaling in bacteria: recent advances and new puzzles.</a> J. Bacteriol. 188, 8327-8334 (2006).</li>
<li>Habazettl, J., Allan, M. G., Jenal, U., Grzesiek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structure+of+the+PilZ+domain+protein+PA4608+complex+with+cyclic+di-GMP+identifies+charge+clustering+as+molecular+readout%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Solution structure of the PilZ domain protein PA4608 complex with cyclic di-GMP identifies charge clustering as molecular readout.</a> J. Biol. Chem. 286, 14304-14314 (2011).</li>
<li>Fazli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRP%2FFNR+family+protein+Bcam1349+is+a+c-di-GMP+effector+that+regulates+biofilm+formation+in+the+respiratory+pathogen+Burkholderia+cenocepacia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The CRP/FNR family protein Bcam1349 is a c-di-GMP effector that regulates biofilm formation in the respiratory pathogen Burkholderia cenocepacia.</a> Molecular Microbiology. 82, 327-341 (2011).</li>
<li>Hickman, J. W., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FleQ+from+Pseudomonas+aeruginosa+as+a+c-di-GMP-responsive+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a c-di-GMP-responsive transcription factor.</a> Molecular Microbiology. 69, 376-389 (2008).</li>
<li>Sudarsan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riboswitches+in+eubacteria+sense+the+second+messenger+cyclic+di-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP.</a> Science. 321, 411-413 (2008).</li>
<li>Lenz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+methyltransferases+and+other+S-adenosyl-L-homocysteine-binding+Proteins+by+Capture+Compound+Mass+Spectrometry+%28CCMS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Profiling of methyltransferases and other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS).</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Köster, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+compound+mass+spectrometry%3A+a+technology+for+the+investigation+of+small+molecule+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions.</a> Assay Drug Dev Technol. 5, 381-390 (2007).</li>
<li>Düvel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+proteomics+approach+to+identify+c-di-GMP+binding+proteins+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">A chemical proteomics approach to identify c-di-GMP binding proteins in Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Microbiological Methods. 88, 229-236 (2012).</li>
<li>Christen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+control+of+cyclic+di-GMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Allosteric control of cyclic di-GMP signaling.</a> J. Biol. Chem. 281, 32015-32024 (2006).</li>
<li>Balasubramanian, D., Mathee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transcriptome+analyses+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Human+genomics%22%5BJournal%5D)">Comparative transcriptome analyses of Pseudomonas aeruginosa.</a> Human genomics. 3, 349-361 (2009).</li>
<li>Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+models+and+empirical+bayes+methods+for+assessing+differential+expression+in+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Stat+Appl+Genet+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments.</a> Stat Appl Genet Mol Biol. 3 (3), (2004).</li>
<li>Baraquet, C., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+diguanosine+monophosphate+represses+bacterial+flagella+synthesis+by+interacting+with+the+Walker+A+motif+of+the+enhancer-binding+protein+FleQ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cyclic diguanosine monophosphate represses bacterial flagella synthesis by interacting with the Walker A motif of the enhancer-binding protein FleQ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18478-18483 (2013).</li>
<li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).</li>
<li>Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15528-15533 (2011).</li>
<li>DeSantis, K., Reed, A., Rahhal, R., Reinking, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+differential+scanning+fluorimetry+as+a+high-throughput+assay+to+identify+nuclear+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+receptor+signaling%22%5BJournal%5D)">Use of differential scanning fluorimetry as a high-throughput assay to identify nuclear receptor ligands.</a> Nuclear receptor signaling. 10, e002(2012).</li>
<li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+thermophoresis+quantifies+biomolecular+interactions+under+previously+challenging+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions.</a> Methods. 59, 301-315 (2013).</li>
<li>Merighi, M., Lee, V. T., Hyodo, M., Hayakawa, Y., Lory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+messenger+bis-%283%E2%80%98-5%E2%80%99%29-cyclic-GMP+and+its+PilZ+domain-containing+receptor+Alg44+are+required+for+alginate+biosynthesis+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The second messenger bis-(3‘-5’)-cyclic-GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa.</a> Molecular Microbiology. 65, 876-895 (2007).</li>
<li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+cyclic+diguanylate+in+the+non-catalytic+EAL+domain+of+FimX+induces+a+long-range+conformational+change%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding of cyclic diguanylate in the non-catalytic EAL domain of FimX induces a long-range conformational change.</a> J. Biol. Chem. 286, 2910-2917 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Speciale aandacht moet worden genomen op verschillende stappen van het protocol. De eiwitconcentratie is een kritische parameter met een concentratie van 10 mg / ml moeilijk te bereiken wanneer de cellen worden gekweekt onder specifieke kweekomstandigheden (bijvoorbeeld biofilms of kleine kolonie varianten). Aldus zullen pellet resuspensie worden uitgevoerd in een klein volume lysisbuffer. Proteïne concentraties worden verlaagd tot 8 mg / ml. Vergeleken met de werkwijze gepubliceerd door Nesper et al. ...

c-di-GMP is een belangrijke tweede messenger gebruikt door de meeste bacteriën diverse aspecten van hun groei en gedrag beheersen. Bijvoorbeeld, c-di-GMP reguleert celcyclus, motiliteit en de expressie van exopolysacchariden en oppervlak adhesinen 2-4. Door de coördinatie van dergelijke werkwijzen c-di-GMP bevordert biofilmvorming, een proces dat is geassocieerd met chronische infecties van verschillende pathogene bacteriën 5. c-di-GMP wordt gesynthetiseerd door enzymen genaamd diguanylate cyclases (DGCs) dat een katalytische GGDEF domein 4 haven. Sommige DGCs bezitten een remmende site die naar beneden regelt de cyclase activiteit op c-di-GMP bindend. De afbraak van c-di-GMP wordt gekatalyseerd door twee verschillende klassen van fosfodiësterases (PDE) herbergen ofwel een katalytische EAL of HD-GYP domein 6,7. De meeste bekende effector eiwitten die direct binden c-di-GMP behoren tot één van drie klassen van eiwitten: katalytischebondgenoot inactief GGDEF of EAL domeinen en Pilz domeinen, kleine moleculaire schakelaars die vormveranderingen op c-di-GMP bindend 8 ondergaan. DGCs, PDE&#39;s en Pilz eiwitten zijn goed gekarakteriseerd en hun domeinen kunnen worden voorspeld in silico relatief veilig. Een bijzonder belang is nu gericht op de identificatie van nieuwe klassen van c-di-GMP effectoren. Sommige c-di-GMP effectoren met verschillende bindingsmotieven werden onlangs zoals beschreven als de CRP / Achterwaarts- eiwit familie Bcam1349 in Burkholderia cenocepacia of de transcriptionele regulator FleQ in P. aeruginosa 9,10. Bovendien werden c-di-GMP-specifieke riboswitches recent geïdentificeerd en naar genexpressie in een C-di-GMP-afhankelijke wijze 11. De c-di-GMP binding motieven van verschillende effectoren worden alleen slecht geconserveerd maken bioinformatic voorspellingen van dergelijke eiwitten moeilijk. Om dit probleem, een biochemische werkwijze, die is gebaseerd op het gebruik van een c-di-GMP spe ontwikkelden wefieke Capture Compound in combinatie met massaspectrometrie 1,12,13. We hebben onlangs een nieuw ontworpen driewaardig c-di-GMP invangverbinding (CDG-CC figuur 1) 1. Deze chemische steiger bestaat uit: 1) een C-di-GMP eenheid gebruikt als aas voor c-di-GMP vangen bindende eiwitten, 2) een UV-licht activeerbare reactieve groep gebruikt verknopen de CDG-CC de gebonden eiwitten en 3) een biotine aan de gevangen eiwitten met streptavidine beklede magnetische korrels isoleren. De CDG-CC kan worden gebruikt om direct en specifiek vangen c-di-GMP effectoren van complex mengsel van macromoleculen zoals cellysaten. Invangverbinding gebaseerde chemische proteomics benaderingen zijn eerder gerapporteerd toepasbaar is op een groot aantal organismen, bijvoorbeeld Caulobacter crescentus, Salmonella enterica serovar typhimurium en P. aeruginosa 1,14. In deze methodologische paper,Wij bieden een diepgaande beschrijving van het CCMS procedure met behulp van extracten van P. aeruginosa als voorbeeld. Deze studie stelt CCMS als een krachtige en veelzijdige tool om biochemisch nieuwe componenten betrokken bij kleine molecule signalering te identificeren.

<table><tbody><tr><td>caproBox</td><td>caprotec bioanalytics</td><td>1-5010-001 (220 V)</td><td>UV-lampen gekoppeld aan een koelblok voor 96-platen, voor de fotoactivering</td></tr><tr><td>caproMag</td><td>caprotec bioanalytics</td><td>inbegrepen in het CCMS Starter Kit</td><td>Voor eenvoudig hanteren van magnetische deeltjes zonder pipetteren</td></tr><tr><td>c-di-GMP caproKit</td><td>caprotec bioanalytics</td><td>op aanvraag</td><td>De kit bevat het c-di-GMP-capturing compound, c-di-GMP (voor de concurrentiecontrole), met streptavidin bedekte magnetische kralen, capture buffer en wasbuffer</td></tr><tr><td>Disposable PD-10 Desalting Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>12-tube PCR strips</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1114</td><td></td></tr><tr><td>UIS250v sonicator met VialTweeter</td><td>Hielscher ultrasound technologie</td><td>UIS250v en VialTweeter</td><td></td></tr><tr><td>Miniatuur French Pressure Cell</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>FA-003</td><td></td></tr></tbody></table>

capture compound massaspectrometrie - een krachtig hulpmiddel om het identificeren van nieuwe c-di-gmp effectoreiwitten

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Aanzienlijke vooruitgang is geboekt in het afgelopen decennium in de richting van de identificatie en karakterisering van enzymen die betrokken zijn bij de synthese (diguanylate cyclases) en afbraak (fosfodiesterasen) van de tweede boodschapper c-di-GMP. Daarentegen weinig informatie beschikbaar is over de moleculaire mechanismen en cellulaire componenten waardoor deze signalering molecuul regelt een breed scala van cellulaire processen. De meeste van de bekende effector-eiwitten behoren tot de familie Pilz of zijn gedegenereerd diguanylate cyclases of fosfodiesterases die op katalyse hebben gegeven en effector functie hebben aangenomen. Dus, om beter de cellulaire c-di-GMP netwerk definiëren diverse bacteriën experimentele vereist om nieuwe effectoren die betrouwbaar silico voorspellingen niet identificeren en te valideren. We hebben onlangs een nieuwe Capture Compound massaspectrometrie (CCMS) gebaseerde technologie als een krachtig instrument om ontwikkeldbiochemisch identificeren en karakteriseren van c-di-GMP-bindende eiwitten. Deze techniek is eerder gerapporteerd voor diverse organismen 1 is. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van het protocol dat we gebruiken om dergelijke signaleringscomponenten sonde. Als voorbeeld, gebruiken we Pseudomonas aeruginosa, een opportunistisch pathogeen, waarbij c-di-GMP speelt een cruciale rol in virulentie en biofilm controle. CCMS geïdentificeerd 74% (38/51) van de bekende of voorspelde elementen van de C-di-GMP netwerk. Deze studie legt de CCMS procedure in detail, en stelt het als een krachtige en veelzijdige tool om nieuwe componenten betrokken bij kleine molecule signalering te identificeren.

Om nieuwe C-di-GMP effectoren in P. identificeren aeruginosa we systematisch gebruikt CCMS om de oplosbare en membraan fracties van P. analyseren aeruginosa stam PAO1 uit een log-fase cultuur (OD 600 = 0,5). Hier samenvatten en bespreken we representatieve resultaten van deze vissen expeditie. Vier onafhankelijke biologische replica&#39;s werden gebruikt. Voor elk experiment twee CDG-CC concentraties werden gebruikt (5 uM en 10 uM). Sonderen van specificiteit werden experim...

De alomtegenwoordige tweede boodschapper c-di-GMP controleert de groei en het gedrag van veel bacteriën. We hebben een nieuwe Capture Compound Mass Spectrometry-gebaseerde technologie ontwikkeld om c-di-GMP-bindende eiwitten biochemisch te identificeren en te karakteriseren in vrijwel elke bacteriesoort.

Capture Compound Massaspectrometrie - een krachtig hulpmiddel om het identificeren van nieuwe c-di-GMP effectoreiwitten

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Het algemene doel van het capture compound mass spectrometry experiment is om cyclische die GMP-bindende eiwitten te vangen en te identificeren. Dit wordt bereikt door een celcultuur te fractioneren met behulp van een French press en het vrije cyclische die gmp te verwijderen. Met behulp van een PD 10-kolom als tweede stap, wordt het capture compound toegevoegd en geactiveerd door UV-licht om de cyclische die GMP-bindende eiwitten covalent te cross-linken die aan het capture compound zijn gebonden in afwezigheid of aanwezigheid van een overmaat aan vrije cyclische die GMP.Vervolgens wordt het capture compound gebonden aan met streptavidin gecoate magnetische kralen om de gevangen eiwitten intensief te wassen. Ten slotte worden de gevangen eiwitten verteerd en voorbereid voor massaspectrometrie om de gegenereerde peptiden te identificeren. Resultaten worden vervolgens in silico geanalyseerd. Het belangrijkste voordeel van CCMS ten opzichte van onze bestaande methoden zoals co-precipitatie, is dat het capture compound de specifieke opname van directe partners verbetert en harde wascondities mogelijk maakt dankzij de covalente kostenverbinding.Nu kan deze methode inzicht geven in bacteriële cyclische di GMP-signalering. Het kan ook worden toegepast op andere systemen zoals nucleotide-signalering in het algemeen en vrijwel elke molecuul die wordt gevoed naar het capture compound. Voordat u met deze procedure begint, bereidt en lyst u p aerogen-cellen door een French pressure cellen ultra ultracentrifuge de cel lysate bij 100.000 keer G gedurende een uur bij vier graden Celsius.Na het bewaren van het supernatant, wast u de pellet met één milliliter van één x lysis buffer door op en neer te pipetten na ultracentrifugatie onder dezelfde omstandigheden als voorheen. Bevries de pellet snel in vloeibare stikstof en bewaar het bevroren monster op min 20 graden Celsius tot het wordt gebruikt voor de opname van membraaneiwitten. Volg deze wassing met een PD 10 desalting kolom met 10 milliliters koude lysis buffer.Pour de supra natant op de PD 10 om nucleotiden te verwijderen, en eluteer met vier milliliters koude lysis buffer in 500 microliter incrementen. Gebruik de Bradford-test om de meest geconcentreerde fracties te bepalen. Pool vervolgens de geselecteerde fracties in een 1,5 milliliter buis Resus.Suspenseer de eerder opgeslagen pellet in 500 tot 1000 microliters van één x opname buffer zonder detergent. Voeg een 1% gewicht per volume oplossing van end doil Beta D multi purin azijde toe aan het monster. Vervolgens incubeert u het monster gedurende ten minste twee uur op een roterende wiel bij vier graden Celsius.Wanneer u klaar bent, ultracentrifugeert u het monster gedurende 100.000 keer G gedurende een uur bij vier graden Celsius. Na ultracentrifugatie, brengt u het supernatant over naar een nieuwe 1,5 milliliter buis. Op dit punt, mengt u 300 microgram eiwit met één millimolar van G-D-P-G-T-P-A-T-P-C-T-P, en 20 microliters van vijf x opname buffer.Pas het reactievolume aan tot 100 microliter met water. Na het incuberen van het monster bij vier graden Celsius op een roterende wiel, voegt u 10 micromolar van cyclische die GMP capture compound toe. Vervolgens incubeert u het monster gedurende ten minste twee uur voor de oplosbare fractie of 's nachts voor de membraanfractie bij vier graden Celsius op een roterende wiel in het donker.Na een korte spin en verwijdering van het deksel, cross-linkt u door activering van de reactieve groep van het cyclische die GMP capture compound met UV-licht gedurende vier minuten met behulp van een cap row box. Voeg vervolgens 25 microliters van vijf x wasbuffer en 50 microliters van goed gesuspendeerde strep AVID in magnetische kralen toe. Homogeniseer het monster voorzichtig.Vervolgens incubeert u het monster gedurende een uur bij vier graden Celsius op een roterende wiel. Nadat u de kralen in het deksel met een magneet hebt vastgelegd, wast u de oplosbare fracties zes keer in 200 microliters van één X wasbuffer na een wasbeurt in 200 microliters van HPLC-kwaliteitswater. Was zes keer in 200 microliters van 80% acetonitril en twee keer in 200 microliters van HPLC-kwaliteitswater voor de membraanfractie. Was vijf keer in 200 microliters van één X wasbuffer en afnemende concentraties van end doil beta D multi puric azijde. Resuspensie de kralen vervolgens in 20 microliters van 100 millimolar ammoniumbicarbonaat voor de oplosbare fractie en 100 millimolar ammoniumbicarbonaat plus acht molaire ureum.Voor de membraanfractie, brengt u elke suspensie over in 1,5 milliliter buizen. Na het incuberen van de membraanfractie, voegt u 0,5 microliters van 200 millimolar tris. Twee carboxy ethyl fosfine toe aan beide fracties en incubeert u bij 60 graden Celsius gedurende een uur met schudden bij 500 RPM.Zodra de monsters zijn afgekoeld tot 25 graden Celsius, voegt u 0,5 microliters van vers bereid 400 millimolar I oto acetamide toe na incubatie in het donker. Voeg 0,5 microliters van 0,5 molar en acetylcysteïne toe aan elke fractie. Vervolgens incubeert u de monsters gedurende 10 minuten bij 25 graden Celsius met schudden bij 500 RPM.Op dit punt, voegt u één microliter van LY C toe aan de membraanfractie na overnachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius. Voeg twee microgram trypsine toe aan elk monster en wikkel ze in paraform om uitdroging te voorkomen. Na incubatie en het naar beneden spinnen van de monsters, brengt u het supernatant over in een nieuwe 1,5 milliliter buis met behulp van de magneet om de kralen te vermijden.Vervolgens voegt u vijf microliters van 5% trichloroazijnzuur en één microliter van twee molair zoutzuur toe aan de oplosbare fractie, voegt u 15 microliters van 5% trichloroazijnzuur en vijf microliters van twee molair zoutzuur toe aan de membraanfractie. C 18 micro spin kolommen met 150 microliters van acetonitril door 20 seconden te spinnen bij 2.400 RPM. Zodra de kolommen twee keer zijn geëquilibre

capture-compound-mass-spectrometry-powerful-tool-to-identify-novel-c

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Massaspectrometrie heeft bewezen een waardevol instrument voor het analyseren van grote eiwitcomplexen worden. Deze methode maakt het mogelijk inzicht in de samenstelling, de stoichiometrie en de algemene structuur van multi-subunit assemblages. We beschrijven hier, stap-voor-stap hoe u een structurele massaspectrometrie analyse uit te voeren, en karakteriseren macromoleculaire structuren.

Het analyseren van grote eiwitcomplexen de Structuurfondsen massaspectrometrie

Capture Verbindingen zijn trifunctionele kleine moleculen om de complexiteit van het proteoom te verminderen door functionele omkeerbare klein molecuul-eiwit interacties, gevolgd door foto-crosslinking en zuivering. Hier gebruiken we een Capture Compound...

Profilering van methyl-en andere S-Adenosyl- L-Homocysteine-bindende eiwitten door Capture Compound-massaspectrometrie (CCMS)

Stabiele Isotopen Normen en Capture door Anti-peptide antilichamen (SISCAPA) paren affiniteit verrijking van peptiden met stabiele isotoop verdunning massaspectrometrie (MRM-MS) voor kwantitatieve meting van peptiden te bieden als surrogaat voor hun respectievelijke eiwitten. Hier beschrijven we het protocol met behulp van magnetische deeltjes in een deels geautomatiseerde formaat.

Kwantificering van eiwitten met behulp van immuno-peptide Verrijking gekoppeld aan massaspectrometrie

Wij presenteren een variatie van de QUICK (kwantitatieve Immunoprecipitatie combinatie met Knockdown) benadering die eerder werd onderscheid te maken tussen echte en valse eiwit-eiwit interacties. Onze aanpak is gebaseerd...

Een protocol voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties op basis van<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling, Immunoprecipitatie, kwantitatieve Massaspectrometrie en Affiniteit Modulatie

Een verbeterde polymerasekettingreactie-restrictiefragment lengte polymorfisme werkwijze voor genotyperen kogelvis soorten van vloeistofchromatografie / massaspectrometrie beschreven. Een omgekeerde-fase-silica monoliet kolom wordt toegepast voor het scheiden van geknipt amplicons. Deze methode kan de mono-isotopische massa van oligonucleotiden, die bruikbaar is voor het identificeren basissamenstelling helderen.

Verbeterde Polymerase Chain Reaction-restrictiefragmentlengtepolymorfisme Genotypering van Toxic Pufferfish door vloeistofchromatografie / massaspectrometrie

Gecombineerd voorloper isotopische labeling en isobare tagging (cPILOT) is een kwantitatieve proteomics strategie die steekproef multiplexing mogelijkheden van isobarisch labels verbetert. Dit protocol beschrijft de toepassing van cPILOT op weefsels van de ziekte van Alzheimer muismodel en wildtype controles.

Verbeterde Sample Multiplexing Weefsels gebruik van Gecombineerd Precursor isotopische labeling en Isobaric Tagging (cPILOT)

De architectuur van eiwitcomplexen is essentieel voor hun functie. Diverse massaspectrometrische technieken combineren bewezen krachtige te bestuderen van hun vergadering. Wij bieden protocollen voor chemische dwarsbinding en inheemse massaspectrometrie en laten zien hoe deze complementaire technieken helpen ophelderen van de architectuur van multi subeenheid eiwit assemblages.

Chemische dwarsbinding en massaspectrometrie van Intact eiwitcomplexen te bestuderen de architectuur van multi subeenheid eiwit assembly's combineren

We presenteren een methode voor de zuivering, detectie en identificatie van diGly peptiden die afkomstig zijn van ubiquitinated eiwitten uit complexe biologische monsters. De gepresenteerde methode is reproduceerbaar, robuust en presteert beter dan gepubliceerde methoden met betrekking tot het diepteniveau van de ubiquitinomenanalyse.

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

Deze workflow beschrijft de prestaties van tijd- en kostenefficiënte verrijking van meerdere eiwitposttranslationele modificaties (PTM's) tegelijkertijd voor kwantitatieve wereldwijde proteomische analyse. Het protocol maakt gebruik van peptide-niveau PTM verrijking met meerdere geconjugeerde antilichamen, gevolgd door data-onafhankelijke acquisitie massaspectrometrie analyse om biologische inzichten te krijgen in PTM crosstalk.

Gelijktijdige affiniteitsverrijking van twee posttranslationele wijzigingen voor kwantificering en sitelokalisatie

Gecombineerde precursor isotopic etikettering en isobaric tagging (cPILOT) is een verbeterde monster multiplexing strategie die in staat is het verhogen van het aantal monsters die gelijktijdig kunnen worden geanalyseerd met de beschikbare isobaric tags. De integratie van een robotplatform heeft de experimentele doorvoer, reproduceerbaarheid en kwantitatieve nauwkeurigheid sterk verhoogd.

Geautomatiseerde voorbeeldbixing met behulp van gecombineerde precursor-isotopenlabeling en isobaric tagging (cPILOT)

Ontdek Capture Compound Mass Spectrometry om c-di-GMP-bindende eiwitten in bacteriën te identificeren met hoge specificiteit. Deze methode maakt rigoureuze wascondities mogelijk dankzij covalente kruisverbindingen.

Capture Compound Massaspectrometrie - een krachtig hulpmiddel om het identificeren van nieuwe c-di-GMP effectoreiwitten

Meer video's verkennen