Efficiënte Generation humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met Sendai-virus
23 april 2014
Hier presenteren we onze gevestigde methode om menselijke somatische cellen herprogrammeren in-transgen vrij mens iPSCs met Sendai-virus, die in overeenstemming resultaat en verbeterde efficiëntie toont.
Het algemene doel van deze procedure is om humane geïnduceerde pluripotente stamcellen te genereren met Sendai-virus. Dit wordt bereikt door eerst fibroblastcellen voor te bereiden en te plateren die getransduceerd moeten worden. De volgende stap van de procedure is om de cellen te infecteren met Sendai-virus.
Vervolgens worden de geïnfecteerde fibroblastcellen overgebracht naar verse muis embryonale fibroblast feedercellen. De laatste stap is om de gerepprogrammeerde. Nu pluripotente stamcellen, uiteindelijk de herprogrammering van fibroblastcellen in I PSC's, zonder het gebruik van transgenen, te tonen door middel van immunolabeling en R-T-P-C-R.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat het de herprogrammeringsefficiëntie verbetert zonder overblijvende transgene en op een kosteneffectieve manier Voor dit protocol, heb menselijke fibroblasten klaar die in DMEM zijn gekweekt. Met FBS breng deze cellen over naar 24-well platen voor de experimentele plaat in zes seriële verdunning om de beste dichtheid voor celadhesie te bepalen. Elke rij van de 24-well plaat kan een verdunningsreeks van cellen herbergen.
Dus kunnen vier celtypen op een plaat worden getest, incubeer de verdunning gedurende 24 uur. Selecteer de volgende dag putjes op drie niveaus van confluentie voor transductie. Een op een hoog niveau van 80 tot 90% confluentie, een op ongeveer 60% confluentie en de derde op ongeveer 30% confluentie een uur of meer voorafgaand aan de transductie.
Vervang het medium met 300 microliter vers fibroblastmedium voor de transductie ontdooiing. Ontdooi één set Sendai-virusbuizen gedurende een paar seconden op 37 graden Celsius en stop dan. Ontdooi ze op kamertemperatuur.
Centrifugeer de ontdooide virussen gedurende 10 seconden bij 6.000 G en bewaar ze op ijs in één microcentrifugebuisje. Maak een mengsel van de virussen berekend volgens het aantal cellen dat getransduceerd moet worden. Berekeningsdetails zijn te vinden in het tekstprotocol.
Meng de virussen goed met voorzichtig pipetteren. Voeg nu aan de dichtstbijzijnde cellen twee volumes virus toe. Voeg één volume virus toe aan de cellen met middelmatige dichtheid en voeg een half volume virus toe aan de minst dichte selectie.
Zwiep de plaat en laat deze overnacht incuberen voor de reactie. Vervang de volgende dag het medium met 500 microliter vers fibroblastmedium. Doe dit opnieuw twee dagen later, drie dagen na de tweede mediumverversing die op de getransduceerde cellen is uitgevoerd.
Bereid meth-cellen voor in 60 millimeter schalen met DMEM bevattend 10% FBS, plateer 500.000 cellen per schaal en incubeer ze overnacht. De volgende dag, vervang het medium op de meth-cellen met vers medium en ga verder met het opzetten van de co-cultuur. Verwijder eerst het medium van de getransduceerde fibroblasten en was ze eenmaal met DPBS.
Voeg vervolgens 200 microliter 0,25% trypsin EDTA toe aan elke getransduceerde put van cellen binnen vijf minuten. Verzamel alle losgekomen cellen in een enkele 15 milliliter conische buis. Centrifugeer de cellen gedurende vier minuten bij 1.350 G.
Verwijder vervolgens het supernatant en was de gepelletiseerde cellen met ongeveer vijf milliliter vers medium om de trypsine te neutraliseren. Verzamel nu de cellen met nog een vier minuten centrifugatie bij 1.350 G. Plaat vervolgens de meeste cellen als zes seriële verdunningen in meth.
De eerste en laatste verdunning zijn mogelijk niet nodig, afhankelijk van de doodssnelheid van de cellen. Bewaar een deel van de cellen voor een RNA-extractie en incubeer de platen overnacht. Vervang de volgende dag het medium met humaan ES-medium aangevuld met 10 micromolar RO-kinaseremmer Y 2 7 6 3 2.
Om de celoverleving gedurende de volgende dagen te verbeteren, verander het medium naar normaal ongesupplementeerd humaan ES-medium. Begin na een week van cultiveren om de paar dagen de schalen te controleren op de vorming van ES-kolonieachtige celklompjes. Zodra ze verschijnen, monitor de groei.
Drie weken na de transductie zouden de kolonies van ES-celklompjes klaar moeten zijn voor expansie. Bereid meth-feedercellen voor in 24-well platen zoals ze voor 60 millimeter platen zijn voorbereid. Voordat u enige kolonie oppakt, verander het medium op de meth-cellen naar ES-medium met 10 microliter Y 2 7, 6, 3, 2.
Pak een kolonie per keer van de schalen. Breng de kolonie over naar een 15 milliliter buis met oplossing daarin. Breek de kolonie op met behulp van de pipetteerder.
Bedek vervolgens één me. Put met de opgebroken kolonie. Laad uiteindelijk elk putje met één opgebroken kolonie en laad zoveel mogelijk putjes.
Onderhoud de cellen met dagelijkse mediumverversingen en breid ze uit naar zes-well platen en vervolgens 60 millimeter schotels. Meestal vertonen fibroblasten die zijn geïnfecteerd met Sendai-virus geen morfologische veranderingen tot na vijf dagen. Dan krijgen de cellen een ronde vorm met een grotere kern en kleinere cytoplasma.
Dit kleine schaalprotocol omvat verschillende parameters die kunnen worden geoptimaliseerd, zoals fibroblastdichtheid, virustiter en plateerdichtheid tot de mes. Transductie van cellen bij verschillende co-fluentie, weergegeven in verschillende kleuren, kan ook worden geoptimaliseerd. Na een week co-cultuur met meth-feedercellen hebben gedeeltelijk gereprogrammeerde fibroblasten een losse s-achtige vorm en zijn gemakkelijk te oppakken in tegenstelling tot het verzamelen met behulp van trypsine.
Volledig gereprogrammeerde I PSC's zijn duidelijk te onderscheiden van gedeeltelijk gereprogrammeerde cellen. Volledig gereprogrammeerde cellen zijn strak verpakt en kolonies kunnen duidelijke grenzen hebben. Gedeeltelijk gereprogrammeerde cellen vormen losse clusters die gemakkelijk loskomen.
Nadat de IPSC-klonen gedurende enkele weken zijn uitgebreid, is het aangewezen om voor stamcelmarkers te kleuren in vergelijking met H negen cellen. De IPC's zijn positief voor verschillende verwachte antilichamen, waaronder SSEA vier, OCT vier, TRA 81 en nano G die hun pluripotente kwaliteit ondersteunen. Met behulp van R-T-P-C-R werd geen transgenexpressie op
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het herprogrammeren van humane somatische cellen in transgeenvrije humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) met behulp van het Sendai-virus. De procedure toont consistente resultaten en verbeterde efficiëntie bij het genereren van iPSC's.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Stamceldonderzoek
- Celherprogrammering
- Virologie
Achtergrond
- Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) zijn waardevol voor regeneratieve geneeskunde.
- Traditionele methoden omvatten vaak het gebruik van transgenen, wat veiligheidsproblemen kan veroorzaken.
- Sendai-virus is een niet-integrerende vector die veiligere herprogrammering mogelijk maakt.
- Deze methode heeft tot doel de efficiëntie van het genereren van iPSC's uit somatische cellen te verbeteren.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het genereren van iPSC's zonder transgenen.
- Om de efficiëntie van het herprogrammeringsproces te verhogen.
- Om een protocol te bieden dat gemakkelijk kan worden gerepliceerd in onderzoeksomgevingen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding en beplating van fibroblastcellen.
- Transductie van fibroblastcellen met Sendai-virus.
- Overdracht van geïnfecteerde cellen naar muis-embryonaal fibroblast feedercellen.
- Manuele selectie van hergeprogrammeerde cellen bevestigd door immunolabeling en RT-PCR.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van transgeenvrije iPSC's uit fibroblastcellen.
- Consistente herprogrammeringsresultaten aangetoond in meerdere proeven.
- Verhoogde efficiëntie in vergelijking met traditionele methoden.
- Verificatie van pluripotentie door middel van gevestigde assays.
Conclusies
- De Sendai-virusmethode is een veilige en effectieve aanpak voor iPSC-generatie.
- Deze techniek kan verder onderzoek in regeneratieve geneeskunde faciliteren.
- Toekomstige studies kunnen de toepassing van deze iPSC's in verschillende therapeutische contexten onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Efficient generation of transgene-free human iPSCs using Sendai virus addresses a critical bottleneck in early discovery and disease modeling pipelines. This method enhances predictive confidence by eliminating residual transgene expression, supporting more reliable downstream differentiation and phenotypic screening. Its reproducibility and scalability position it as a foundational capability for translational research and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust generation of patient-specific iPSCs for hypothesis-driven disease modeling.
- Reduces mechanistic ambiguity by removing confounding transgene effects in functional assays.
- Supports target validation through reproducible reprogramming and marker-based confirmation.
- Facilitates portfolio triage by providing high-quality, integration-free cellular models.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, transgene-free iPSC lines for assay development and compound screening.
- Improves assay reproducibility by minimizing genetic and epigenetic artifacts.
- Enables quantitative readouts via immunolabeling and RT-PCR for pluripotency markers.
- Supports scalable workflows for high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Provides disease-relevant cellular systems for translational biomarker discovery.
- Ensures continuity from discovery to preclinical validation by maintaining genomic integrity.
- Reduces risk of misinterpreting disease phenotypes due to residual transgene expression.
- Aligns with requirements for preclinical model standardization and reproducibility.
Pipeline & Workflow Integration
This Sendai virus-based reprogramming method integrates at the interface of early discovery, target validation, and preclinical model development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by generating high-fidelity iPSC models.
- Screening: Provides reproducible, transgene-free cell lines for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative assessment of pluripotency via immunolabeling and RT-PCR outputs.
- Translational Research: Maintains disease relevance and biomarker alignment for downstream studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable platform for generating iPSCs across diverse projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic risk in disease modeling.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of iPSC generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling reliable model systems.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, viral transduction, and stem cell characterization.
- Needs access to Sendai virus reagents, feeder cell infrastructure, and molecular analysis tools.
- Demands cross-team standardization of cell density, virus titer, and marker validation protocols.
- Adaptable to various human somatic cell sources with optimization of key parameters.
- Dependent on rigorous immunolabeling and RT-PCR to confirm transgene-free status and pluripotency.
