Name: Efficiënte Generation humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met Sendai-virus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-23T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Leer hoe u humane geïnduceerde pluripotente stamcellen genereert uit fibroblasten met Sendai-virus. Deze efficiënte, transgeenvrije methode verbetert de reprogrammering voor regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij willen de leden van de Lee lab bedanken voor waardevolle discussies over het manuscript. Werk in de Lee lab werd ondersteund door subsidies van Robertson Investigator Award van New York Stem Cell Foundation en uit Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO).

1. Voorbereiding van de Cel en Media (dag 1) <ol><li> Cultuur en vergroten humane fibroblasten met DMEM medium dat 10% FBS. </li><li> Plaat humane fibroblasten (Figuur 1) op een 24-wells plaat in de juiste dichtheid per putje op de dag voor transductie. OPMERKING: De volgende seriële verdunningen worden aanbevolen (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K en 6.25K) omdat verschillende celtypen hebben verschillende gehechtheid vermogen. </li><li> Incubeer de cellen gedurende nog een dag in een 37 ° C, 5% CO2 incubator, zodat de cellen volledig verkleefd en uitgebreid. </li></ol> 2. Voer Transduction (Dag 2) <ol><li> Op de dag van transductie, controleer dan de celdichtheid en koos voor de meest efficiënte dichtheid putten (figuur 2). Het is beter om drie verschillende dichtheden halen: hoog (80 ~ 90%), midden (50 ~ 70%) en een lage (20 ~ 40%). </li><li> Ten minste 1 uur voor transductie, zuigen de fibroblast media uit de cellen en verander nieuwe 300 ul van fibroblast medium. </li><li> Verwijder een set van 4 verschillende Sendaivirus buizen uit de -80 ° C bewaren. Dooi elke buis op hetzelfde moment in een 37 ° C waterbad gedurende enkele seconden, en neem dan de buizen uit het waterbad. Daarna ontdooien ze op kamertemperatuur; centrifuge buizen bij 6000 xg gedurende 10 seconden en leg ze op ijs tot gebruik. Niet opnieuw invriezen en ontdooien van het virus, omdat de titers niet zal handhaven. </li><li> Voeg de aangegeven hoeveelheden van elk van de vier Sendaivirus buizen (Oct-4, Klf-4, c-Myc en Sox-2) micro-centrifugebuis. Zorg ervoor dat de oplossing goed gemengd is door pipetteren voorzichtig. Als bijvoorbeeld 50K cellen / putje van een 24-wells plaat Lookwell voor transductie: (Titer gebaseerd op het Certificate of Analysis van Life Technologies, kunnen verschillen van partij tot partij zijn) Tube hOct-4 = 6,0 x 10 7 ICB, 3 MOI = 5 ul Tube hSox-2 = 6,5 x 10 7 ICB, 3 MOI = 4,6 μ; L Tube hKlf-4 = 6,3 x 10 7 ICB, 3 MOI = 4,8 pl Tube hc-Myc = 7,8 x 10 7 ICB, 3 MOI = 3,8 pl Totaal = 18,2 ul van vier virus factoren mengsel / een goed (50K cellen) van de 24-well plaat </li><li> Afhankelijk van de cel dichtheden; voeg 2X, 1X, en 0.5X volume van het virus mengsel in de put. Schud de plaat van voor naar achter, links en rechts (2X: 36,4 ul van virus mengsel, 1X: 18.2 ui en 0.5X: 9,1 pi). </li><li> Plaats de cellen in een 37 ° C, 5% CO2 incubator en incubeer overnacht. </li></ol> 3. Vervanging van Cultuur Medium (dag 3 en dag 5) <ol><li> 24 uur na transductie, vervang het medium met 500 ul vers fibroblast medium. </li><li> Op dag 5, veranderen Medium met verse fibroblast media. </li></ol> 4. Bereid MEF Gerechten voor de co-cultuur (Dag 8) <ol><li> Bereid MEF cellen in 60 mm cultuur gerechten met 10% FBS bevatte DMEM-medium een ​​day voor passage van de getransduceerde fibroblast op MEF feeder-cellen. Opmerking: Wij maken gebruik van 5 x 10 5 van MEF in elk 60 mm schaal. </li></ol> 5. Start Co-cultuur Getransduceerde Cellen met MEF Feeder Cells (Dag 9) <ol><li> Voordat plating getransduceerde cellen, aspireren 10% FBS bevatte DMEM media van MEF feeder gerechten en voeg verse 10% FBS bevatte DMEM medium. </li><li> Verwijder het medium uit de getransduceerde fibroblasten die in de 24-well plaat en was cellen eenmaal met D-PBS. Voeg 200 ul van 0,25% trypsine / EDTA in de fibroblast cellen inde 24-wells plaat. Na minder dan 5 minuten incubatie met trypsine / EDTA, wanneer de cellen beginnen te los van de plaat, het verzamelen van de cellen met groeimedium in 15 ml conische buis. Centrifugeer ze daarna in 6000 g gedurende 4 minuten. OPMERKING: Pooling 2X, 1X, en 0.5X virus getransduceerde fibroblast wordt aanbevolen. </li><li> Verwijder het supernatant en was opnieuw suspenderende cel pellet met 4-5 ml vers fibroblast medium voor neutralisatie van trypsine. Centrifugeer ze vervolgens bij 135 g gedurende 4 minuten. </li><li> Cellaag seriële verdunning dichtheid en beginnen samen met fibroblast cultuur media op MEF: zoals 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 en 1/128 per 60 mm schaal. Afhankelijk celdood frequentie tijdens de eerste week van transductie, kan men niet hoeft te verdunnen tot 1/2 of 1/128 dichtheid. Opzij zetten overblijvende cellen aan totale RNA-extract als een positieve controle voor Transgene RT-PCR. </li><li> Plaats 60 mm schalen in 37 ° C, 5% CO2 incubator overnacht. </li></ol> 6. Feed menselijke embryonale stamcellen Medium en Bewaken van de Cellen (Dag 10) <ol><li> De volgende dag veranderen fibroblast media humane ES-medium met 10 uM Y-27632. Daarna veranderen medium dagelijks met menselijke ES medium: 800 ml DMEM/F12 + 200 ml Knockout Serum Vervanging + 10 ml L-glutamine + 10 ml 10 mM MEM minimale niet-essentiële aminozuren+ 1 ml 2-mercaptoethanol + 10 ng / ml basic Fibroblast Growth Factor. </li><li> Doe een dagelijkse media verandering met verse menselijke ES media. Na een week, kijk de gerechten eenmaal per 2 ~ 3 dagen onder een microscoop voor de vorming van ES kolonie-achtige cel klonten. Afhankelijk van het celtype, de cultuur meer of minder tijd duren voordat kolonies vertonen. </li></ol> 7. Kiezen van de geïnduceerde pluripotente stamcellen Kolonies en Vouw de Cellen (Dag 20 ~) <ol><li> Drie weken na transductie, moet kolonies goed lijken gekweekt voor het plukken. </li><li> De dag voor het plukken van de kolonies, bereiden MEF feeder in 24-well plaat. LET OP: Wij maken gebruik van 12,5 x 10 5 van MEF in een 24-well plaat. </li><li> De volgende dag, veranderen medium van MEF gerechten uit fibroblast media voor de menselijke ES media met 10 uM Y-27632. Handmatig kies er een kolonie op elk tijdstip onder de microscoop in de picking-kap opzetten en kleinere bosjes door pipetteren en overbrengenop vers bereide MEF dishes.Try verschillende klonen halen. </li><li> Passage en uitbreiden van de elk putje van een 24-wells plaat een 6 wells plaat in eerste instantie. Dan van een 6-wells plaat met een 60 mm schalen voor verdere vermeerdering. </li></ol> 8. Karakterisering van Human iPSCs (na 10 Passages) <ol><li> Immunofluorescentie <ol><li> Plaat menselijke iPSCs in 24-well plaat en cultuur tijdens 4-5 dagen met dagelijks wisselen van materiaal. </li><li> Voor het starten van immunofluorescentiebepaling, was de plaat met D-PBS eenmaal. Bevestig vervolgens de cellen direct in 0,4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten. Daarna Was driemaal in D-PBS gedurende 5 minuten. </li><li> Behandel gefixeerde cellen met 0,1% Triton X-100 oplossing in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Zuig het permeabilisering oplossing (0,1% triton X-100 oplossing) en voeg 0,5% BSA blokkerende oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Voer een detectie van Nanog, oktober-4, SSEA (fase-specifieke embryonale ANTIGnl) en TRA-1-81 (tumorrejectieantigen) gebruik van een anti-humaan antilichaam in 0,5% BSA-oplossing (controleer het materiaal tafel voor antilichaamverdunning tarief). Incubeer primair antilichaam gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. Was daarna drie keer in D-PBS gedurende 5 minuten elk. </li><li> Controleer met behulp van fluorescentie microscopie na 1 uur incubatie met Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgG antilichamen 2e antilichaam, die 1:2.000 verdund in 0,5% BSA-oplossing bij kamertemperatuur. Vlekken op alle kernen van elke MEF feeder cellen en hiPSCs met DAPI. </li></ol></li><li> RT-PCR Transgene Bevestiging <ol><li> Extract totaal mRNA uit cel pellet met behulp van RNA-extractie reagentia. </li><li> Een omgekeerde transcriptie op porties (1 ug) totaal RNA en de resulterende cDNA voor PCR amplificatie door Reverse Transcriptase. </li><li> Bereid de PCR mengsels 2 pi cDNA template, 10 pl 2X PCR Master Mix, 2 ui 2 pmol primers bevatten(Vooruit: 1 ui en omgekeerde: 1 pl) en 6 pl DW. Om genexpressie te detecteren, doe de RT-PCR met de in tabel 1 vermelde primers. </li><li> Voer de RT-PCR met GAPDH gen als controle voor de efficiëntie van de amplificatiereacties. Visualiseren en PCR product geanalyseerd met 1% agarose-gelelektroforese. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+without+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors.</a> Science. 322, 949-953 (2008).</li>
<li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).</li>
<li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li>
<li>Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgene-free+induced+pluripotent+mouse+stem+cells+by+the+piggyBac+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon.</a> Nature Methods. 6, 363-369 (2009).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Yoshioka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Generation+of+Human+iPSCs+by+a+Synthetic+Self-Replicative+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA.</a> Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).</li>
<li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).</li>
<li>Fluri, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation%2C+expansion+and+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+continuous+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures.</a> Nature Methods. 9, 509-516 (2012).</li>
<li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+without+Myc+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts.</a> Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22P+Jpn+Acad+B-Phys%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 Forthcoming.</li>
<li>Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-chromosome+inactivation+and+epigenetic+fluidity+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Herprogrammeren van menselijke somatische cellen om hiPSCs houdt ongekende beloften in fundamentele biologie, persoonlijke geneeskunde, en transplantatie 12. Voorheen menselijke iPSC generaties vereist DNA-virus dat integratie risico heeft in het gastheergenoom, waarbij ongewenste genetische mutaties die verdere klinische toepassingen zoals ontwikkeling en transplantatie drugtherapie 13 beperken kan maken. Met deze reden zijn veel studies gerapporteerd naar vector-en-transgen vrij systeem menselijk...

Menselijke embryonale stamcellen (hESCs) een capaciteit om te hernieuwen in vitro en hebben pluripotentie, die nuttig kunnen zijn voor ziektemodel kan, voor drug screening, en cel-gebaseerde therapie te ontwikkelen tegen ziekten en verwondingen te behandelen weefsel. Echter, hESCs een beperking voor celvervangingstherapie vanwege immunologische, oncologische en ethische barrières, en ziekte-gerelateerde genen te bestuderen, kon de ziekte-specifieke hESCs worden geïsoleerd door middel van pre-implantatie genetische diagnostiek (PGD) benaderingen, maar het is nog steeds technisch uitdagend en het embryo donaties zijn vrij zeldzaam. Deze problemen zijn gerelateerd aan de voortgang van stamcel biologie, die heeft geleid tot de ontwikkeling van geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs). Human iPSCs zijn genetisch geprogrammeerd zijn van menselijke volwassen somatische cellen en de haven pluripotente stamcel-achtige functies vergelijkbaar met hESCs, waardoor ze een nuttige bron voor regeneratieve geneeskunde, zoals d maaktvloerkleed ontdekking, ziekte modellering en celtherapie in patiënt-specifieke wijze 1,2. Tot nu toe zijn er verschillende methoden om menselijke iPSCs genereren, waaronder virus-gemedieerde (retrovirus en adenovirus) 3, niet-virus gemedieerde (BAC systeem en vectoren transfectie) 4 gen transductie en eiwit afgiftesysteem 5-7. Hoewel een levering van virus gemedieerde genen kunnen zorgen voor een zekere mate van efficiency kunnen virale vectoren genetische voetafdruk verlaten, omdat hun integratie in gastheerchromosomen om herprogrammering genen tot expressie ongecontroleerd. Zelfs wanneer virale integratie van transcriptiefactoren kunnen activeren of inactiveren gastheergenen 8, kan het een onverwachte genetische aberratie en het risico van tumorigenese 5,9 veroorzaken. Anderzijds, de directe invoering van eiwitten of RNA in somatische cellen werden gerapporteerd, maar hebben een aantal nadelen, zoals arbeidsintensieve, herhaalde transfectie, en lage niveau van 7,10 herprogrammeren. Zelfs episomale en niet-integrerende adenovirus, adeno-geassocieerd virus en plasmidevectoren zijn nog relatief minder efficiënt 11. Om deze redenen is het aannemelijk niet-integratie herprogrammering methoden met een hoge werkzaamheid van IPSC generatie en minder genetische afwijkingen kiezen. In deze studie gebruiken we een Sendai-virus gebaseerde herprogrammering. Deze methode staat bekend als niet-geïntegreerd in het gastheergenoom produceert het altijd menselijke iPSCs zonder transgen integraties.

<table><tbody><tr><td>CytoTune-iPS Reprogramming Kit</td><td>Invitrogen</td><td>A1378002</td><td></td></tr><tr><td>CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated&nbsp;</td><td>Global stem</td><td>GSC-6105M</td><td>5 x 105/6 cm of 12,5 x 105/24-well plate</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 0.25% Trypsin met EDTA 4Na 1X</td><td>Invitrogen</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 medium</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>24-well Cell Culture Plate, flat-bottom met deksel</td><td>BD</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>TOCRIS</td><td>1254</td><td>10 &#956;M (Voorraad: 10 mM)</td></tr><tr><td>basic fibroblast growth factor</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td>PHG0263</td><td>10 ng (Voorraad : 100 ug)</td></tr><tr><td>Knock-out serum replacement</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), vloeistof (hoge glucose)</td><td>Invitrogen</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Thermo Scientific Fermentas</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine-200 mM (100X), vloeistof</td><td>GIBCO</td><td>25030-081</td><td>1/100</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td>11140050</td><td>1/100</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (1,000X), vloeistof</td><td>GIBCO</td><td>21985023</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>Hausser Phase Contrast Hemacytometers</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>DSHB</td><td>MC-813-70</td><td>1/200</td></tr><tr><td>anti-Tra-1-81</td><td>Cell Signaling</td><td>4745S</td><td>1/200</td></tr><tr><td>muis monoklonaal Oct4 antilichaam</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-5279</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>Nanog</td><td>R&amp;D</td><td>AF1997</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>Alexa Flouor 488 geit anti-muis</td><td>Invitrogen</td><td>948492</td><td>1/2,000</td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline), 1X zonder calcium & magnesium</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect Reverse Transcription Kit</td><td>QIAGEN</td><td>205313</td><td></td></tr><tr><td>PCR Master Mix [2X]</td><td>Thermo Scientific Fermentas</td><td>K0171</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>picking hood</td><td>NuAire</td><td>NU-301</td><td></td></tr><tr><td>dissecting scope&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr></tbody></table>

efficiënte generation humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met sendai-virus

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Een paar jaar geleden, de oprichting van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) luidde een nieuw tijdperk in de medische biologie. Mogelijke toepassingen van menselijke iPSCs omvatten modellering pathogenese van menselijke genetische ziekten, autologe celtherapie na gencorrectie en gepersonaliseerde drug screening door middel van een bron van patiënt-specifieke en symptoom relevante cellen. Er zijn echter verschillende hindernissen te overwinnen, zoals het elimineren van de resterende herprogrammering factor transgenexpressie na menselijke iPSCs productie. Wat nog belangrijker is, kunnen de resterende transgene expressie in ongedifferentieerde menselijke iPSCs juiste differentiaties hinderen en misleiden de interpretatie van ziekte-relevante in vitro fenotypes. Met deze reden hebben integratie vrij en / of transgen vrij mens iPSCs ontwikkeld met verschillende methoden, zoals adenovirus, het piggyBac systeem minicircle vector, episomale vectoren, directe eiwitlevering en gesynthetiseerd mRNA. Echter, de efficiëntie van reprogramming gebruik-integratie vrije methoden is vrij laag in de meeste gevallen. Hier presenteren we een methode menselijke iPSCs isoleren met Sendai-virus (RNA-virus) gebaseerd herprogrammering systeem. Deze herprogrammering werkwijze toont consistente resultaten en hoge efficiëntie kosteneffectieve manier.

Meestal geïnfecteerde fibroblasten geen morfologische veranderingen in verscheidene dagen na Sendaivirus transductie tonen, maar vijf dagen later, beginnen ze verschillende vormen (figuur 1) hebben. Zoals beschreven in een rechterpaneel van figuur 1, hebben de cellen geen typische fibroblast morfologie meer. Ze hebben een ronde vorm en grotere kern dan cytoplasma. Zelfs wanneer transductie wordt uitgevoerd in 80% cellulaire confluentie, het lijkt alsof ze zijn minder samenvloeiing in de...

Hier presenteren we onze gevestigde methode om menselijke somatische cellen herprogrammeren in-transgen vrij mens iPSCs met Sendai-virus, die in overeenstemming resultaat en verbeterde efficiëntie toont.

Efficiënte Generation humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Het algemene doel van deze procedure is om humane geïnduceerde pluripotente stamcellen te genereren met Sendai-virus. Dit wordt bereikt door eerst fibroblastcellen voor te bereiden en te plateren die getransduceerd moeten worden. De volgende stap van de procedure is om de cellen te infecteren met Sendai-virus.Vervolgens worden de geïnfecteerde fibroblastcellen overgebracht naar verse muis embryonale fibroblast feedercellen. De laatste stap is om de gerepprogrammeerde. Nu pluripotente stamcellen, uiteindelijk de herprogrammering van fibroblastcellen in I PSC's, zonder het gebruik van transgenen, te tonen door middel van immunolabeling en R-T-P-C-R.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat het de herprogrammeringsefficiëntie verbetert zonder overblijvende transgene en op een kosteneffectieve manier Voor dit protocol, heb menselijke fibroblasten klaar die in DMEM zijn gekweekt. Met FBS breng deze cellen over naar 24-well platen voor de experimentele plaat in zes seriële verdunning om de beste dichtheid voor celadhesie te bepalen. Elke rij van de 24-well plaat kan een verdunningsreeks van cellen herbergen.Dus kunnen vier celtypen op een plaat worden getest, incubeer de verdunning gedurende 24 uur. Selecteer de volgende dag putjes op drie niveaus van confluentie voor transductie. Een op een hoog niveau van 80 tot 90% confluentie, een op ongeveer 60% confluentie en de derde op ongeveer 30% confluentie een uur of meer voorafgaand aan de transductie.Vervang het medium met 300 microliter vers fibroblastmedium voor de transductie ontdooiing. Ontdooi één set Sendai-virusbuizen gedurende een paar seconden op 37 graden Celsius en stop dan. Ontdooi ze op kamertemperatuur.Centrifugeer de ontdooide virussen gedurende 10 seconden bij 6.000 G en bewaar ze op ijs in één microcentrifugebuisje. Maak een mengsel van de virussen berekend volgens het aantal cellen dat getransduceerd moet worden. Berekeningsdetails zijn te vinden in het tekstprotocol.Meng de virussen goed met voorzichtig pipetteren. Voeg nu aan de dichtstbijzijnde cellen twee volumes virus toe. Voeg één volume virus toe aan de cellen met middelmatige dichtheid en voeg een half volume virus toe aan de minst dichte selectie.Zwiep de plaat en laat deze overnacht incuberen voor de reactie. Vervang de volgende dag het medium met 500 microliter vers fibroblastmedium. Doe dit opnieuw twee dagen later, drie dagen na de tweede mediumverversing die op de getransduceerde cellen is uitgevoerd.Bereid meth-cellen voor in 60 millimeter schalen met DMEM bevattend 10% FBS, plateer 500.000 cellen per schaal en incubeer ze overnacht. De volgende dag, vervang het medium op de meth-cellen met vers medium en ga verder met het opzetten van de co-cultuur. Verwijder eerst het medium van de getransduceerde fibroblasten en was ze eenmaal met DPBS.Voeg vervolgens 200 microliter 0,25% trypsin EDTA toe aan elke getransduceerde put van cellen binnen vijf minuten. Verzamel alle losgekomen cellen in een enkele 15 milliliter conische buis. Centrifugeer de cellen gedurende vier minuten bij 1.350 G.Verwijder vervolgens het supernatant en was de gepelletiseerde cellen met ongeveer vijf milliliter vers medium om de trypsine te neutraliseren. Verzamel nu de cellen met nog een vier minuten centrifugatie bij 1.350 G. Plaat vervolgens de meeste cellen als zes seriële verdunningen in meth.De eerste en laatste verdunning zijn mogelijk niet nodig, afhankelijk van de doodssnelheid van de cellen. Bewaar een deel van de cellen voor een RNA-extractie en incubeer de platen overnacht. Vervang de volgende dag het medium met humaan ES-medium aangevuld met 10 micromolar RO-kinaseremmer Y 2 7 6 3 2.Om de celoverleving gedurende de volgende dagen te verbeteren, verander het medium naar normaal ongesupplementeerd humaan ES-medium. Begin na een week van cultiveren om de paar dagen de schalen te controleren op de vorming van ES-kolonieachtige celklompjes. Zodra ze verschijnen, monitor de groei.Drie weken na de transductie zouden de kolonies van ES-celklompjes klaar moeten zijn voor expansie. Bereid meth-feedercellen voor in 24-well platen zoals ze voor 60 millimeter platen zijn voorbereid. Voordat u enige kolonie oppakt, verander het medium op de meth-cellen naar ES-medium met 10 microliter Y 2 7, 6, 3, 2.Pak een kolonie per keer van de schalen. Breng de kolonie over naar een 15 milliliter buis met oplossing daarin. Breek de kolonie op met behulp van de pipetteerder.Bedek vervolgens één me. Put met de opgebroken kolonie. Laad uiteindelijk elk putje met één opgebroken kolonie en laad zoveel mogelijk putjes.Onderhoud de cellen met dagelijkse mediumverversingen en breid ze uit naar zes-well platen en vervolgens 60 millimeter schotels. Meestal vertonen fibroblasten die zijn geïnfecteerd met Sendai-virus geen morfologische veranderingen tot na vijf dagen. Dan krijgen de cellen een ronde vorm met een grotere kern en kleinere cytoplasma.Dit kleine schaalprotocol omvat verschillende parameters die kunnen worden geoptimaliseerd, zoals fibroblastdichtheid, virustiter en plateerdichtheid tot de mes. Transductie van cellen bij verschillende co-fluentie, weergegeven in verschillende kleuren, kan ook worden geoptimaliseerd. Na een week co-cultuur met meth-feedercellen hebben gedeeltelijk gereprogrammeerde fibroblasten een losse s-achtige vorm en zijn gemakkelijk te oppakken in tegenstelling tot het verzamelen met behulp van trypsine.Volledig gereprogrammeerde I PSC's zijn duidelijk te onderscheiden van gedeeltelijk gereprogrammeerde cellen. Volledig gereprogrammeerde cellen zijn strak verpakt en kolonies kunnen duidelijke grenzen hebben. Gedeeltelijk gereprogrammeerde cellen vormen losse clusters die gemakkelijk loskomen.Nadat de IPSC-klonen gedurende enkele weken zijn uitgebreid, is het aangewezen om voor stamcelmarkers te kleuren in vergelijking met H negen cellen. De IPC's zijn positief voor verschillende verwachte antilichamen, waaronder SSEA vier, OCT vier, TRA 81 en nano G die hun pluripotente kwaliteit ondersteunen. Met behulp van R-T-P-C-R werd geen transgenexpressie op

efficient-generation-human-induced-pluripotent-stem-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Tonen we het protocol voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met behulp van lentivirus-gemedieerde levering van de menselijke factoren Oct4, Sox2, NANOG, en Lin28. Pluripotentie werd bevestigd door morfologie en de aanwezigheid van embryonale stamcellen (ES) cel-specifieke merkers.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van menselijke fibroblasten herprogrammeren met de Stemgent Human TF lentivirus Set

We presenteren een protocol voor een efficiënte herprogrammering van menselijke somatische cellen in het menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) met behulp van retrovirale vectoren die coderen voor Oct3 / 4, Sox2, Klf4 en c-myc (OSKM) en de identificatie van de opnieuw aangeleerd hiPSC door live kleuring met Tra- 1-81 antilichaam.

Selecteren en isoleren van Koloniën van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen geherprogrammeerd tegen Adult Fibroblasten

Een methode om de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) via retrovirus-gemedieerde ectopische expressie van OCT4 genereren, wordt SOX2, KLF4 en MYC beschreven. Een praktische manier om de menselijke IPSC kolonies op basis van GFP expressie te identificeren wordt ook besproken.

Herprogrammeren menselijke somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) Met behulp van retrovirale vector met GFP

Hier laten we een eenvoudige en effectieve protocol voor het genereren van menselijke iPSCs 3-4 ml van perifeer bloed met een lentivirale vector herprogrammering. Herprogrammering van direct beschikbare bloedcellen belooft om het gebruik van IPSC technologie te versnellen door het toegankelijk voor een breder onderzoeksgemeenschap.

Generatie van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed Met behulp van de STEMCCA lentivirale vector

We beschrijven een protocol voor het afleiden van op lentivirus gebaseerde, gereprogrammeerde en gekarakteriseerde factorvrije humane geïnduceerde pluripotente stamcellen en de omzetting hiervan in vermeende klinische-kwaliteitscondities.

Afleiden en karakterisatie van een Transgene gratis humane geïnduceerde pluripotente Stem Cell Line en de omschakeling naar Defined Klinisch-grade Voorwaarden

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) vormen een bron van patiënt-specifieke weefsels voor klinische toepassingen en fundamenteel onderzoek. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) die van bevroren buffy coats in viraal-vrije iPSCs met niet-integrerende episomale plasmiden herprogrammeren.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van Frozen Buffy Coats behulp van niet-integrerende Episomaal plasmiden

Dit protocol beschrijft hoe geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) kunnen worden gegenereerd uit menselijke perifere T-cellen onder feeder-vrije omstandigheden door gebruik te maken van een combinatie van matrigel en Sendai-virusvectoren die reprogrammeringsfactoren bevatten.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere T-cellen met behulp van Sendai Virus in Feeder gratis Voorwaarden

Het doel van dit protocol is om het protocol te laten zien voor het herprogrammeren van in melanoom geïnfiltreerde tumorlymfocyten in geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke Melanoom-Tumor-infiltrerende lymfocyten

We stellen een protocol voor voor het herprogrammeren van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) naar geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Door de getransduceerde bloedcellen te plaatsen op met matrix beklede platen met behulp van centrifugatie, worden iPSC's met succes geïnduceerd uit zwevende cellen. Deze techniek suggereert een eenvoudig en effectief herprogrammeringsprotocol voor cellen zoals PBMC's en CBMC's.

Geïnduceerde pluripotente stamcellen Generation van Blood Cells Met behulp van Sendai Virus en Centrifugeren

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor efficiënte generatie van integratievrije iPSC's uit menselijke volwassen perifere bloedcellen. Met behulp van vier oriP/EBNA-gebaseerde episomale vectoren om de herprogrammeringsfactoren, KLF4, MYC, BCL-XL, of OCT4 en SOX2 tot expressie te brengen, kunnen duizenden iPSC-kolonies worden verkregen uit 1 mL perifeer bloed.

Generatie van Integratie-free geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen behulp Episomaal Vectors

Het protocol presenteert de herprogrammering van perifere bloed mononucleaire cellen voor het opwekken van neurale stamcellen door Sendai virus infectie, differentiatie van iNSCs in Dopaminerge neuronen, transplantatie van de voorlopers van de DA in de eenzijdig-lesioned De ziekte van Parkinson, en de evaluatie van de veiligheid en werkzaamheid van de in de SC afgeleide DA-precursoren voor PD-behandeling.

Generatie van geïnduceerde neurale stamcellen uit perifere mononucleaire cellen en differentiatie naar precursoren voor Dopaminerge neuron voor transplantatie studies

Leer hoe u humane geïnduceerde pluripotente stamcellen genereert uit fibroblasten met Sendai-virus. Deze efficiënte, transgeenvrije methode verbetert de reprogrammering voor regeneratieve geneeskunde.

Efficiënte Generation humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met Sendai-virus

Meer video's verkennen