Name: Profilering Individuele menselijke embryonale stamcellen door kwantitatieve RT-PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Leer hoe je genexpressie profileert in individuele menselijke embryonale stamcellen met kwantitatieve RT-PCR. Deze methode onthult heterogeniteit in stamcelpopulaties voor regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij willen de leden van de Lee lab bedanken voor waardevolle discussies over het manuscript. Werk in de Lee lab werd ondersteund door subsidies van Robertson Investigator Award van New York Stem Cell Foundation en uit Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO).

1. Bereiding van een 96-well plaat <ol><li> Meng 1 ui van Single Cell DNase1 tot 9 pl Single Cell Lysis Solution. </li><li> Plaats de 10 ul gemengde oplossing in elke well van 96-well PCR plaat. </li></ol> 2. Detaching hESCs voor FACS Zuivering <ol><li> Maak OCT4 :: EGFP ES cellijn van 60 mm schaal met 1 ml Accutase gedurende 20 min bij 37 ° C, die werden geneutraliseerd met menselijke ES media. </li><li> Bereid celpopulatie in 1 ml FACS buffer en stel de cel 1 x 10 6 cellen / ml. </li><li> Passeren de cel monster door een 35 um cel zeef cap buis. </li><li> Bewaar de buis in ijs voordat celsorteren. </li></ol> 3. Lysis van FACS-gezuiverde cel in elke well van de 96-well plaat <ol><li> Sorteer de steekproef voor EGFP positieve cellen op een cel sorter met een getrainde operator. Zet de cel in Single Cell Lysis/DNase1 oplossing in 96-well PCR-plaat. Indien nodig, de 96-wells plaat met voorbeeld worden opgeslagen in een -80 ° C diepvriezer minder dan een maand. </li><li> Incubeer de monsters 5 minuten bij kamertemperatuur cellysis. </li><li> Voeg 1 ul van Stop Oplossing voor lysis reactie te stoppen. </li><li> Incubeer 2 minuten bij kamertemperatuur. </li></ol> 4. Reverse Transcriptie <ol><li> In elk een 0,5 pi aliquot van 20 uM SMA-T15, SMA-A. </li><li> Voeg 4 ui 5X buffer, 2 pl DTT, 1 ui reverse transcriptase en 1 pi dNTP aan elk putje. </li><li> Voeren reverse transcriptie in een PCR-apparaat. <ol><li> Stel de thermische programma bij 42 ° C x 90 min. en inactiveren reverse transcriptase bij 85 ° C x 5 minuten. </li></ol></li></ol> 5. Amplification <ol><li> Voeg 4 ul van ExoSAP-IT reagens aan elk reverse getranscribeerd monster. <ol><li> Incubeer monsters bij 37 ° C gedurende 15 min en 80 ° C gedurende 15 minuten om de ExoSAP-IT reagens inactiveren. </li></ol></li><li> Bereid PCR-mix wet SMA-p2 (2 nM) </li><li> Voeg 10 ul PCR reactiemengsel aan elk reverse getranscribeerd monster. </li><li> Voer de versterking, bestaande uit 20 cycli van denaturatie (94 ° C gedurende 30 seconden), annealing (57 ° C gedurende 30 seconden) en verlenging (68 ° C gedurende 10 min). </li></ol> 6. QRT-PCR Prestatie <ol><li> Voeg 10 ul van 2X SYBR Green PCR Master Mix, 1 ui cDNA geamplificeerd, 2 nM primers en 7 ui water aan elke well. <ol><li> Stel het programma gevolgd door 95 ° C gedurende 3 seconden, 60 ° C gedurende 30 seconden x 40 cycli. </li></ol></li><li> Voer in tweevoud voor technische fouten. </li></ol>

<ol><li>Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+ground-state+pluripotency+by+allelic+regulation+of+Nanog%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog.</a> Nature. 483, 470-473 (2012).</li>
<li>Leitch, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+germ+cells+from+mice+and+rats+exhibit+properties+consistent+with+a+generic+pluripotent+ground+state%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state.</a> Development. 137, 2279-2287 (2010).</li>
<li>Ramskold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).</li>
<li>Stewart, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+isolation+of+hESCs+reveals+heterogeneity+within+the+pluripotent+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment.</a> Nat Methods. 3, 807-815 (2006).</li>
<li>O'Malley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+analysis+with+novel+cell-surface+markers+identifies+routes+to+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells.</a> Nature. 499, 88-91 (2013).</li>
<li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+primed+pluripotent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat Methods. 5, 621-628 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).</li>
<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).</li>
<li>Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+neural+crest+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).</li>
<li>Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcriptase+template+switching%3A+A+SMART+%28TM%29+approach+for+full-length+cDNA+library+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction.</a> Biotechniques. 30, 892-897 (2001).</li>
<li>Pan, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+methods+for+full-length+RNA+sequencing+for+low+quantities+of+cells+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).</li>
<li>Tang, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+analysis+to+capture+the+transcriptome+landscape+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell.</a> Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Enkele cel gen profilering kan een belangrijk instrument om de functionaliteit van een enkele cel of een gehele populatie te voorspellen zijn. Vanwege technische beperking, heeft hele gen profielanalyse beperkt tot gemiddelden bevolking. Variaties in genexpressiepatronen en niveaus tussen individuele cellen en subpopulaties zijn voorgesteld om onjuiste interpretatie veroorzaken. Zulke uiteenlopende cellulaire aspecten zijn te vinden in hESCs en hun heterogeniteit veroorzaakt subtiel verschillende mogelijkheden voor het ...

De meeste hogere eukaryote populaties heterogeen derhalve de analyse van gepoolde populatie, is het vaak moeilijk te interpreteren cellulaire functies. Individuele cellen binnen een populatie kan subtiel verschillend zijn, en deze verschillen kunnen belangrijke gevolgen hebben voor het pand en de functie van de gehele bevolking 1, 2. Vooral menselijke embryonale stamcellen (hESCs) bekend heterogene, die verschillende niveaus van pluripotentie en diverse mogelijkheden veroorzaakt geslacht specificatie fijn specifieke wijze 3, 4 zijn. Zo kunnen verschillende celoppervlak antigenen worden gebruikt om gedifferentieerde pluripotente stamcellen categoriseren, 5 en Austin Smith groep voorgesteld verschillende pluripotentie in muis embryonale stamcellen, op basis van hun morfologie, differentiatie neiging en afhankelijkheid van signaalweg 6. Dit fenomeen werd de hypothese in menselijk embryonic stamcellen 7. Overwegende dat de studies werden uitgevoerd tussen de verschillende stamcellijnen, niet individuele enkele stamcellen, kan het zeer intrigerend zijn om verschillende niveaus van pluripotency analyseren op de enkele cel niveau, die mogelijk invloed heeft op hun differentiatie capaciteiten jegens alle somatische cellijnen. Cellulaire en moleculaire heterogeniteit kan worden gedicteerd door transcriptie profilering, die de &#39;single cell transcriptome&#39; wordt genoemd en benadrukt nieuwe benaderingen voor de kwantificering van genexpressie niveaus 8-10. Voor de analyse van genexpressie niveaus in individuele cellen ontwikkelden we een eenvoudig maar robuust protocol van eencellige kwantitatieve RT-PCR. We bevestigden de effectiviteit en haalbaarheid van ons protocol door het vergelijken van elke helft van enkele cellysaten evenals serieel verdunde totaal RNA van hESC &#39;, wat resulteert in een minimale technische variaties en verschillen. Verder gebruikten we een genetische reporter lijn homogene p isolerenEVOLKING van hESCs gebruik gene targeting systeem. De donor vector voor targeting OCT4 locus (OCT4-2A-EGFP-PGK-Puro construct) en een paar TALEN plasmiden werden gebruikt 11. De donor vector en een paar TALEN plasmiden werden geïntroduceerd in hESCs (H9, WA09) met behulp van onze nucleofectie en stamselectie protocol en het onderhoud van hESC &#39;werd uitgevoerd op basis van onze routine protocol 12. We bevestigden deze genetische reporter lijn uiten EGFP voor OCT4 expressie in OCT4 :: EGFP hESCs. Ons resultaat toont aan dat individuele hESCs (gesorteerd op OCT4 :: EGFP sterk positieve cellen) in het bezit een hoge mate van OCT4 expressie, maar verschillende niveaus van NANOG expressie. Dus moet onze enkele cel genexpressie test nuttig populatie heterogeniteit van pluripotente stamcellen te bestuderen.

<table><tbody><tr><td>96-well PCR Plate</td><td>USA scientific</td><td>1402-8900</td><td></td></tr><tr><td>Ambion Cell Lysis Kit</td><td>Life Technologies</td><td>4458235</td><td></td></tr><tr><td>SMARTScribe Reverse Transcriptase</td><td>Clonetech</td><td>639536</td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT</td><td>USB</td><td>78200</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity</td><td>Invitrogen</td><td>11304</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix, PCR Grade</td><td>Invitrogen</td><td>18427</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Universal 2X Master Mix</td><td>Kapa biosystem</td><td>KR0389</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Tech</td><td>S-1100-1</td><td></td></tr><tr><td>FACS buffer</td><td></td><td></td><td>45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 &mu;l DNase, filter gesteriliseerd</td></tr><tr><td>35 &mu;m cell strainer cap tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr></tbody></table>

profilering individuele menselijke embryonale stamcellen door kwantitatieve rt-pcr

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeniteit van stamcellen bevolking belemmert gedetailleerd inzicht in stamcel biologie, zoals hun differentiatie neiging tot verschillende geslachten. Een enkele cel transcriptome test kan een nieuwe benadering voor het ontleden van individuele variatie zijn. We hebben de enkele cel qRT-PCR-methode ontwikkeld, en bevestigde dat deze methode werkt goed in verschillende genexpressie profielen. In enkele cel niveau, elke menselijke embryonale stamcellen, gesorteerd per OCT4 :: EGFP positieve cellen, heeft een hoge expressie in OCT4, maar een ander niveau van NANOG expressie. Onze enkele cel genexpressie test moet nuttig zijn om de bevolking heterogeniteit ondervragen zijn.

Efficiënte en robuuste cel RNA-amplificatie Om de transcriptie variatie tussen hESCs minimaliseren, gebruikten we OCT4 :: EGFP hESC kloon voor FACS zuivering. Na het sorteren OCT4 :: EGFP-positieve cellen in een 96-well plaat, wordt elke cel gelyseerd in lysis buffer en omgezet poly (A) + RNA van volledige lengte cDNA met SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) primer en verankering met SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG ) door SMART template regelende techniek. De over...

Enkele cel genexpressie test is noodzakelijk om inzicht stamcel heterogeniteiten.

Profilering Individuele menselijke embryonale stamcellen door kwantitatieve RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Het algemene doel van deze procedure is het profileren van genexpressieniveaus van individuele menselijke embryonale stamcellen met behulp van single cell kwantitatieve reverse transcriptie polymerase kettingreactie, of RT-PCR. Dit wordt bereikt door eerst fluorescente geactiveerde cel sortering (FACS) te gebruiken om individuele cellen in elke put van een 96-wells plaat met cellysebuffer te sorteren. De tweede stap is het reverse transcriberen van RNA om cDNA te genereren uit single cell lysaten.Vervolgens wordt het cDNA geamplificeerd via de polymerasekettingreactie. De laatste stap is het uitvoeren van kwantitatieve RT-PCR op het geamplificeerde cDNA. Uiteindelijk is deze assay nuttig voor het bestuderen van genexpressie in heterogene populaties, zoals menselijke embryonale stamcellen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande kwantitatieve kunstmatige vaten op enkelcelniveau is dat deze methode, EEG en robuuster zijn voorafgaand aan de faxzuivering. De OCT vier EGFP menselijke embryonale stamcellen of Hess worden losgemaakt van de schaal van 60 millimeter. Verwijder al het medium, voeg 1 mL Accutane toe en incubeer bij 37 °C gedurende 20 minuten.Neu

profiling-individual-human-embryonic-stem-cells-by-quantitative-rt-pcr

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We zullen aantonen de opzet en analyse van pre-microRNA 96-wells-arrays voor QPCR het gebruik van een robot als door de hand met een Thermo Scientific Matrix multichannel pipet.

Profilering van de Pre-micro-RNA&#39;s en microRNA&#39;s met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) arrays

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde multiplex reverse transcriptase kwantitatieve PCR (qRT-PCR)-protocol in combinatie met een microfluïdisch platform als een kost en tijd efficiënte high-throughput screening tool voor microRNA (miRNA) expressie niveaus, in het bijzonder bij het werken met beperkte hoeveelheden van het monster.

High Throughput MicroRNA Profiling: Geoptimaliseerd Multiplex qRT-PCR op nanoliter Schaalverdeling op de Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

Dit artikel zal zich richten op het genereren van humane lever endoderm van menselijke embryonale stamcellen populaties.

Robuuste Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke embryonale stamcellen Populaties

Enkele cel expressie profilering maakt een gedetailleerde analyse van genexpressie van individuele cellen. Beschrijven we methoden voor de isolatie van cardiomyocyten, en het voorbereiden van de daaruit voortvloeiende lysaten voor zowel hele transcriptoom microarray of qPCR van specifieke doelen.

Single Cell Transcriptionele Profilering van de volwassen muis cardiomyocyten

Werkwijze voor het isoleren van een retinacellen en vervolgens amplificatie van de cDNA beschreven. Single-cell transcriptomics onthult de mate van cellulaire heterogeniteit aanwezig is in een tissue en onthult nieuwe marker-genen voor zeldzame celpopulaties. De bijbehorende protocol kan worden aangepast aan verschillende celtypen te passen.

Single-cell Profilering van het ontwikkelen en Jong netvlies Neuronen

De identificatie van hersentumor initiëren cellen (BTICs), de zeldzame cellen binnen een heterogene tumor bezit stamcel eigenschappen, geeft nieuwe inzichten in de menselijke hersenen tumor pathogenese. We hebben verfijnd specifieke kweekomstandigheden te verrijken voor BTICs, en we routinematig gebruik van flowcytometrie om verder te verrijken deze populaties. Zelfvernieuwing en assays transcript analyse door eencellige RT-PCR kan vervolgens worden uitgevoerd op deze geïsoleerde cellen.

Verwerking van primaire hersentumor Weefsel voor Stem Cell Testen en Flow sorteren

Met het doel om veranderingen in miRNA's in gedifferentieerde menselijke neurale stamcellen (hNSC's) te karakteriseren, beschrijven we hNSC-differentiatie op een driedimensionaal systeem, de evaluatie van veranderingen in microRNA-expressie door miRNA PCR-array en computationele analyse voor miRNA-doelwitvoorspelling en de validatie ervan door middel van een dual luciferase-assay.

Differentiatie van een menselijke neurale stamcellen Line op Three Dimensional Culturen, Analyse van MicroRNA en vermeende doelwit-genen

Dit protocol biedt een eenvoudige en efficiënte manier om humane pluripotente stamcellen (hPSC's) te propageren met behulp van alleen geconditioneerd medium afgeleid van de menselijke placenta in een met gelatine beklede schaal zonder aanvullende exogene suppletie of hPSC-specifieke synthetische substraten.

A Novel Cultuur Model for Human Pluripotent Stem Cell Voortplanting op gelatine in Placenta-geconditioneerde Media

We beschrijven een methode om enkele zoogdiercellen te sorteren en om de expressie van maximaal 96 doelgenen van belang in elke cel te kwantificeren. Deze methode omvat het gebruik van interne qPCR-standaarden om de schatting van absolute transcripttellingen mogelijk te maken.

Eencellige Gene Expression Profiling Met behulp van FACS en qPCR met interne standaarden

Bulk gen expressie metingen wolk individuele cel verschillen in heterogene cel populaties. Hier beschrijven we een protocol voor hoe eencellige gen expressie analyse en index Sorteren door bloeien geactiveerd Cell Sorting (FACS) kan worden gecombineerd om te bakenen heterogeniteit en immunophenotypically karakteriseren moleculair afzonderlijke cel populaties.

Een combinatorische eencellige aanpak te karakteriseren de moleculaire en Immunophenotypic heterogeniteit van menselijke stamcellen en voorlopercellen populaties

Hier presenteerden we een multiplexed single cell mRNA sequencing methode om het profiel van genexpressie in de muis embryonale weefsels. De op droplet gebaseerde enkelvoudige cel mRNA-sequencing (scRNA-SEQ) methode in combinatie met multiplexing strategieën kan afzonderlijke cellen van meerdere monsters tegelijkertijd profiel, wat de kosten van de reagens aanzienlijk verlaagt en experimentele batch-effecten minimaliseert.

Multiplexed single cell mRNA sequentieanalyse van embryonale cellen van de muis

Leer hoe je genexpressie profileert in individuele menselijke embryonale stamcellen met kwantitatieve RT-PCR. Deze methode onthult heterogeniteit in stamcelpopulaties voor regeneratieve geneeskunde.

Profilering Individuele menselijke embryonale stamcellen door kwantitatieve RT-PCR

Meer video's verkennen