Profilering Individuele menselijke embryonale stamcellen door kwantitatieve RT-PCR

Het algemene doel van deze procedure is om genexpressieniveaus van individuele menselijke embryonale stamcellen te profileren met behulp van kwantitatieve reverse transcriptie polymerasekettingreactie op één enkel celniveau, of R-T-P-C-R. Dit wordt bereikt door eerst fluorescente geactiveerde celsortering te gebruiken om individuele cellen in elke put van een 96-putsplaat met cellysebuffer te sorteren. De tweede stap is om RNA terug te transcriberen om cDNA uit enkellaagjes van cellen te genereren.

Vervolgens wordt het cDNA geamplificeerd door polymerasekettingreactie. De laatste stap is om kwantitatieve R-T-P-C-R uit te voeren op het geamplificeerde cDNA. Uiteindelijk is deze test nuttig voor het bestuderen van genexpressie in heterogene populaties zoals menselijke embryonale stamcellen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande enkellaagjes voor kwantitatieve kunstmatige vaten is dat deze methode, EEG en robuuster is vóór faxzuivering. De OCT vier EGFP menselijke embryonale stamcellen of Hess worden losgemaakt van de 60 millimeter schotel. Verwijder al het medium, voeg een milliliter Accutane toe en incubeer gedurende 20 minuten op 37 graden Celsius.

Neutraliseer Accutane met één milliliter humane ES-media centrifuge om de cellen te pelleteren na het weggooien van de supernatant. Breng de cellen opnieuw op in faxbuffer en pas de concentratie aan op één maal 10 tot de zesde cel per milliliter. Gebruik vervolgens het celmonster door een 35 micrometer celzeef in de dop van de buis. Bewaar de buis op ijs voordat u de cellen sorteert.

Begin deze procedure door een mastermix voor te bereiden die één microliter enkellaagje D Ns een en negen microliters enkellaagje lyse-oplossing bevat. Voor elke put breng 10 microliters van de mix-oplossing over naar elke put van een 96-puts PCR-plaat voor fax-analyse. Programmeer de celsorteerder om enkellaagjes van EGFP-positieve cellen in de putten van de 96-puts PCR-plaat te sorteren. Na celsortering, incubeer de monsters gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur voor cellyse. Om de lysereactie te stoppen, voegt u één microliter stopoplossing toe en incubeert u gedurende twee minuten bij kamertemperatuur.

Om deze procedure te beginnen, voegt u eerst aan elke put van de 96-putsplaat een 0,5 microliter Eloqua toe van 20 micromolar SMAT 15 en SMAA-primers. Verwarm de monsters gedurende vijf minuten op 80 graden Celsius. Voeg vervolgens vier microliters van vijf x-buffer, twee microliters DTT, één microliter reverse transcriptase en één microliter van D en tps toe.

Voer in elke put reverse transcriptie uit in een thermische cycler. Stel het thermische programma in op 42 graden Celsius gedurende 90 minuten, gevolgd door 85 graden Celsius gedurende vijf minuten. Om de reverse transcriptase te inactiveren wanneer de reverse transcriptie voltooid is, voegt u vier microliters exo-reagens toe aan elk cDNA-monster en incubeert u gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius om overtollige oligonucleotiden te verteren. Vervolgens wordt gedurende 15 minuten bij 80 graden Celsius ingecubeerd.

Om het exo-reagens te inactiveren, bereidt u het PCR-reactiemengsel voor met twee nanomolar van de SMAP twee-primer. Voeg 10 microliters van het PCR-reactiemengsel toe. Aan elk omgekeerd getranscribeerd monster.

Voer de amplificatie uit bestaande uit 20 cycli van denaturatie, knielen en extensie. Na amplificatie van de monsters worden twee sets kwantitatieve R-T-P-C-R-reacties uitgevoerd in afzonderlijke platen om de R-T-P-C-R-resultaten te bevestigen. Voeg in elke put van de 2 96-putsplaten 10 microliters van twee x cyber groen toe. PCR mastermix, één microliter van geamplificeerd cDNA, twee primers en zeven microliters water. Stel het programma in op 95 graden Celsius gedurende drie seconden, gevolgd door 60 graden Celsius gedurende 30 seconden.

Voor 40 cycli is de knielingsstap verwijderd om de fout van de primer te verminderen. In deze studie werden microgramhoeveelheden van totaal RNA van Hess verdund tot nano- en picogramniveaus om technische variabiliteit en detectie van verschillen op lage hoeveelheden van totaal RNA te beoordelen. Kwantitatieve R-T-P-C-R van het G-A-P-D-H-gen werd uitgevoerd met behulp van MR.NA van gepoolde kafjes die stapvoets werden verdund van 10 nanogram per microliter tot 0,1 picogram per microliter. Elke stip toont de CT-waarde van stapvoets verdund mRNA en enkellaagje mRNA gesorteerd door fax.

Er werd een correlatie waargenomen tussen elk monster en de QR TPCR-resultaten met verschillende enkellaagjes die vergelijkbare CT-waarden vertoonden. Fax werd gebruikt om sterke EEG FP-positieve cellen te sorteren en te selecteren uit een OCT vier EGFP-reporter HESC-lijn. De resultaten tonen een EGFP-positieve populatie van ongeveer 60% in vergelijking met de negatieve populatie om consistentie tussen verschillende batchreacties van reverse transcriptie en amplificatie te valideren.

Fax-gezuiverde enkellaagjes werden gedeeld in twee delen en het protocol werd toegepast op elk deel voor batchvergelijkingen. Er werd een significante correlatie waargenomen tussen de OCT vier CT-waarde van elk deel van de enkellaagjes. Een hittemappresentatie van enkellaagjes van genexpressie toont een consistent en robuust niveau van OCT vier expressie, maar variërende niveaus van een ander stamcelmarkergen, NAN og. Samen genomen tonen onze resultaten aan dat deze enkellaagje genexpressietest nuttig is voor het bestuderen van populatieheterogeniteiten van pluripotente stamcellen.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de QITP voor enkellaagjestranscriptoom op de juiste manier uitvoert.