Human Neutrophil Flow Kamer adhesietest

Het algemene doel van deze procedure is om de sterke adhesie van neutrofielen te meten met behulp van een flow chamber-assay die menselijke neutrofieladhesie mogelijk maakt in aanwezigheid van schuifspanning. Dit wordt bereikt door eerst een substraat van gezuiverde adhesiemoleculen of een endotheelceloppervlak voor te bereiden, zoals menselijke endotheelcellen van de navelstrengvene of ve. De tweede stap is het scheiden van neutrofielen uit menselijk perifeer bloed met behulp van een centrifugeringsmethode met twee PHI-lagen.

Vervolgens wordt de stroomkamer gemonteerd om de injectie van de geïsoleerde humane neutrofielen onder schuifspanning op het substraat van respectievelijk adhesie-, ligand- of ve-moleculen mogelijk te maken. De laatste stap is het registreren van neutrofiel-adhesiegebeurtenissen in de stroomkamer, gevolgd door een zorgvuldige kwantificering van de stevige adhesie. Uiteindelijk wordt de flowchamber-assay gebruikt om de stevige adhesie van neutrofielen aan gezuiverde adhesiemoleculen en een HX-oppervlak aan te tonen.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het gebied van auto-immuniteit, zoals het functionele belang van genetische variaties in weefselmoleculen waarvan bekend is dat ze geassocieerd zijn met de ontwikkeling van auto-immuniteit. Genetische studies bij patiënten met systemische lupus erythematosus hebben een sterke associatie aangetoond met varianten in bèta 2-integrine, een eiwit dat betrokken is bij de stevige adhesie van neutrofielen. We hebben dit assay-systeem ontwikkeld om de functionele gevolgen van genetische variatie in dit bèta 2-integrine, genaamd Mac-1, op de stevige adhesie te beoordelen. Bereid de kweekschalen voor gebruik in de flowkamer voor.

Voeg één milliliter van een fibrin- en gelatinestoplossing toe aan elke 35 millimeter weefselkweekschaal en pipetteer meerdere keren om er zeker van te zijn dat het gehele plaatoppervlak is gecoat. Verwijder de overtollige fibronectine- en gelatinestoplossing en laat de platen gedurende ten minste 30 minuten aan de lucht drogen. Om de vorming van de eiwitmatrix te optimaliseren, oogst human umbilical vein endothelial cells of qve die zijn gekweekt tot 80 tot 90% confluentie met behulp van trypsine EDTA en zaai 500 000 cellen uit in elke gecoate weefselkweekschaal.

Voeg twee milliliters groeimedium toe aan elke schaal en incubeer bij 37 °C en 5% CO2. De cellen moeten dagelijks visueel worden gecontroleerd, waarbij het medium elke twee dagen wordt ververst. Laat de cellen groeien tot 80 tot 90% confluentie.

Om deze procedure te starten, gebruikt u een stift of pen om een cirkel met een diameter van 0,5 centimeter in het midden van een 35 millimeter weefselkweekschaal te tekenen. Breng 20 µL van een 20 µg/mL proteïne A-oplossing aan in het gemarkeerde gebied. Gebruik de pipetpunt om de proteïne A-oplossing te verspreiden zodat het gehele gebied binnen de cirkel van 0,5 centimeter diameter bedekt is.

Het is belangrijk om het oppervlak van de schaal niet aan te raken of te bekrassen. Incubeer de weefselkweekschalen één uur lang bij 37 °C. Was vervolgens elke met proteïne gecoate plaat drie keer met 1 mL PBS.

Verwijder de PBS uit de derde wasplaat en voeg 50 µL 1% BSA toe aan het gemarkeerde gebied om aspecifieke binding op de plaat te blokkeren. Incubeer gedurende twee uur bij vier °C. Na twee uur.

Was de geblokkeerde plaat drie keer met één milliliter PBS. Bereid de chimerische eiwitoplossingen van het FC-adhesiereceptorligand voor de coating en dit experiment; ICAM one FC Kyra bij 25 µg/mL en P-selectine FC Kyra bij 0,5 µg/mL zullen worden gebruikt. Coat het gemarkeerde gebied met 50 µL van het substraat en incubeer de weefselkweekschalen overnight bij 4 °C.

De schaaltjes moeten binnen twee dagen worden gebruikt en het gecoate gebied mag niet uitdrogen. Voeg indien nodig PBS toe om de 50 µL oplossing op de plaat te behouden.

Neutrofielen voor deze studie worden geïsoleerd uit het bloed van deelnemers die schriftelijke geïnformeerde toestemming hebben gegeven. Na het afnemen van bloed via flebotomie in een anticoagulans-bloedafnamebuis of vacutainer, wordt het bloed één-op-één verdund met PBS voordat alle stappen in deze procedure worden uitgevoerd. Bereid bij kamertemperatuur een tweelaagse Ficoll-oplossing voor het scheiden van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMCs) en neutrofielen in centrifugebuizen van 50 milliliters.

Voeg eerst 15 milliliter zware PHI call toe en laag vervolgens voorzichtig 10 milliliter lichte fi call bovenop de zware fi call. Er moet een scherpe grens zichtbaar zijn tussen de lagen lichte fi call en zware fi call. Laag tenslotte voorzichtig 25 milliliter van het verdunde bloedmonster bovenop de lichte fi call zonder de PHI te verstoren.

Centrifugeer de buizen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur; na centrifugatie moeten meerdere lagen zichtbaar zijn. De neutrofielenlaag met weinig rode bloedcellen bevindt zich tussen de lichte en zware fase. Oogst de neutrofielenlaag met een transferpipet, breng deze over naar een nieuwe buis van 50 milliliter en voeg PBS toe tot een eindvolume van 50 milliliters.

Centrifugeer 10 minuten bij 225 ×g. Na centrifugatie bij kamertemperatuur kunnen er nog steeds rode bloedcellen tussen de neutrofielen gemengd zijn. Aspireer het supernatant tot de 10 milliliter.

Resuspendeer de pellet van neutrofielen en rode bloedcellen door kortstondig te vortexen bij een lage snelheid en was vervolgens opnieuw met 50 milliliters PBS; aspireer het supernatant om de contaminerende rode bloedcellen te verwijderen. Resuspendeer de gepellette cellen in de resterende PBS door kortstondig te vortexen bij een lage snelheid.

Voeg 25 milliliters water toe en vortex zachtjes gedurende 10 seconden. Om de rode bloedcellen te lyseren, voegt u 25 milliliters 1,8% natriumchloride toe en mengt u dit onmiddellijk door centrifugatie bij 225 ×g gedurende 10 minuten.

De contaminerende rode bloedcellen moeten nu worden gelyseerd, waardoor een wit neutrofiel celpellet overblijft. Was het neutrofiel celpellet met PBS, verwijder het supernatant en resuspendeer de geïsoleerde neutrofielen in RPMI-medium met 10% FBS. Na het bepalen van de celconcentratie onder een lichtmicroscoop met een hemocytometer, wordt de celdichtheid aangepast naar 500.000 cellen per milliliter met compleet RPMI 10% FBS-medium.

Prime de VE vóór het starten van de adhesie-assay in de stroomkamer gedurende vier tot zes uur met 20 nanogram per milliliter menselijk TNF alfa om de expressie van adhesiemoleculen op te reguleren en te stimuleren. Wanneer de VE gereed zijn, wordt de stroomkamer geassembleerd. Plaats de 35 millimeter schaal met de confluente VE op de microscooptafel.

Voor de doeleinden van deze video zal alleen de adhesie van neutrofielen aan VE worden onderzocht, maar dezelfde procedure is van toepassing op het bestuderen van de adhesie van neutrofielen aan gezuiverde adhesiemoleculen; verbind de parallel plate flowkamer met de spuitenpomp en het vacuümsysteem en laat één lijn open voor de toevoer van neutrofielen. Plaats de flowkamer bovenop de plaat en bevestig de flowkamerassemblage. Start het video-opnameprogramma op de computer die is aangesloten op de microscoop.

Stel het beeldveld en de focus van de microscoop in totdat een helder veld met volledig gegroeide VE zichtbaar is. Spoel de flowkamer met RPMI-medium met behulp van de spuitenpomp. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de kamer of in de toevoerlijn voor neutrofielen aanwezig zijn.

Gebruik de spuitenpomp om de neutrofielen met gedefinieerde snelheden in de flowkamer te injecteren. Neem de video op, aangezien neutrofielenadhesie snel kan optreden; een video van vier tot vijf minuten is gewoonlijk voldoende om adhesiegebeurtenissen voor analyse te kwantificeren. Dit videoclip toont een voorbeeld van neutrofielen die binden aan een met HU E gecoate flowkamer.

Een adherent cell wordt gedefinieerd als een cel die zich in vijf seconden minder dan één celdiameter verplaatst. Op het HU e-gecoat oppervlak. Hier worden screenshots op verschillende tijdstippen getoond uit voorbeeldvideo's van neutrofielen die hechten aan een ICAM one P-selectine-gecoat oppervlak, of een uve-gecoat oppervlak.

In beide experimenten is de stroomsnelheid van de neutrofielen 350 microliters per minuut met een neutrofielendichtheid van 500.000 cellen per milliliter. Onder typische omstandigheden werd waargenomen dat 50 tot 70 humane neutrofielen stevig hechtten aan het ligand- of VE-gecoate oppervlak gedurende een opnameperiode van vier minuten. Echter, allelische varianten van neutrofiele adhesiemoleculen of allelische varianten in het substraat konden de kwantitatieve neutrofieladhesie aanzienlijk beïnvloeden, wat bleek uit het opnemen van video's van vergelijkbare lengte met verschillende donoren.

Voor neutrofielen kan het aantal adherente cellen per minuut worden berekend om de adhesie-eigenschappen tussen verschillende donoren te vergelijken. Tijdens deze procedure is het belangrijk om de neutrofielen visueel te controleren op celklontering veroorzaakt door celactivatie geïnduceerd door isolatie. Daarnaast kan een parallelle flowcytometrische beoordeling van de celactivatie worden uitgevoerd om te garanderen dat de activatietoestand van de cellen consistent is tussen donoren en tussen experimenten.

Deze techniek baande de weg voor onderzoekers op het gebied van autoimmuniteit om celadhesie te onderzoeken in primaire menselijke cellen van genotype-donoren met verschillende coderende regio-allelen van de CD 11 B-keten van bèta twee-integrine, MAC one. Deze studies hebben een zorgvuldige en kwantitatieve beoordeling mogelijk gemaakt van de functionele impact van deze allelische varianten in het menselijk systeem.