Name: Colorimetrische Papier-gebaseerde detectie van Escherichia coli, Salmonella Spp. En Listeria monocytogenes Van grote volumes of Agricultural Water (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: Leer een kleurmetrische detectiemethode voor voedselpathogenen in landbouwwater met Modified Moore Swabs en papiergebaseerde analytische apparaten. Dit protocol verbetert de voedselveiligheid door snelle identificatie van bacteriën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken hartelijk voor de financiering van dit project door de USDA National Institute of Food and Agriculture-subsidies 2009-01208 en 2009-01984.

1. Concentratie bacteriën uit grote hoeveelheden Agricultural Water gebruik van MMS <ol><li> MMS Voorbereiding <ol><li> Snijd een rechthoekige doorsnede van 4-laags kaasdoek meet 40 x 12 cm. </li><li> Vouw de kaasdoek langs beide assen tot een rechthoek van 20 x 6 cm te verkrijgen. </li><li> Rol het kaasdoek strak langs zijn lengteas een cilindrische uitstrijkje van ongeveer 6 cm lang en 3 cm in diameter vormen. </li><li> Autoclaaf de kaasdoek wattenstaafje in aluminiumfolie, doe de cassette niet in een autoclaaf. Maak de cassette door het weken voor 30 min in 10% bleekmiddel en deactiveer het resterende chloor met het weken van de cassette gedurende 15 min in een natrium thiosulfaat pentahydraat (Na 2 S 2 O 3 · 5H 2 O)-oplossing (50 mg / L bereid in steriel water). </li><li> Steek het staafje in het MMS-cassette. OPMERKING: Als de niet-disposable versie van het MMS-cassette wordt gebruikt, te beginnen met een 4-laags vel kaasdoek measuring 80 x 22 cm, vouwen om 40 x 11 cm en rol het een cilinder ongeveer 11 cm hoog en 6 cm in diameter vormen. </li><li> Monteer de MMS. </li><li> Hechten vinyl slang aan aansluitingen aan beide zijden van de MMS, zodat de slang volledig voldoet aan de aansluitingen, en bevestig slang in de peristaltische pomp. Zorg ervoor dat de buis stroomopwaarts van de peristaltische pomp is van voldoende lengte voor bemonstering. </li></ol></li><li> Concentratie Bacteria <ol><li> Voorbeeld tenminste 10 L landbouwproducten water door uitvoering van de peristaltische pomp met hoge snelheid. </li><li> Na bemonstering voltooid is, trekt de peristaltische pomp inlaat van het watermonster en doorgaan met het uitvoeren van de pomp tot er geen afvalwater wordt waargenomen verlaten van de MMS. </li><li> Wanneer een spruitstuk wordt gebruikt om meerdere monsters draaien op hetzelfde moment, verzamel het effluent van elk MMS, en wanneer 10 L wordt gefiltreerd door een MMS sluit de klep voor die MMS blijven rijden de pomp. <ol><li> Bij de bemonstering is voltooid, trekt de peristaltische pomp inlaat van het water voor de landbouw, open alle kleppen van het spruitstuk, en doorgaan met het uitvoeren van de pomp tot er geen afvalwater wordt waargenomen verlaten van de mms. </li></ol></li></ol></li><li> Wanneer de concentratie is voltooid voor alle MMS&#39;en, verwijder voorzichtig de vinyl slang van de MMS tappen en dop de aansluitingen aan beide zijden van de MMS. Goed afgesloten MMS kan worden bewaard tot 12 uur voor het toevoegen verrijkingsmedia. </li></ol> 2. MMS Verrijking en Monstervoorbereiding <ol><li> Verrijking <ol><li> Schroef het deksel van de MMS, waarna aseptisch 20 ml van de geschikte steriele verrijkingsbouillon. Gebruik een MMS voor elke selectieve verrijking. Als alternatief, het uitvoeren van een niet-selectieve verrijking voor alle drie de doelbacteriën voortplanten in hetzelfde monster. OPMERKING: Als de niet-disposable versie van het MMS-cassette wordt gebruikt, aseptisch verwijderen kaasdoek filter uit de cassette en plaats in een steriele zak voordat advertentieding 225 ml van de juiste verrijking media. <ol><li> Voor verrijking van E. coli, voeg 20 ml gebufferd peptonwater (BPW) aangevuld met 8 mg / l vancomycine hydrochloride. </li><li> Voor verrijking van Salmonella spp., Voeg 20 ml BPW aangevuld met de Salmonella supplement (4 ml / L). </li><li> Voor verrijking van L. monocytogenes, voeg 20 ml VIDAS UP Listeria (LPT) bouillon. </li><li> Voor gelijktijdige niet-selectieve verrijking voor alle drie micro-organismen met behulp van een enkele MMS, gebruiken universele preenrichment bouillon (UPB). </li></ol></li><li> Schroef het deksel van de MMS terug stevig vast. Zorg ervoor dat de aansluitingen goed zijn afgedekt om morsen en mogelijke besmetting tijdens verrijking te voorkomen. </li><li> Incubeer de MMS voor maximaal 18-24 uur in een incubator schudden bij 200 rpm. Gebruik 42 ° C voor E. coli en Salmonella spp. selectieve verrijkingen. Met 30 ° C voor L. monocytogenes selectieve verrijking, en het gebruik van 37 &amp; #176, C voor niet-selectieve verrijking. </li></ol></li><li> Monstervoorbereiding <ol><li> Bij incubatie is voltooid, verwijdert u het bericht van de incubator, verkondigen een van de aansluitingen, en zachtjes afzien ongeveer 0,5 ml in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Als alternatief, schroef de MMS en pipet uit 0,5 ml &#39;s nachts verrijking. OPMERKING: Als het niet-disposable versie van de MMS-cassette wordt gebruikt, pipet 0,5 ml van verrijking uit de zak. </li><li> Voor colorimetrische analyse van E. coli selectieve verrijking of voor de analyse van de niet-selectieve aanrijking ultrasone trillingen 0,5 ml verrijking 5 W, 22 kHz gedurende 20 seconden met behulp van een probe sonicator. </li></ol></li></ol> 3. Voorbereiding en Inbedding van Colorimetric Substrates in μPADs <ol><li> Bereid genoeg μPADs voor elk monster en doelwit getest. E. detecteren coli bereiden CPRG en X-Gluc μPADs, voor Salmonella spp. detectie bereiden MC μPADs, en voor L. monocytogenes detectie bereiden X-InP μPADs. <ol><li> Bereid HEPES buffer [0,1 M HEPES met 0,1% runderserumalbumine (BSA)] voor de colorimetrische substraten en de pH van de buffer naar het substraat die zal worden gebruikt: pH 7,5 voor de bereiding van CPRG of X-Gluc, pH 9 MC en pH 7 voor X-InP. </li><li> Bereid voorraadoplossingen van de substraten in de pH HEPES buffer bij concentraties van 3 mM (CPRG), 62,5 mM (X-Gluc), 15 mM (MC), 100 mM (X-InP). Bescherm de voorraad oplossingen van licht. </li><li> Plaats de μPADs in een steriele petrischaal, dan verankeren de μPAD microspot met 24 pi van elk substraat voorraad oplossing. </li></ol></li></ol> 4. Detectie en Data-analyse <ol><li> Opsporing <ol><li> Voeg 6 pl van het verrijkte monster elke passende μPAD microspot in een petrischaal. </li><li> Plaats het deksel terug op de petrischaal en verzegelt het met Parafilm. </li><li> Incubeer het monsterde μPAD bij 37 ° C gedurende maximaal 3 uur om voor kleurontwikkeling en drogen van de microspots. </li></ol></li><li> Visueel onderzoek van de resultaten <ol><li> Voer detectie door een eenvoudige visuele inspectie van de kleurveranderingen van de μPADs. OPMERKING: Typisch, sterke reacties die definitief kleurveranderingen te produceren naar verwachting volgende 18-24 uur van verrijking, die moet voorkomen de noodzaak van verdere verduidelijking en moeten positief worden beschouwd. </li><li> Bepaal de aanwezigheid van een E. coli positief monster door het observeren microspots ingebed met CPRG verandering van geel naar rood-violet en microspots ingebed met X-Gluc verandering van kleurloos naar blauw-groen. </li><li> Bepaal de aanwezigheid van L. monocytogenes positief monster door het observeren microspots ingebed met X-InP verandering van kleurloos tot indigo. </li><li> Bepaal de aanwezigheid van een Salmonella spp. positief monster door het observeren microspots ingebed met MC verandering van colorless tot paars-mauve. </li></ol></li><li> Software Aided Data Analysis OPMERKING: Uitgevoerd duidelijk bepalen of zwakke reacties positief of negatief en een semi-kwantitatieve analyse van de resultaten mogelijk. <ol><li> Laat de μPADs volledig droog. </li><li> Scan de μPAD met een flatbedscanner. </li><li> Gebruik ImageJ software om de afbeelding te verwerken. <ol><li> &quot;Open&quot; gescande afbeelding in ImageJ zich onder het &quot;Bestand&quot; tab in het hoofdmenu (of druk op &quot;Clt + O&quot;) te analyseren. </li><li> Keer het beeld &quot;omkeren&quot; onder het tabblad &quot;Bewerken&quot; in het hoofdmenu (of druk op &quot;Clt + Shift + I&quot;) te selecteren. </li><li> Gebruik de &quot;Analyze&quot; tab in het hoofdmenu en selecteer &quot;Set Metingen ...&quot; om de gerapporteerde metingen onderzocht selecteren. </li><li> Zorg ervoor dat de &quot;Mean grijze intensiteit,&quot; &quot;Beperk tot drempel,&quot; en &quot;Display label&quot; dozen zijngecontroleerd, en druk op &quot;OK.&quot; Dit stelt hoe de software analyseert elke geselecteerde gebied en hoe wordt deze gemeld. </li><li> Gebruik de &quot;Oval&quot; tool om een ​​cirkel die het gebied dat u wilt binnen meten contouren tekenen. </li><li> Onder de tab &quot;Analyze&quot; selecteer &quot;Measure&quot; (of druk op &quot;Clt + M&quot;). De software zal de gemiddelde grijze intensiteit te meten binnen het gebied gedefinieerd en rapporteren in een pop-up scherm dat kan worden gekopieerd en geplakt naar Excel voor verdere analyse. Opmerking: Voor nauwkeurigere analyses ten minste twee technische replicaten van elk monster moet worden uitgevoerd. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidance+for+industry%3A+Guide+to+minimize+microbial+food+safety+hazards+for+fresh+fruits+and+vegetables%22">Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables</a>. , U.S. Dept. of Health and Human Service, Food and Drug Administration, Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN). (1998).</li>
<li>Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Modified+Moore+swabs+and+continuous+flow+centrifugation+for+concentration+of+Salmonella+and+Escherichia+coli+O157%3AH7+from+large+volumes+of+water%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water).</a> J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).</li>
<li>Sbodio, A., Maeda, S., Lopez-Velasco, G., Suslow, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+Moore+swab+optimization+and+validation+in+capturing+E.+coli+O157%3AH7+and+Salmonella+enterica+in+large+volume+field+samples+of+irrigation+water%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water.</a> Food Res Int. 51, 654-662 (2013).</li>
<li>McEgan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Salmonella+spp.+from+large+volumes+of+water+by+modified+Moore+swabs+and+tangential+flow+filtration%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of Salmonella spp. from large volumes of water by modified Moore swabs and tangential flow filtration.</a> Lett Appl Microbiol. 56, 88-94 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Solicitation+Number%3A+FDA-SS-1116253%22">Solicitation Number: FDA-SS-1116253</a>. , Administration USFaD. (2013).</li>
<li>Jokerst, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+paper-based+analytical+device+for+colorimetric+detection+of+select+foodborne+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of a paper-based analytical device for colorimetric detection of select foodborne pathogens.</a> Analytical Chemistry. 84, 2900-2907 (1021).</li>
<li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+paper+as+a+platform+for+inexpensive%2C+low-volume%2C+portable+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays.</a> Angew Chem Int Edit. 46, 1318-1320 (2007).</li>
<li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH%3A+A+rapid+method+for+prototyping+paper-based+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 8, 2146-2150 (1039).</li>
<li>Abe, K., Suzuki, K., Citterio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet-printed+microfluidic+multianalyte+chemical+sensing+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inkjet-printed microfluidic multianalyte chemical sensing paper.</a> Analytical Chemistry. 80, 6928-6934 (1021).</li>
<li>Cheng, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millimeter-scale+contact+printing+of+aqueous+solutions+using+a+stamp+made+out+of+paper+and+tape%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Millimeter-scale contact printing of aqueous solutions using a stamp made out of paper and tape.</a> Lab on a Chip. 10, 3201-3205 (1039).</li>
<li>Lu, Y., Shi, W. W., Jiang, L., Qin, J. H., Lin, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+of+paper-based+microfluidics+with+wax+for+low-cost%2C+portable+bioassay%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay.</a> Electrophoresis. 30, 1497-1500 (2009).</li>
<li>Jokerst Rapid detection of pathogens using paper devices. US patent. , WO2012125781 A3 (2012).</li>
<li>T10-06 Colorimetric paper-based detection of Salmonella spp. and Escherichia coli from artificially contaminated irrigation river water. Bisha, B., et al. Internation Association for Food Protection Annual Meeting, Providence, RI, , (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft een geïntegreerde werkwijze voor het detecteren E. coli, Salmonella spp. en L. monocytogenes in landbouwproducten water. Hier, MMS concentratie van de bacteriën uit grote volumes (10 L), van de landbouw water, is gekoppeld met bacteriële verrijking, en bacteriële-indicatieve colorimetrische detectie met behulp μPADs. De MMS procedure kan omgaan met hoge deeltjes gehalte in het water monsters terwijl concentreren van de bacteriën 10-voudig, is robuust en eenvoudig genoeg voor vel...

Het is belangrijk dat voedsel overgedragen ziekten agenten snel en bij voorkeur worden gedetecteerd in het veld op basis van de instellingen om de last van voedsel overgedragen ziekten te verminderen. Gemeenschappelijke strategieën van voedselinfecties bacteriële pathogenen te detecteren omvatten biochemische profilering, selectieve en differentiële kweken, immunologische isolatie en detectie en moleculaire detectie. Echter, deze methoden gehinderd door sporadische besmetting, kleine steekproeven getest, de vaak lage concentraties van de pathogene bacteriën, vereisen lange doorlooptijden, en / of zijn niet van toepassing voor lokale instellingen. Verder verbindingen in veel voedingsmatrices zijn remmend voor detectie en diagnostische toepassingen. Om de kans op microbiële detectie te verbeteren, heeft de Amerikaanse Food and Drug Administration stelde dat het testen van water voor de landbouw (zoals waswater en irrigatiewater) die ofwel in contact komt met een groot oppervlak van verse producten of dient als een voertuig voor produce besmetting is een levensvatbaar alternatief voor directe testen van levensmiddelen 1. Zelfs zo, de vaak lage natuurlijke pathogeen-belasting in combinatie met het verwateringseffect van de vertegenwoordiger agrarische watermonster maakt vanm pathogeen concentratie essentieel. Een dergelijke methode zou vereisen bemonstering grote hoeveelheden water (≥ 10 L), voldoende pathogeen-concentratie, en compatibiliteit met downstream detectie strategieën. Gemodificeerde Moore swabs (MMS) zijn goedkoop, eenvoudig en robuust apparaten die worden gebruikt voor het concentreren van bacteriën uit grote volumes (≥ 10 L) water 2-4. De MMS bestaat uit een kunststof cassette gevuld met gaas, dat als een grof filter voor grote volumes water gepompt door de cassette via een peristaltische pomp. De MMS is een niet-discriminerende wijze van bacteriële concentratie (≥ 10 voudige concentratie) dat organische en anorganische deeltjes bestaand materiaal vangt waaronder micro-organismen in verwerkt liquid monsters. Het is waarschijnlijk dat de uitstekende werkzaamheid concentratie van target micro-organismen door de MMS kan worden verklaard door het feit dat micro-organismen zullen naar verwachting worden bevestigd aan de slib-kleifractie of organische micro-aggregaten van de zwevende stoffen 3. Het robuuste ontwerp van de MMS maakt overwinnen meeste tekortkomingen geassocieerd met andere filtratie methoden voor het vangen en concentratie van de bacteriën uit water, zoals verstopping van filters, onvermogen om grote volumes verwerken, filter monsters met hoge troebelheid en hoge kosten. Om deze redenen is de FDA de aanbeveling dat van MMS in officiële procedures voor milieu-en produceren van-gerelateerde monstername procedures 5 worden opgenomen. Hier wordt een werkwijze beschreven voor de concentratie, verrijking, en detectie van Escherichia coli, Salmonella spp. En Listeria monocytogenes uit agrarische wateren. Een MMS wordt gebruikt voor concentratie van bactEria, en dient ook als een schip voor selectieve of niet-selectieve verrijking van bacteriën. Bacteriële detectie wordt biochemisch bereikt met behulp van op papier gebaseerde analytische apparaten (μPADs) 6. μPADs kunnen worden vervaardigd als fluïde netwerken of spot testen met behulp van verschillende methoden, met inbegrip fotolithografie, inkjet printen, stampen, en wax afdrukken 7-11. Voorbeelden van vloeibare ontwerpen kunnen dendritische kanaalrasters waar het monster wordt aangebracht in het midden en stroomt vervolgens distaal reservoirs of eenkanaals patronen waarbij het ​​monster of substraat uit de buitenste reservoirs van het kanaal worden getrokken door capillaire werking naar het centrum 12. Voor dit protocol, hebben wij ervoor gekozen om in dienst voor 7-mm-diameter van wax-papier spot arrays ingebed met chromogene substraten die kunnen worden verwerkt door enzymen die een indicatie van de hier geteste micro-organismen: Chlorophenol rood β-D-galactopyranoside (CPRG) en 5 - broom-4-chloor-3-indolyl β-D-glucuronide (X-Gluc)voor de detectie van β-galactosidase en β-glucuronidase door E. coli; 5-broom-6-chloor-3-indolyl caprylaat (magenta caprylaat) voor de detectie van C8-esterase door Salmonella spp.; en 5-broom-4-chloor-3-indolyl-myo-inositol fosfaat (X-InP) voor de detectie van fosfatidylinositol-specifieke fosfolipase C (PI-PLC) door L. monocytogenes 6. Aldus kan de aanwezigheid van een bepaalde bacterie visueel geobserveerd zonder omslachtige apparatuur of data interpretatie. De specificiteit en gevoeligheid van de enzymatische colorimetrische μPAD detectie van deze specifieke doelstelling bacteriën eerder onderzocht 6. Bovendien is de gevoeligheid van de geïntegreerde concentratie-detectiemethode voor deze doelgroep bacteriën werd geëvalueerd door spiking grote hoeveelheden water met vooraf bepaalde niveaus van micro-organismen (ongepubliceerde gegevens en Bisha et al.. 13).

<table><tbody><tr><td>Agricultural water</td><td></td><td></td><td>Irrigatiewater, produce waswater, putwater, enz.</td></tr><tr><td>Vinyl tubing</td><td>Wilmar</td><td>BN-CVT1005</td><td>&nbsp;1/4" binnendiameter,&nbsp; 3/8" buitendiameter, verkrijgbaar bij:&nbsp; http://www.wilmar.com</td></tr><tr><td>Modified Moore Swab cartridge&nbsp;</td><td>Lumiere Diagnostics</td><td></td><td>11 &frac12; cm lengte en 4 &frac12; cm breedte, verkrijgbaar bij:&nbsp; http://www.lumierediagnostics.com.&nbsp; Alternatief kan een niet-wegwerpbare versie van de cartridge worden gebruikt (zie de tekst)</td></tr><tr><td>Cheesecloth</td><td>Chesapeake Wiper &amp; Supply, Inc.</td><td>CC90</td><td>Grade #90, 44 x 36 weefsel, verkrijgbaar bij:&nbsp; www.raglady.com</td></tr><tr><td>Huishoudbleekmiddel</td><td>Verschillende</td><td></td><td>Natriumhypochlorietconcentratie ca. 6%</td></tr><tr><td>Natriumthiosulfaat 5-hydraat</td><td>Mallinckrodt Baker Inc</td><td>8100-04</td><td></td></tr><tr><td>Manifold</td><td>In-house gebouwd</td><td></td><td>Optioneel, apparaat kan worden geconstrueerd uit PVC-buizen en geschikte fittingen</td></tr><tr><td>Peristaltische pomp</td><td>Micron Meters</td><td>RPP1300</td><td>Verkrijgbaar bij:&nbsp; http://www.micronmeters.com</td></tr><tr><td>Serologische pipet</td><td>Verschillende</td><td></td><td>Wegwerp, 10 ml</td></tr><tr><td>Universeel verrijkingsbouillon</td><td>Difco</td><td>223510</td><td></td></tr><tr><td>Buffered peptonwater</td><td>Difco</td><td>218105</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella supplement</td><td>Biom&eacute;rieux Industry</td><td>42650</td><td>http://www.biomerieux-usa.com</td></tr><tr><td>VIDAS UP Listeria (LPT) Bouillon</td><td>Biom&eacute;rieux Industry</td><td>410848</td><td>http://www.biomerieux-usa.com</td></tr><tr><td>Vancomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861987</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>Pipet-Aid</td><td>Verschillende</td><td></td><td>Drummond DP-110 hier gebruikt</td></tr><tr><td>Schudende incubator</td><td>Verschillende</td><td></td><td>Excella E25, New Brunswick Scientific hier gebruikt</td></tr><tr><td>Micropipet&nbsp;</td><td>Verschillende</td><td></td><td>10 &mu;l, 1 ml</td></tr><tr><td>Micropipettips</td><td>Verschillende</td><td></td><td>Barrier, 10 &mu;l, 1 ml</td></tr><tr><td>1,5 microcentrifugebuisjes</td><td>Verschillende</td><td></td><td>RNase- en DNase-vrij</td></tr><tr><td>Probe sonicator</td><td>Q Sonica LLC</td><td>XL-2000 serie</td><td></td></tr><tr><td>&micro;PADs</td><td>Avant&nbsp;</td><td></td><td>Met was bedrukte cirkels van 7 mm diameter, met een lijndikte van 4 punten. Neem voor aanvullende informatie contact op met Dr. Charles Henry</td></tr><tr><td>HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&prime;-2-ethaansulfonzuur]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serumalbumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8022</td><td></td></tr><tr><td>Chlorofenolrood-galactopyranosid (CPRG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59767</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-chloorchlooryl-&beta;-D-glucuronide (X-Gluc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8174</td><td></td></tr><tr><td>5-broom-6-chloorchloorylcaprylaat (magenta caprylaat)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53451</td><td></td></tr><tr><td>5-Broom-4-chloormyo-inositolfosfaat (X-InP)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38896</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen, polystyreen 100 mm bij 15 mm</td><td>Verschillende</td><td></td><td>Steriel</td></tr><tr><td>Vlakbedscanner</td><td>Verschillende</td><td></td><td>Xerox USB-scanner</td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

colorimetrische papier-gebaseerde detectie van<em&gt; escherichia coli</em&gt;,<em&gt; salmonella</em&gt; spp. en<em&gt; listeria monocytogenes</em&gt; van grote volumes of agricultural water

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Dit protocol beschrijft de snelle colorimetrische detectie van Escherichia coli, Salmonella spp., En Listeria monocytogenes van grote volumes (10 L) van landbouwproducten wateren. Hier wordt water gefiltreerd door steriele Modified Moore swabs (MMS), die bestaan ​​uit een eenvoudige gaasfilter ingesloten in een plastic behuizing, bacteriën concentreren. Na filtratie, zijn niet-selectief of selectief verrijkingen voor de doelbacteriën uitgevoerd in de MMS. Voor colorimetrische detectie van de doelgroep bacteriën, zijn de verrijkingen vervolgens getest met behulp van op papier gebaseerde analytische apparaten (μPADs) ingebed met bacteriën-indicatief substraten. Elk substraat reageert met doelwitspecifieke indicatieve bacteriële enzymen, genereren gekleurde producten die visueel (kwalitatieve detectie) kunnen worden gedetecteerd op de μPAD. Als alternatief kunnen digitale beelden van de gereageerde μPADs worden gegenereerd met gemeenschappelijke scannen of fotografische apparaten en het gebruik van ImageJ software, al geanalyseerdgende voor meer objectieve en gestandaardiseerde interpretatie van de resultaten. Hoewel de biochemische screening procedures tot de bovengenoemde bacteriële pathogenen te identificeren, in sommige gevallen enzymen die door microbiota achtergrond of de afbraak van de colorimetrische substraten produceren vals positief. Daarom wordt bevestigd met behulp van een meer discriminerende diagnose nodig. Toch is dit bacteriële concentratie en detectieplatform is goedkoop, gevoelig (0,1 CFU / ml detectielimiet), gemakkelijk uit te voeren en snel (concentratie, verrijking, en detectie wordt uitgevoerd binnen ongeveer 24 uur), het gebruik als een eerste screeningsmethode rechtvaardigen voor de microbiologische kwaliteit van landbouwproducten water.

Zoals beschreven in dit protocol, kan de concentratie van bacteriën met behulp van de MMS (figuur 1) worden uitgevoerd binnen ongeveer 15-20 minuten. De MMS in opgebouwd uit acrylonitril-butadieen-styreen (ABS) in twee afzonderlijke componenten; een deksel en een patroon beide met een geïntegreerde spigot samenstel waarin een cilindrische kaasdoek wattenstaafje wordt geplaatst (figuur 1A). Beide componenten worden dan geschroefd tezamen de MMS (Figuur 1B). MMS-gebaseerd...

Een protocol dat geïntegreerde concentratie, verrijking en eindpuntkleurmeting voor de detectie van door voedsel overgedragen ziekteverwekkers in grote volumes landbouwwater presenteert, wordt hier gepresenteerd. Het water wordt gefilterd door middel van Modified Moore Swabs (MMS), verrijkt met selectieve of niet-selectieve media, en de detectie wordt uitgevoerd met behulp van op papier gebaseerde analytische apparaten (µPAD) ingebed met bacteriële-indicatieve kleurmetingssubstraten.

Colorimetrische Papier-gebaseerde detectie van<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. En<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Van grote volumes of Agricultural Water

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren van door voedsel overdraagbare pathogenen in grote volumes landbouwwater. Hiervoor wordt een aangepaste wattenstaaf, hierna aangeduid als een MMS, samengesteld door een gevouwen stuk gaas of kaasdoek in een MMS-cassette te plaatsen. Vervolgens worden op de bemonsteringslocatie de doelbacteriën geconcentreerd door grote volumes water met behulp van een peristaltische pomp door de MMS te leiden.De uiteinden van de MMS worden vervolgens stevig afgesloten en terug naar het laboratorium getransporteerd. Er wordt selectieve of niet-selectieve verrijkingsbouillon aan de MMS toegevoegd, waarna deze 18 tot 24 uur wordt geïncubeerd. De verrijkte culturen worden vervolgens verzameld en er worden lysaten klaargemaakt voor de detectie van E. coli.Deze worden toegevoegd aan micro-pads met micro-spots die zijn geïmpregneerd met substraten voor colorimetrische enzymatische detectie en vervolgens tot drie uur lang geïncubeerd. De micro-pads worden daarna geïnspecteerd en gescand. Uiteindelijk onthullen visuele en kwantitatieve analyses van de micro-spots de aanwezigheid van E. coli, Salmonella-soorten en L. monocytogenes bij concentraties tot 0,1 CFU per milliliter.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van membraanfiltratie en kweek op vaste media is dat grotere volumes watermonsters kunnen worden gebruikt. Dit verhoogt de gevoeligheid van de analyse en verkort tevens de verrijkingstijd. De tijd tot detectie is eveneens verkort tot binnen 24 uur, vergeleken met 24 tot 48 uur bij de membraanfiltratiemethode.Bovendien kunnen de micropads worden gebruikt om gelijktijdig drie verschillende door voedsel overdraagbare pathogenen te detecteren, wat niet mogelijk is op het traditionele vaste bacteriële medium. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de analyse van landbouwwater en ook na extreme gebeurtenissen zoals bosbranden of extreme regenval, die beide kunnen leiden tot een toename van microbiële contaminatie van oppervlaktewater dat wordt gebruikt voor gewasirrigatie. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we grote volumes water snel moesten screenen op de aanwezigheid van pathogenen na de bosbranden in Colorado tijdens de zomers van 2012 en 2013; de methode moest aanpasbaar zijn voor gebruik in het veld vanwege de afgelegen bemonsteringsgebieden, waardoor het moeilijk was om grote volumes water te verzamelen en te transporteren naar het laboratorium voor analyses.Begin dit protocol met het voorbereiden van een gemodificeerde muesli-swab of MMS; snijd een rechthoekig stuk vierlaagse kaasdoek van 40 bij 12 centimeter. Vouw de kaasdoek langs beide assen om een rechthoek van 20 bij zes centimeter te verkrijgen. Rol vervolgens de kaasdoek strak langs de langere as om een cilindrische swab van ongeveer zes centimeter hoog en drie centimeter in diameter te vormen.Plaats de wattenstaaf in het aluminiumfoliezakje en autoclaveer deze gedurende 15 minuten. Na autoclavering bij 15 PSI met een droogprogramma is het apparaat klaar voor gebruik in het veld. Eenmaal op locatie brengt u vinylslangen aan op de uitlaten aan beide zijden van de MMS, waarbij u erop let dat de slangen volledig aansluiten op de uitlaten.Bevestig vervolgens de slang in de peristaltische pomp. Zorg ervoor dat de slang stroomopwaarts van de peristaltische pomp voldoende lang is om monsters te nemen voor de concentratie van de bacteriën. Plaats de inlaat van de peristaltische pomp in het landbouwwater dat bemonsterd moet worden.Bedien de peristaltische pomp met een stroomsnelheid van 300 milliliter per minuut en neem ten minste 10 liter monster. Haal na voltooiing van de bemonstering de inlaat van de peristaltische pomp uit het watermonster en laat de pomp doorlopen totdat er geen effluent water meer wordt waargenomen. Verlaat het MMS zodra de concentratie is voltooid.Verwijder voor alle gemodificeerde swabs voorzichtig de vinylslang uit de MMS-uitlopen en sluit de uitlopen aan beide zijden van de MMS af. Bewaar de stevig afgesloten MMS tot 12 uur bij koelkasttemperatuur voordat het verrijkingsmedium wordt toegevoegd. Hier zal de verrijking van E. coli, Salmonella-soorten en L. monocytogenes worden gedemonstreerd. Eén MMS wordt gebruikt voor elke selectieve verrijking.Draai de dop van de MMS open voor de verrijking van e coli. Voeg 20 milliliters steriel gebufferd peptidenwater of BPW toe, aangevuld met acht milligram per liter vancomycinehydrochloride. Draai de dop van de MMS weer stevig vast.Voeg voor verrijking van salmonella-soorten 20 milliliters steriel BPW toe, aangevuld met vier milliliters per liter Salmonella-supplement. Voor verrijking van L. monocytogenes voegt u 20 milliliters steriele up list area broth toe. Incubeer de MMS gedurende 18 tot 24 uur in een schudincubator op 150 RPM tot de incubatie is voltooid.Haal de MMS uit de incubator. Draai de dop los. Giet het medium voorzichtig in een Falcon-buis en breng met een pipet voorzichtig 0,5 milliliters over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.Ter voorbereiding op de colorimetrische analyse van de selectieve verrijking van E. coli, of voor de analyse van de niet-selectieve verrijkingen, wordt 0,5 milliliters van de verrijking gedisoneerd bij vijf watt 22 kilohertz gedurende 20 seconden. Bereid met een probe ator stokoplossingen van de substraten C-P-R-G-X glucose, magenta cap relate en XINP in pH-gecorrigeerde HEPES-buffer. Bescherm de stokoplossingen tegen licht five promo six.CHLORO three in allele, capite, of magenta capite is lichtgevoelig en kan potentieel vals-positieve resultaten produceren door autodegradatie. Plaats voor elk getest monster en elk doelwit één micropad in een steriele Petri-schaal. Bereid voor de detectie van E. coli CPRG- en xgl-micropads voor.Bereid voor de detectie van salmonella-soorten magenta capite micro-pads voor, en voor de detectie van L. monocytogenes XINP micro-pads. Breng met een pipet 24 µL van elke substraatstamoplossing aan op de micro-spot van de micro-pads. Voeg ter voorbereiding op de detectie zes µL van het verrijkte monster toe aan elke betreffende micro-pad.Plaats het deksel terug op de Petrischaal en sluit deze af met parafilm. Incubeer het monster met een micro-pad bij 37 °C gedurende maximaal drie uur om kleurontwikkeling en het drogen van de microspots mogelijk te maken. Voer na de incubatie de detectie uit door middel van een eenvoudige visuele inspectie van de kleurveranderingen van de micro-pads.Houd er rekening mee dat sterke reacties die duidelijke kleurveranderingen veroorzaken gewoonlijk worden verwacht na 18 tot 24 uur verrijking. Deze worden als positief beschouwd en vereisen geen verdere verduidelijking. Als E. coli aanwezig is, zullen microspots met CPRG van geel naar rood veranderen.Violette en micro-spots. Spots waarin xlu is ingebed, zullen veranderen van kleurloos naar blauwgroen, zoals hier getoond. Als L. monocytogenes aanwezig is, zullen micro-spots waarin XINP is ingebed, veranderen van kleurloos naar indigo.Indien salmonella-soorten aanwezig zijn, zullen de microspots die zijn voorzien van magenta capite veranderen van kleurloos naar paars M. In gevallen waarin de reacties zwak positief zijn, kan software worden gebruikt om een semi-kwantitatieve analyse van de resultaten te vergemakkelijken. Laat hiervoor de micropads volledig drogen. Scan de micropad vervolgens met een flatbedscanner.Gebruik de ImageJ-software om de afbeelding te verwerken. Open vervolgens in ImageJ de gescande afbeelding die geanalyseerd moet worden. Klik daarna op het tabblad 'Edit' in het hoofdmenu en selecteer 'Invert' om de afbeelding te inverteren.Gebruik het tabblad analyze in het hoofdmenu en selecteer set measurements om de te analyseren gerapporteerde metingen te kiezen. Zorg ervoor dat de opties mean gray intensity limit to threshold en display label boxes zijn aangevinkt en druk op oké. Hiermee wordt ingesteld hoe de software elk geselecteerd gebied analyseert en rapporteert.Gebruik vervolgens de ovale tool om het te analyseren gebied te omlijnen onder het tabblad analyze en selecteer measure. De software zal de gemiddelde grijswaarde-intensiteit binnen het gedefinieerde gebied meten en deze rapporteren in een pop-upscherm, waarvan de gegevens naar Excel kunnen worden gekopieerd en geplakt voor verdere analyse. Micro pad assays zijn gebaseerd op de detectie van indicatieve bacteriële enzymen, die reageren met cholometrische substraten.Assays die e coli detecteren, produceren een blauwgroen product en een roodviolet product. Assays die salmonella-soorten en L monocytogenes detecteren, produceren respectievelijk paars-violette en indigokleuren. Alternatieve digitized beelden kunnen worden bewerkt met Image J-software om een objectievere en gestandaardiseerde interpretatie van de gegevens mogelijk te maken.Hier worden gedigitaliseerde kleuren- en meetkundige beelden getoond voor elke assay, met zowel negatieve als positieve tests. Negatieve tests werden uitgevoerd met bacteriële soorten die de doelenzymen niet coderen, en positieve tests werden uitgevoerd met de doelbacteriën. De eerste rij toont onbewerkte gescande beelden in de tweede rij.De gescande beelden zijn met ImageJ-software omgezet naar grijstinten. En in rij drie is de kleur geïnverteerd voor de daaropvolgende interpretatie van de grijswaardenintensiteit.Rij vier toont de gemiddelde grijswaarde-intensiteit gemeten met Image J binnen elke microspot van het micropad. Een voorbeeld van een microspot wordt aangegeven door de gele pijl en cirkel. Deze grafiek toont de gemiddelde grijswaarde-intensiteiten van vier replica's bepaald door Image J. Voor elke kleur, één metrische micro pad positieve en negatieve test.Deze gegevens tonen aan dat via deze procedure een ambigu detectie van de drie doelmicro-organismen, geconcentreerd uit grote volumes landbouwwater, kan worden uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een gemodificeerde Moore-wattenstaaf assembleert. Concentreer micro-organismen van belang uit grote volumes landbouwwater, en voer daarnaast een colorimetrische enzymatische detectie en analyse uit op papiergebaseerde analytische apparaten.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een sonicatiestap op te nemen voor de detectie van e coli. Het is daarnaast belangrijk om het magenta capite-substraat zoveel mogelijk tegen licht te beschermen. Een juiste afsluiting en assemblage van de MMS voorafgaand aan de incubatie is essentieel voor de voltooiing van de procedure met aanvullende ontwikkeling.Deze techniek belooft zeer nuttig te worden als een eenvoudige, goedkope en snelle benadering voor diagnostiek aan de bron voor microbiële pathogenen en indicatororganismen, buiten de toepassingen voor voedselveiligheid. Deze techniek kan potentieel worden ingezet in de milieu- en klinische microbiologie. Vergeet niet dat het werken met pathogene micro-organismen uiterst gevaarlijk kan zijn, waardoor het essentieel is om morsen van bacteriële verrijkingen en de vorming van bio-aerosolen te voorkomen.Bij het uitvoeren van deze procedure moeten altijd de standaard voorzorgsmaatregelen voor het omgaan met pathogene micro-organismen worden nageleefd.

colorimetric-paper-based-detection-escherichia-coli-salmonella-spp

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Dit protocol beschrijft een eenvoudige zelfklevende tape-gebaseerde aanpak voor de bemonstering van de tomaten en andere verse producten oppervlakken, gevolgd door een snelle volledige cel detectie...

Combinatie van Adhesive-tape-gebaseerde Sampling en fluorescentie In situ Hybridisatie voor snelle detectie van Salmonella Op Fresh Produce

We hebben onlangs melding gemaakt van een nieuwe benadering voor het genereren van fluorogene DNAzyme probes die kan worden toegepast op het opzetten van een eenvoudige, "mix-and-lezen" TL-test voor bacteriële detectie. Deze speciale DNA probes katalyseren de splitsing van een chromofoor gemodificeerde DNA-RNA chimère substraat in aanwezigheid van ruwe extracellulaire mengsel (CEM) door een bepaald bacterie, waardoor vertaling bacteriële detectie in fluorescentiesignaal generatie. In dit...

Detectie van bacteriën met behulp van fluorogene DNAzymes

We beschrijven een elektrochemische sensor bepalingsmethode voor snelle bacteriële detectie en identificatie. De bepaling omvat een sensor-array gefunctionaliseerd met DNA oligonucleotide capture probes voor ribosomaal RNA (rRNA) species-specifieke sequenties. Sandwich hybridisatie van doelwit rRNA met de invangingsprobe en een mierikswortel peroxidase-linked DNA-oligonucleotide probe detector produceert een meetbare amperometrisch stroom.

Bacteriële Detection &amp; Identification gebruiken elektrochemische sensoren

Begin with a contaminated water sample likely to harbor fecal coliforms, including E. coli.Perform a serial dilution in distilled water to reduce turbidity and microbial load.Mix the desired diluted sample with the nutrient medium and load it into a microfluidic chip.Use vacuum filtration to capture bacteria on a membrane within the serpentine channel of the chip.Add nutrient medium to the upper chamber and incubate to enhance bacterial recovery.Replace the medium with a solution of E.

Phage-Based Microfluidic Assay for Detecting Viable E. coli in Water Samples

This video demonstrates a colorimetric E. coli detection method, involving an E. coli biomarker activating a DNAzyme, leading to cleavage of RNA linkage and detachment of a DNAzyme-urease conjugate. A subsequent colorimetric assay detects the E. coli biomarker through ammonia-induced pH changes.

Colorimetric Detection of a Bacterial Biomarker Using a Modified Litmus Test

Een qPCR assay is ontwikkeld voor detectie van Escherichia coli O157: H7 gericht op een unieke genetische merker, Z3276. De qPCR werd gecombineerd met propidium monoazide (PMA) behandeling voor live cell detectie. Dit protocol is gewijzigd en aangepast om een ​​96-well plaat formaat voor eenvoudige en consistente behandeling van talrijke monsters...

Detectie van Levende<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 cellen door PMA-qPCR

De diagnose van Eimeria-infectie bij kippen blijft veeleisend. Aanpakken gebaseerd op parasietenmorfologie en pathologie van de gastheer zijn vaak niet doorslaggevend, terwijl moleculaire benaderingen op basis van PCR veeleisend zijn gebleken in termen van kosten en expertise. Het doel van dit protocol is om lus-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) te vestigen als een eenvoudige moleculaire diagnose voor eimerian-infectie.

-Loop gemedieerde Isothermisch Amplification (LAMP) Testen voor de Species-specifieke detectie van<em&gt; Eimeria</em&gt; Dat Kippen infecteren

Dit manuscript beschrijft een duplex digitale PCR test die kan worden gebruikt om tegelijkertijd kwantificeren Enterococcus spp. En HF183 genetische merkers als indicatoren van algemene en menselijke-geassocieerde fecale besmetting in recreatiewater.

Een duplex digitale PCR test voor gelijktijdige kwantificering van de<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; En de Human Fecal-geassocieerde HF183 Marker in Waters

We beschrijven een protocol voor colorimetrische detectie van E. coli met behulp van een gemodificeerde lakmoestest die gebruikmaakt van een RNA-splitsend DNAzyme, urease en magnetische kralen.

Colorimetrische Detectie van bacteriën met behulp van lakmoesproef

Het algemene doel van dit protocol is voor het synthetiseren van functionele nanosensors voor de portable, kosteneffectief en snelle detectie van specifiek gericht pathogene bacteriën door een combinatie van magnetische ontspanning en fluorescentie emissie modaliteiten.

Foodborne Pathogen Screening met behulp van Magneto-belichting fluorescerende Nanosensor: Snelle detectie van E. Coli O157:H7

Leer een kleurmetrische detectiemethode voor voedselpathogenen in landbouwwater met Modified Moore Swabs en papiergebaseerde analytische apparaten. Dit protocol verbetert de voedselveiligheid door snelle identificatie van bacteriën.

Colorimetrische Papier-gebaseerde detectie van Escherichia coli, Salmonella Spp. En Listeria monocytogenes Van grote volumes of Agricultural Water (Video) | JoVE Journal

Colorimetrische Papier-gebaseerde detectie van

Meer video's verkennen