Name: Monitoring Activering van de antivirale Pattern Recognition Receptoren RIG-I en PKR Door Limited proteasedigestie en Inheemse PAGE (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Leer hoe je conformationele veranderingen en oligomerisatie van RIG-I en PKR monitort tijdens virale infecties met behperkte trypsine-vertering en native PAGE. Deze methode biedt inzicht in antivirale signaalwegen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Alejandro Brun van CISA-INIA voor het verstrekken van anti-Rift Valley fever virus sera. Werk in onze laboratoria wordt ondersteund door Forschungsförderung gem. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Giessen und Marburg, de Leibniz Graduate School for Emerging virusziekten (EIDIS), de DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, en de DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

1. Zaaien van A549 cellen voor infectie <ol><li> Cultiveren een T75 fles A549 cellen bij 37 ° C en 5% CO2 in celkweekmedium (DMEM gesupplementeerd met 10% FCS, 526,6 mg / l L-glutamine, 50.000 U / l penicilline en 50 mg / l streptomycine). </li><li> Voordat de cellen te oogsten, warm celkweekmedium, PBS en 0,05% trypsine-EDTA in een waterbad verwarmd tot 37 ° C. </li><li> Verwijder het medium en was de cellen met 10 ml PBS. Verwijder de PBS opnieuw. </li><li> Voeg 3 ml trypsine-EDTA en verdeel eveneens in de kolf. Breng de kolf in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Als alle cellen losgemaakt, 7 ml celkweekmedium, resuspendeer de cellen en breng de celsuspensie in een 15 ml Falcon buis. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 800 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 ml vers celkweekmedium. </li><li> Tel de cellen met een telkamer. </li><li> Voeg 2,5 x 10 6 cellen in 5 ml celkweekmedium in twee T25 kolven elk. Incubeer 16 uur bij 37 ° C en 5% CO2. Een fles dient voor de mock-controle en een voor Cl 13 infectie. </li></ol> 2. Infectie met Rift Valley Fever Virus Clone 13 (Cl 13) <ol><li> OPMERKING: Cl 13 is een verzwakt virus mutant die in Duitsland onder BSL-2 aandoeningen kunnen worden behandeld. Gelieve te verwijzen naar relevante nationale richtlijnen. Andere typische IFN inductoren zou Sendai-virus (stam Cantell) of Newcastle disease-virus. </li><li> Pre-warm PBS, serumvrij medium en celkweekmedium bevattende 5% FCS. </li><li> Bereid 1,25 x 10 7 PFU / ml Cl 13 in serumvrij medium tot 2,5 x 10 6 A549 cellen te infecteren met een multipliciteit van infectie (MOI) van 5. Bereid een licht (ongeveer 10%) grotere hoeveelheid dan nodig om rekening te pipet fouten. </li><li> Was de cellen met PBS zoals beschreven onder 1.3. </li><li> Voeg 1 ml van de Cl 13 verdunning ofserumvrij medium (geïnfecteerde controle mock) aan de cellen en incubeer 1 uur bij 37 ° C en 5% CO2. Plaats de kolf zorgvuldig elke 15 minuten een gelijke verdeling van Cl 13 verdunning en serumvrij medium waarborgen, respectievelijk. </li><li> Na 1 uur infectie, verwijdert de inocula, voeg 5 ml voorverwarmde celkweekmedium met 5% FCS, en incubeer gedurende 5 uur bij 37 ° C en 5% CO2. </li></ol> 3. Bereiding van cellysaten <ol><li> Bereid PBS / 0,5% Triton X-100 bij 4 ° C. Heeft serineproteaseremmers niet toevoegen. </li><li> Was de cellen met koude PBS en voeg 10 ml vers PBS. </li><li> Schraap de cellen af, breng de celsuspensie in een Falcon-buis en centrifugeer bij 800 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 30 ul PBS / 0,5% Triton X-100. Breng het lysaat in een schoon 1,5 ml buis en incubeer gedurende ten minste 10 minuten bij 4 ° C. </li><li> Centrifugeer het lysaat 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en breng het geklaarde cellysaat (supernatant) in een schoon buisje. </li><li> Bepaal de eiwitconcentratie door Bradford assay zoals elders 33 beschreven. </li><li> Bewaren bij -20 ° C of overgaan tot trypsinedigestie (4.1) of inheemse PAGE (5.1). </li></ol> 4. Bepaling van Conformational Veranderingen van Pattern Recognition Receptoren <ol><li> TPCK-trypsine behandeling van cellysaten <ol><li> Verdun L-1-tosylamido-2-fenylethyl-chloormethyl keton behandelde (TPCK) trypsine in PBS tot een uiteindelijke werking concentratie van 2 ug / ul. </li><li> Pas in twee nieuwe buizen een uiteindelijke eiwitconcentratie van 25 ug van elk eiwit lysaat (mock of Cl 13) in een eindvolume van 9 ui met PBS. Daarom moet het vier buizen met 25 ug elk lysaat, tweemaal onechte en tweemaal Cl 13 infectie. Een set als input controle (onbehandeld) en een set voor behandeling met TPCK-trypsine. </li><li> Voeg 1 pl PBS (onbehandeld)of 1 ui 2 ug / ul TPCK-trypsine (eindconcentratie: 0,2 ug / ul) aan de cellysaten en meng de reacties van pipetteren. Niet invriezen en ontdooien TPCK-trypsine porties, omdat het de efficiëntie van de spijsvertering in het gedrang brengt. </li><li> Incubeer de lysaten bij 37 ° C gedurende 25 minuten. Stop de reactie door toevoeging 5x denaturerende monsterbuffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% glycerol, 25% β-mercaptoethanol, 0,5% broomfenolblauw) en koken gedurende 5 minuten bij 95 ° C. Het is belangrijk om de trypsine incubatietijd niet uit. Als er geen protease-resistente fragmenten gedetecteerd, moet de tijd van trypsine digestie verkort. </li><li> Na het koken kunnen de monsters bij -20 ° C worden bewaard </li></ol></li><li> SDS polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) en Western Blotting <ol><li> Plaats de monsters op een natriumdodecylsulfaat (SDS) polyacrylamide gel dat 5% stacking over een 12% oplossing gel. Scheid de eiwitten bij 25 mA per gel totde broomfenolblauw opraakt. </li><li> Activeer een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan gedurende 30 seconden met methanol en zet hem in de overdracht buffer (48 mM Tris, 39 mM glycine, 1,3 mm SDS, 20% methanol). </li><li> Bereid de blotting met een halfdroge blotting systeem en toestaan ​​dat het eiwitgehalte bij 10 V gedurende 1 uur. Neem het membraan uit, spoel het kort met water, en laat het drogen. </li><li> Schakel het membraan door kort de overdracht in methanol. Was gedurende 5 minuten met TBS. Blok met 10% afgeroomde melk in TBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of bij 4 ° CO / N. Was het membraan 3x gedurende 5 minuten elk met TBS. </li><li> Bereid antilichaamverdunning zoals aanbevolen in tabel 1 en incubeer het membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of bij 4 ° CO / N. </li><li> Was het membraan 3 x 10 minuten elk met TBS-T. Voeg de juiste secundaire antilichaam gekoppeld aan mierikswortelperoxidase op een 1:20.000 verdunning in 1% magere melk in TBS. Incubeer 45 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was het membraan 3x 10 minuten elk met TBS-T, en one extra tijd met TBS. </li><li> Voor signaaldetectie gebruiken een commerciële chemiluminescense kit en een digitale gel imaging systeem. </li></ol></li><li> Coomassie Brilliant Blue G-250 kleuring <ol><li> Voer SDS-PAGE, zoals beschreven in 4.2.1. Belasting monsters op een SDS-polyacrylamide gel en laat de gel bij 25 mA per gel tot broomfenolblauw opraakt. </li><li> Voer Coomassie Brilliant Blue G-250 kleuring bij RT. Hebben alle incubaties onder constante schudden. </li><li> Breng de gel om de fixatie oplossing met 40% methanol en 10% azijnzuur gedurende 30 minuten. </li><li> Wissel de buffer ontkleuroplossing (25% ethanol en 8% azijnzuur) en incubeer gedurende 5 minuten. </li><li> Vlekken op de gel met 0,2% Coomassie Brilliant Blue G-250 in 40% methanol en 10% azijnzuur gedurende 1 uur. </li><li> Destain de gel met de ontkleuroplossing en wisselen de buffer na 10 min, 30 min en 60 min. </li><li> Bewaar de gel in 25% ethanol, 8% azijnzuur en 4% glycerol bij 4 ° C. </li&gt; <li> Voer beeldvorming en analyse zoals beschreven onder 4.2.8. </li></ol></li></ol> Analyse van Oligomere Staten van Pattern Recognition Receptoren 5. <ol><li> Inheemse PAGINA <ol><li> Bereid 50 pg cellysaat in een eindvolume van 10 pl met PBS en voeg 5 × natieve monsterbuffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 1% natriumdeoxycholaat, 50% glycerol, 0,5% broomfenol blauw) tot een uiteindelijke concentratie van 1x. </li><li> Plaats de monsters ONMIDDELLIJK op een native polyacrylamide gel met 5% als het stapelen en 8% als het oplossen van gel. Elke vertraging resulteert in een verlies van natieve complexen 34. </li><li> Laat de gel bij 20 mA per gel bij 4 ° C met 50 mM Tris-NaOH pH 9,0, 384 mM glycine en als anode en 50 mM Tris pH 8,3, 384 mM glycine, 1% natriumdeoxycholaat als kathode buffer. Na 1,5-2 uur (broomfenolblauw band heeft de gel vertrokken ongeveer 45 min eerder) de elektroforese is voltooid. </li></ol></li><li> Western Blotting <ol><li> Activeer een polyvinylidene fluoride (PVDF) membraan gedurende 30 seconden met methanol en het in Towbin buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,1% SDS, 20% methanol). </li><li> Monteer een natte vlek kamer volgens de instructies van de fabrikant en vult u de tank met Towin buffer. </li><li> Voer de blotting met 250 mA gedurende 1,5 uur bij 4 ° C. </li><li> Wanneer blotting is afgewerkt werk zoals beschreven vanaf 4.2.3 op. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Gurtler, C., Bowie, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+detection+of+microbial+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Innate immune detection of microbial nucleic acids.</a> Trends in Microbiology. 21, 413-420 (2013).</li>
<li>Jensen, S., Thomsen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+of+RNA+viruses%3A+a+review+of+innate+immune+receptors+involved+in+recognizing+RNA+virus+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion.</a> Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).</li>
<li>Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIG-I-like+receptors%3A+cytoplasmic+sensors+for+non-self+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA.</a> Immunological Reviews. 243, 91-98 (2011).</li>
<li>Yoneyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+RIG-I+has+an+essential+function+in+double-stranded+RNA-induced+innate+antiviral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses.</a> Nature Immunology. 5, 730-737 (2004).</li>
<li>Andrejeva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+V+proteins+of+paramyxoviruses+bind+the+IFN-inducible+RNA+helicase%2C+mda-5%2C+and+inhibit+its+activation+of+the+IFN-beta+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The V proteins of paramyxoviruses bind the IFN-inducible RNA helicase, mda-5, and inhibit its activation of the IFN-beta promoter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17264-17269 (2004).</li>
<li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+innate+antiviral+defenses+through+a+shared+repressor+domain%5BTitle%5D)+AND+%22in+RIG-I+and+LGP2+Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Regulation of innate antiviral defenses through a shared repressor domain.</a> in RIG-I and LGP2 Proc Natl Acad Sci USA. 104, 582-587 (2007).</li>
<li>Ferrage, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+dynamics+of+the+second+CARD+of+human+RIG-I+provide+mechanistic+insights+into+regulation+of+RIG-I+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Structure+%28London%2C+England+%3A+1993%29%22%5BJournal%5D)">Structure and dynamics of the second CARD of human RIG-I provide mechanistic insights into regulation of RIG-I activation.</a> Structure (London, England : 1993). 20, 2048-2061 (2012).</li>
<li>Kolakofsky, D., Kowalinski, E., Cusack, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKolakofsky%2C+D+%22A+structure-based+model+of+RIG-I+activation%22">A structure-based model of RIG-I activation</a>. 18, RNA. New York, NY. 2118-2127 (2012).</li>
<li>Luo, D., Kohlway, A., Vela, A., Pyle, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+determinants+of+viral+RNA+recognition+by+innate+immune+sensor+RIG-I%5BTitle%5D)+AND+%22Structure+%28London%2C+England+%3A+1993%29%22%5BJournal%5D)">Visualizing the determinants of viral RNA recognition by innate immune sensor RIG-I.</a> Structure (London, England : 1993). 20, 1983-1988 (2012).</li>
<li>Kowalinski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+activation+of+innate+immune+pattern-recognition+receptor+RIG-I+by+viral+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the activation of innate immune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA.</a> Cell. 147, 423-435 (2011).</li>
<li>Luo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+RNA+recognition+by+RIG-I%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural insights into RNA recognition by RIG-I.</a> Cell. 147, 409-422 (2011).</li>
<li>Habjan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+genome+5%26%2334%3B+termini+as+a+strategy+of+negative-strand+RNA+viruses+to+avoid+RIG-I-dependent+interferon+induction%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Processing of genome 5&#34; termini as a strategy of negative-strand RNA viruses to avoid RIG-I-dependent interferon induction.</a> PloS One. 3, e2032(2008).</li>
<li>Rehwinkel, J., Reis, E. S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+viral+Achilles%27+recognition+of+5%27-triphosphate+RNA+in+innate+anti-viral+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Targeting the viral Achilles' recognition of 5'-triphosphate RNA in innate anti-viral defence.</a> Current Opinion in Microbiology. 16, 485-492 (2013).</li>
<li>Pichlmair, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPichlmair%2C+A+%22RIG-I-mediated+antiviral+responses+to+single-stranded+RNA+bearing+5%27-phosphates%22">RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates</a>. , Science. New York, NY. 314-997 (2006).</li>
<li>Hornung, V., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHornung%2C+V+%225%27-Triphosphate+RNA+is+the+ligand+for+RIG-I%22">5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I</a>. , Science. New York, N.Y. 314-994 (2006).</li>
<li>Saito, T., Gale, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recognition+of+double-stranded+RNA+by+RIG-I-like+receptors+in+antiviral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Differential recognition of double-stranded RNA by RIG-I-like receptors in antiviral immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 205, 1523-1527 (2008).</li>
<li>Takahasi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonself+RNA-sensing+mechanism+of+RIG-I+helicase+and+activation+of+antiviral+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Nonself RNA-sensing mechanism of RIG-I helicase and activation of antiviral immune responses.</a> Mol Cell. 29, 428-440 (2008).</li>
<li>Binder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+signal+perception+and+integration+by+the+innate+immune+sensor+retinoic+acid-inducible+gene-I+%28RIG-I%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of signal perception and integration by the innate immune sensor retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I).</a> J Biol Chem. 286, 27278-27287 (2011).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-induced+oligomerization+of+the+RNA+sensors+RIG-I+and+MDA5+activates+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-induced oligomerization of the RNA sensors RIG-I and MDA5 activates antiviral innate immune response.</a> Immunity. 36, 959-973 (2012).</li>
<li>Civril, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIG-I+ATPase+domain+structure+reveals+insights+into+ATP-dependent+antiviral+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">The RIG-I ATPase domain structure reveals insights into ATP-dependent antiviral signalling.</a> EMBO reports. 12, 1127-1134 (2011).</li>
<li>Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+the+innate+antiviral+response+through+IRF-3+activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Triggering the innate antiviral response through IRF-3 activation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282, 15325-15329 (2007).</li>
<li>Hertzog, P. J., Williams, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+tuning+type+I+interferon+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokin.%2C+%26+Growth+Factor+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fine tuning type I interferon responses.</a> Cytokin., & Growth Factor Reviews. 24, 217-225 (2013).</li>
<li>Pindel, A., Sadler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+protein+kinase+R+in+the+interferon+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Interfero.%2C+%26+Cytokine+Research+%3A+the+Official+Journal+of+the+International+Society+for+Interferon+and+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">The role of protein kinase R in the interferon response.</a> Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 31, 59-70 (2011).</li>
<li>Donnelly, N., Gorman, A. M., Gupta, S., Samali, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eIF2alpha+kinases%3A+their+structures+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences+CMLS%22%5BJournal%5D)">The eIF2alpha kinases: their structures and functions.</a> Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 70, 3493-3511 (2013).</li>
<li>Cole, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+PKR+an+open+and+shut+case%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Activation of PKR an open and shut case.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32, 57-62 (2007).</li>
<li>Dauber, B., Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Antiviral+Kinase+PKR+and+Viral+Countermeasures%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Activation of the Antiviral Kinase PKR and Viral Countermeasures.</a> Viruses. 1, 523-544 (2009).</li>
<li>Dey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+link+between+PKR+dimerization%2C+autophosphorylation%2C+and+eIF2alpha+substrate+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanistic link between PKR dimerization, autophosphorylation, and eIF2alpha substrate recognition.</a> Cell. 122, 901-913 (2005).</li>
<li>Gack, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM25+RING-finger+E3+ubiquitin+ligase+is+essential+for+RIG-I-mediated+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity.</a> Nature. 446, 916-920 (2007).</li>
<li>Zeng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+RIG-I+pathway+reveals+a+signaling+role+of+unanchored+polyubiquitin+chains+in+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity.</a> Cell. 141, 315-330 (2010).</li>
<li>Anderson, E., Cole, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+stabilities+in+protein+kinase+R+%28PKR%29%3A+evidence+for+weak+interdomain+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Domain stabilities in protein kinase R (PKR): evidence for weak interdomain interactions.</a> Biochemistry. 47, 4887-4897 (2008).</li>
<li>Habjan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+rift+valley+fever+virus+induces+the+specific+degradation+of+the+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">NSs protein of rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> Journal of Virology. 83, 4365-4375 (2009).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incoming+RNA+virus+nucleocapsids+containing+a+5%27-triphosphorylated+genome+activate+RIG-I+and+antiviral+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Hos.%2C+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Incoming RNA virus nucleocapsids containing a 5'-triphosphorylated genome activate RIG-I and antiviral signaling.</a> Cell Hos., & Microbe. 13, 336-346 (2013).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+limitations+of+clear-native%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Advantages and limitations of clear-native.</a> 5, 4338-4346 (2005).</li>
<li>Muller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clone+13%2C+a+naturally+attenuated+avirulent+isolate+of+Rift+Valley+fever+virus%2C+which+is+altered+in+the+small+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment.</a> Am J Trop Med Hyg. 53, 405-411 (1995).</li>
<li>Bouloy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+for+an+interferon-antagonistic+function+of+rift+valley+fever+virus+nonstructural+protein+NSs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs.</a> Journal of Virology. 75, 1371-1377 (2001).</li>
<li>Ikegami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+protein+promotes+post-transcriptional+downregulation+of+protein+kinase+PKR+and+inhibits+eIF2alpha+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation.</a> PLoS Pathogens. 5, e1000287(2009).</li>
<li>Iwamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+IRF-3%2F-7+kinase+and+NF-kappaB+in+response+to+double-stranded+RNA+and+virus+infection%3A+common+and+unique+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells+%3A+Devoted+to+Molecula.%2C+%26+Cellular+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways.</a> Genes to Cells : Devoted to Molecula., & Cellular Mechanisms. 6, 375-388 (2001).</li>
<li>Yoneyama, M., Suhara, W., Fujita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+IRF-3+activation+by+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Interfero.%2C+%26+Cytokine+Research+%3A+the+Official+Journal+of+the+International+Society+for+Interferon+and+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">Control of IRF-3 activation by phosphorylation.</a> Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 22, 73-76 (2002).</li>
<li>Bamming, D., Horvath, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+signal+transduction+by+enzymatically+inactive+antiviral+RNA+helicase+proteins+MDA5+RIG-I+and+LGP2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of signal transduction by enzymatically inactive antiviral RNA helicase proteins MDA5 RIG-I and LGP2.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 9700-9712 (2009).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+dsRNA+recognition%2C+filament+formation%2C+and+antiviral+signal+activation+by+MDA5%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for dsRNA recognition, filament formation, and antiviral signal activation by MDA5.</a> Cell. 152, 276-289 (2013).</li>
<li>Berke, I. C., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDA5+cooperatively+forms+dimers+and+ATP-sensitive+filaments+upon+binding+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">MDA5 cooperatively forms dimers and ATP-sensitive filaments upon binding double-stranded RNA.</a> The EMBO Journal. 31, 1714-1726 (2012).</li>
<li>Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+evasion+of+type+I+interferon+responses+by+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Induction and evasion of type I interferon responses by influenza viruses.</a> Virus Research. 162, 12-18 (2011).</li>
<li>Taylor, K. E., Mossman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+understanding+viral+evasion+of+type+I+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in understanding viral evasion of type I interferon.</a> Immunology. 138, 190-197 (2013).</li>
<li>Goodbourn, S., Randall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+type+I+interferon+production+by+paramyxoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Interfero.%2C+%26+Cytokine+Research+%3A+the+Official+Journal+of+the+International+Society+for+Interferon+and+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">The regulation of type I interferon production by paramyxoviruses.</a> Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 29, 539-547 (2009).</li>
<li>Versteeg, G. A., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+tricks+to+grid-lock+the+type+I+interferon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Viral tricks to grid-lock the type I interferon system.</a> Current Opinion in Microbiology. 13, 508-516 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Het aftasten van de aanwezigheid van virussen en activering van de antivirale type I IFN-systeem zijn van cruciaal belang voor een succesvolle aangeboren immuunrespons 22. Virusdetectie wordt daarbij gemedieerd door pathogeen herkenning receptoren (PRRS) zoals RIG-I en PKR, waardoor een snelle reactie en activering van antivirale afweermechanismen. Hier beschrijven we twee methoden om de activatie status van RIG-I en PKR direct evalueren. Beperkte protease digestie als een instrum...

Een belangrijke gebeurtenis in antivirale afweer is de snelle detectie van de pathogeen door het zogenaamde patroonherkenning receptoren (PRRS) 1,2. Intracellulaire detectie van RNA-virus infectie is afhankelijk van twee cytoplasmatische RNA helicases, RIG-I (retinoëzuur induceerbare gen I) en MDA5 (melanoom differentiatie associated protein 5) 3-5. RIG-I bestaat uit twee N-terminale caspase recruitment domein (CARDS), een centrale soort DECH-box RNA helicase domein en een C-eindstandige domein (CTD) 4,6. Overwegende dat de CTD en de helicasedomein nodig zijn voor de erkenning van niet-zelf (virale) RNA&#39;s, de kaarten bemiddelen downstream signalering leidt tot de vestiging van een antivirale hoststatus. Als RIG-I in het rustige toestand, dat wil zeggen in afwezigheid van een specifiek RNA-ligand, de tweede CARD samenwerkt met de centrale helicase domein en houdt RIG-I bij een auto-remmende conformatie 7-11. RIG-I bindt aan de korte double-streng (ds) RNA die van een 5&#39;-trifosfaat (5&#39;PPP), lange dsRNA en PolyU / UC-rijke RNA, klassieke handtekening structuren die aanwezig zijn op de genomen van vele RNA-virussen 12-16 zijn. Twee belangrijke kenmerken van RIG-I activering zijn een overstap naar een gesloten conformatie 6,17 en de homo-oligomerisatie 6,18,19. De conformatie schakelaar verbetert RNA-bindende, onthult de kaarten voor downstream signalering, en reconstrueert een actieve ATPase plaats 8,9,11,20. De vorming van oligomere RIG-I complexen leidt tot een verhoogde rekrutering van downstream signaling adapter moleculen om zo een platform voor antivirale signaaltransductie 11 te vormen. De RIG-I-gereguleerde signalisatie keten uiteindelijk activeert de transcriptiefactor IRF-3 voor up-regulatie van interferon (IFN-alpha/beta) genen en daarmee de genexpressie van interferon gestimuleerde genen (ISGs) voor een volledige antivirale respons 21,22 . Een van de best gekarakteriseerde ISGs de RNA-geactiveerde protein kinase (PKR) 23. PKR behoort tot de familie van eukaryotische translatie initiatie factor 2 alpha (eIF2α) kinasen en bestaat uit een N-terminaal dubbelstrengs RNA-bindend domein en een C-terminaal kinase domein. Het kinasedomein vormen de dimerisatie-interface cruciaal voor PKR activering en voert de katalytische functie van het eiwit. Binding van PKR om virale dsRNA leidt tot de vormverandering toelaat dimerisatie en auto-fosforylatie op Thr 446 onder andere resten. PKR bemiddelt dan fosforylering van eIF2α, waardoor de translatie van virale mRNAs 23-27 blokkeren. Beide RIG-I en PKR ondergaan grote structurele herschikkingen, vormen oligomere complexen en zijn post-translationeel gemodificeerd door fosforylering / defosforylerings en ​​ubiquitination 10,11,19,23,24,26-29. Voor een beter begrip van die viraal RNA structuren activeren RIG-I en PKR (en in welk stadium virale antagonisten kon be storende), is het belangrijk om de activeringsstatus nauwkeurig te bepalen. Voor beide PRRs werd eerder beschreven dat activatie leidt tot het ontstaan ​​van trypsine-resistente eiwitfragmenten 6,17,30 en hogere-orde oligomeren 6,18,19. Echter, gezien de grote hoeveelheid literatuur over deze belangrijke factoren van de antivirale gastheerreactie 1,2,24, toepassing van directe methoden lijkt betrekkelijk zeldzaam. In de hoop van het stimuleren van bredere gebruik, bieden wij handige en gevoelige protocollen krachtig analyseren de activering staten van RIG-I en PKR. De IFN bevoegde menselijke cellijn A549 is geïnfecteerd met een gevestigde activator van RIG-I en PKR, het verzwakt Rift Valley fever virus mutant kloon 13 (Cl 13) 31,32. Na een eenvoudige lyseren procedure worden de extracten van geïnfecteerde cellen getest door beperkte trypsinedigestie / western blot analyse conformationele schakelen evalueren en blauwe natieve polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) / Western blot analysis de vorming van oligomeren te meten.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Celcultuur</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s gemodificeerd Eagle&rsquo;s medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>21969-035</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Gibco</td><td>31985-47</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>PAA</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>PAA</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runderserum (FCS)</td><td>PAA</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Chemicaliën</td></tr><tr><td>L-1-tosylamino-2-fenylethyl chloormethylketon-behandeld (TPCK) trypsine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Antilichamen</td></tr><tr><td>Muis monoklonaal anti-RIG-I antilichaam (ALME-1)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-804-849-C100</td><td>WB: 1:500 in 1% magere melk in TBS</td></tr><tr><td>Muis monoklonaal anti-PKR (B10)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6282</td><td>WB: 1:500 in 1% magere melk in TBS</td></tr><tr><td>Konijn monoklonaal anti-P-PKR (Thr446)</td><td>Epitomics</td><td>1120-1</td><td>WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS</td></tr><tr><td>Konijn polyklonaal anti-IRF-3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9082</td><td>WB: 1:500 in 1% magere melk in TBS</td></tr><tr><td>Konijn monoklonaal anti-P-IRF-3 (Ser386)</td><td>IBL</td><td>og-413</td><td>WB: 1:100 in 1% magere melk in TBS</td></tr><tr><td>Konijn anti-RVFV hyperimmuun serum "C2" (MP-12)</td><td>Vriendelijk ter beschikking gesteld door Alejandro Brun CISA-INIA</td><td></td><td>WB: 1:2.000 in 1% magere melk in TBS</td></tr><tr><td>Muis monoklonaal anti-beta-actine (8H10D10)</td><td>Cell Signalling</td><td>3700</td><td>WB: 1:1.000 in 1% magere melk in TBS</td></tr><tr><td>Polyklonaal peroxidaseverbonden geitenanti-konijn</td><td>Thermo Fisher</td><td>0031460 1892914</td><td>WB: 1:20.000 in 1% magere melk in TBS</td></tr><tr><td>Polyklonaal peroxidaseverbonden geitenanti-muis</td><td>Thermo Fisher</td><td>0031430 1892913</td><td>WB: 1:20.000 in 1% magere melk in TBS</td></tr></tbody></table>

monitoring activering van de antivirale pattern recognition receptoren rig-i en pkr door limited proteasedigestie en inheemse page

Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

De afweer van virus infectie zijn afhankelijk van een snelle detectie van patroonherkenning receptoren (PRRS) van het aangeboren immuunsysteem. In het cytoplasma, het PRRS RIG-I en PKR binden aan specifieke virale RNA-liganden. Deze eerste bemiddelt conformationele schakelen en oligomerisatie, en voorziet activering van een interferon antivirale respons. Terwijl methoden om antivirale gastheer genexpressie te meten zijn goed ingeburgerd, methoden om de activering staten van RIG-I en PKR direct monitoren zijn slechts gedeeltelijk en minder goed ontwikkeld. Hier beschrijven we twee methoden om RIG-I en PKR stimulatie na infectie met een gevestigde interferoninductor, de Rift Valley fever virus mutant kloon 13 (Cl 13) monitor. Beperkte trypsine digestie maakt wijzigingen analyseren protease gevoeligheid aangeeft conformatieveranderingen van het PRRS. Trypsinedigestie van lysaten van mock-geïnfecteerde cellen resulteert in een snelle afbraak van RIG-I en PKR, whereas Cl 13 infectie leidt tot de opkomst van een protease-resistente RIG-I-fragment. Ook PKR toont een virus-geïnduceerde gedeeltelijke resistentie tegen trypsinedigestie, die samenvalt met het keurmerk fosforylering op Thr 446. De vorming van RIG-I en PKR oligomeren werd gevalideerd door native polyacrylamidegelelektroforese (PAGE). Na infectie, is er een sterke ophoping van RIG-I en PKR oligomere complexen, dat deze eiwitten bleef monomeren in mock geïnfecteerde monsters. Limited proteasedigestie en inheemse PAGE, beide gekoppeld aan western blot-analyse, zodat een gevoelige en directe meting van twee verschillende stappen van RIG-I en PKR activering. Deze technieken zijn betrekkelijk eenvoudig en snel uit te voeren en geen dure apparatuur vereisen.

Erkenning van een virale agonist door RIG-I of PKR triggers conformationele schakelen 6,17,30 en oligomerization 6,18,27. We getest deze twee merkers van activatie van beperkte protease digestie en natieve polyacrylamide gelelektroforese (PAGE), respectievelijk. Humane A549 cellen werden geïnfecteerd met riftdalkoorts viruskloon 13 (Cl 13), die wordt gekenmerkt door een mutatie van de IFN-antagonist-NSS 35,36. Door de afwezigheid van functionele NSS, Clone 13...

Aangeboren afweer tegen virus infecties worden veroorzaakt door patroonherkenning receptoren (PRRS). De twee cytoplasmatische PRRs RIG-I en PKR binden aan virale handtekening RNA&#39;s, verandering conformatie, oligomeriseren, en activeer antivirale signalering. Werkwijzen worden beschreven die laten gemakkelijk controleren conformationele schakelen en de oligomerisatie van deze cytoplasmatische PRRS.

Monitoring Activering van de antivirale Pattern Recognition Receptoren RIG-I en PKR Door Limited proteasedigestie en Inheemse PAGE

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, ...

Aangeboren afweer tegen virale infecties wordt geactiveerd door patroonherkenningsreceptoren of PRR's. Deze zijn aanwezig in cellen van het aangeborene immuunsysteem tijdens een infectie. De cytoplasmatische PRR's RIG-I en PKR binden aan virale signatuur-RNA's, ondergaan een conformationele verandering na ligatie en activeren antivirale signalering. Om de conformationele veranderingen en ligatie van RIG-I en PKR in vitro te monitoren, worden humane A549-cellen geïnfecteerd met het Rift Valley-koortsvirus.Kloon 13 om PRR-activatie te stimuleren. Cellysaten van controlecellen en geïnfecteerde cellen worden vervolgens klaargemaakt om te analyseren op conformationele veranderingen van RIG-I en PKR. Er wordt een beperkte trypsinevertering uitgevoerd.Indien er conformationele veranderingen in de proteïnestructuur zijn opgetreden, is het proteïne resistenter tegen digestie en zullen er bij Western blotting-analyse banden zichtbaar zijn om de vorming van oligomeren te analyseren; hiervoor wordt een native page uitgevoerd, gevolgd door Western blotting-analyse. Als volledige oligomerisatie heeft plaatsgevonden, zijn hogere oligomeren en PKR-complexen zichtbaar. Het belangrijkste voordeel va

monitoring-activation-antiviral-pattern-recognition-receptors-rig-i

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We beschrijven een protocol om de belangrijkste taken van gastheer signaalmoleculen in lytische replicatie van een model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (γHV68) te identificeren. Gebruik te maken van genetisch gemodificeerde muizenstammen en embryonale fibroblasten voor γHV68 lytische replicatie, het protocol maakt het mogelijk zowel de fenotypische karakterisatie en moleculaire ondervraging van virus-gastheer interacties in virale lytische replicatie.

Opheldering van Host-virus interactie in Lytische Replicatie van een Model Herpesvirus

Source: Mateer, E., et al., Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the confocal imaging of viral double-stranded RNA (dsRNA) and cytoplasmic pattern recognition receptors (PRRs) in virus-infected epithelial cells. It highlights how antibody-based fluorescent labeling reveals the interaction between viral replication intermediates and host immune sensors.

Visualization of Viral Double-Stranded RNA and Host Pattern Recognition Receptors in Infected Epithelial Cells

We beschrijven een protocol bij de antivirale cytokine productie in muizen geïnfecteerd met een model herpesvirus, muizen gamma herpesvirus 68 (γ HV68) die nauw verwant aan humane Kaposi-sarcoom geassocieerde herpesvirus (KSHV) en Epstein-Barr virus (EBV) te meten. Gebruik makend van genetisch gemodificeerde muizen en muis embryonale fibroblasten (MEF) hebben we de antivirale cytokine productie zowel in vivo als ex vivo. "Bereiding" de uitdrukking van aangeboren immuunsysteem componenten in...

Ontleden Innate Immune Signalering in Viral Evasion van cytokine productie

Hier beschrijven we een procedure die een gedetailleerde analyse mogelijk maakt van de fosforyleringsafhankelijke activering van de IRF3-transcriptiefactor. Dit wordt bereikt door de combinatie van een hoge resolutie SDS-PAGE en een native-PAGE gekoppeld aan immunoblots met behulp van meerdere fosfospecifieke antilichamen.

Een hoge resolutie methode om Fosforylatie-afhankelijke activering van IRF3 Monitor

Double-stranded RNA geproduceerd tijdens de replicatie van RNA-virus kan worden herkend door patroon erkenning receptoren voor het opwekken van een aangeboren immuunrespons. Voor negatieve-gevoel van RNA-virussen blijft de interactie tussen de low-level dsRNA en PRRs onduidelijk. We hebben een confocale microscopie methode ontwikkeld om visualiseren Arenavirussen dsRNA en PRR in afzonderlijke cellen.

Confocale beeldvorming van Double-Stranded RNA en patroon erkenning receptoren in negatief-Sense RNA-virusinfectie

Wij presenteren experimentele benaderingen voor studeren RNA-interactors van double-stranded RNA bindend proteïne kinase RNA-geactiveerd (PKR) tijdens de zoogdieren celcyclus met behulp van HeLa cellen. Deze methode maakt gebruik van formaldehyde dwarslijn RNA-PKR complexen en immunoprecipitation te verrijken van PKR-gebonden RNAs. Deze RNAs kunnen verder worden geanalyseerd door middel van high-throughput sequencing of qRT-PCR.

Bestuderen van RNA Interactors van proteïne Kinase RNA-geactiveerd tijdens de zoogdieren celcyclus

Een native Western Blot-methode voor het analyseren van endogene interferon regulatoire factor 5 door dimerisatie in de CAL-1 plasmacytoïde dendritische cellijn wordt beschreven. Dit protocol kan ook worden toegepast op andere cellijnen.

Inheemse polyacrylamidegel elektroforese immunoblot analyse van endogene IRF5 Dimerization

We presenteren een algemeen protocol voor het identificeren van korte stukken van homologe gastheer-pathogen eiwit sequenties (SSHHP'S) ingebed in de virale poly eiwit. SSHHP'S worden herkend door virale proteasen en richten de gerichte vernietiging van specifieke gastheer proteïnen op door verschillende groep IV virussen.

Analyse van virale SSHHP'S in groep IV met gebruikmaking van in vitro en silico-methoden

Dit protocol beschrijft een uitgebreide methode voor het beoordelen van caspase-activering (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 en caspase-11) in reactie op zowel in vitro als in vivo (bij muizen) modellen van infectie, steriele beledigingen en kanker om de initiatie van celdoodroutes te bepalen, zoals pyroptose, apoptose, necroptose en PANoptose.

Evaluatie van Caspase-activering om aangeboren immuunceldood te beoordelen

Tyramide signaalversterking tijdens immunofluorescente kleuring maakt de gevoelige detectie van gefosforyleerde RIPK3 en MLKL mogelijk tijdens ZBP1-geïnduceerde necroptose na HSV-1-infectie.

Tyramide signaalversterking voor de immunofluorescente kleuring van ZBP1-afhankelijke fosforylering van RIPK3 en MLKL na HSV-1-infectie in menselijke cellen

Leer hoe je conformationele veranderingen en oligomerisatie van RIG-I en PKR monitort tijdens virale infecties met behperkte trypsine-vertering en native PAGE. Deze methode biedt inzicht in antivirale signaalwegen.

Monitoring Activering van de antivirale Pattern Recognition Receptoren RIG-I en PKR Door Limited proteasedigestie en Inheemse PAGE (Video) | JoVE Journal

Monitoring Activering van de antivirale Pattern Recognition Receptoren RIG-I en PKR Door Limited proteasedigestie en Inheemse PAGE

Meer video's verkennen