Monitoring Activering van de antivirale Pattern Recognition Receptoren RIG-I en PKR Door Limited proteasedigestie en Inheemse PAGE

Aangeboren afweer tegen virale infecties wordt geactiveerd door patroonherkenningsreceptoren of PRR's. Deze zijn aanwezig in cellen van het aangeborene immuunsysteem tijdens een infectie. De cytoplasmatische PRR's RIG-I en PKR binden aan virale signatuur-RNA's, ondergaan een conformationele verandering na ligatie en activeren antivirale signalering. Om de conformationele veranderingen en ligatie van RIG-I en PKR in vitro te monitoren, worden humane A549-cellen geïnfecteerd met het Rift Valley-koortsvirus.

Kloon 13 om PRR-activatie te stimuleren. Cellysaten van controlecellen en geïnfecteerde cellen worden vervolgens klaargemaakt om te analyseren op conformationele veranderingen van RIG-I en PKR. Er wordt een beperkte trypsinevertering uitgevoerd.

Indien er conformationele veranderingen in de proteïnestructuur zijn opgetreden, is het proteïne resistenter tegen digestie en zullen er bij Western blotting-analyse banden zichtbaar zijn om de vorming van oligomeren te analyseren; hiervoor wordt een native page uitgevoerd, gevolgd door Western blotting-analyse. Als volledige oligomerisatie heeft plaatsgevonden, zijn hogere oligomeren en PKR-complexen zichtbaar. Het belangrijkste voordeel van beperkte proteasedigestie en native page is dat deze technieken de directe meting van RIG-I- en PKR-activatie faciliteren.

Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van aangeboren immuniteit, zoals wat de exacte aard en oorsprong is van de RNA-soorten die relevant zijn voor de activatie van RIG-I en PKR. Deze methoden kunnen inzicht bieden in RIG-I- en PKR-agonisten. Ze kunnen ook worden toegepast op andere cytoplasmatische sensorproteïnen, zoals MDA5; de procedure zal worden gedemonstreerd door Mila Viva, een PhD-student uit mijn laboratorium, voordat deze procedure wordt gestart.

Let op dat het Rift Valley Fever-virus kloon 13, hierna aangeduid als CL 13, een geattenueerde virusmutant is die in Duitsland onder BSL-2-condities moet worden gehanteerd om PBS serumvrij medium en celkweekmedium met 5% FCS voor te verwarmen. Plaats deze in een waterbad in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter. Bereid 1,25 × 10⁷ PFU per milliliter van CL 13 in serumvrij medium om 2,5 × 10⁶ te infecteren.

Besmet A 5 49-cellen met een multipliciteit van infectie of MOI van vijf; bereid ongeveer 10% meer voor dan nodig om rekening te houden met pipetteerfouten. Haal de A 5 49-cellen uit de incubator, aspireer het medium en voeg 10 milliliters PBS toe. Draai of kantel de kweekfles om de cellen te wassen en verwijder vervolgens de PBS. Voeg daarna één milliliter van de verdunde CL 13 toe, of gebruik voor de niet-geïnfecteerde controle een mock-infectie.

Voeg één milliliter serumvrij medium toe en incubeer gedurende één uur, waarbij elke 15 minuten wordt bewogen. Kantel de kolf voorzichtig om een gelijke verdeling van het medium te waarborgen. Verwijder na één uur infectie het inoculum.

Voeg vijf milliliter voorverwarmd celkweekmedium met 5% FCS toe en incubeer gedurende vijf uur. Bereid PBS met 0,5% Triton X 100 en bewaar dit bij vier graden Celsius. Voeg geen Syrische protease-remmers toe.

Was de cellen vervolgens met koud PBS en voeg 10 milliliters vers PBS toe. Los daarna de cellen met een celscraper los van de schaal. Draag de celsuspensie over naar een conische buis van 15 milliliter en centrifugeer 5 minuten bij 800 times G bij kamertemperatuur.

Verwijder na het centrifugeren het supernatant en resuspendeer de celpellet in 30 µL PBS met 0,5% Triton X 100. Breng het lysaat over in een nieuwe buis van 1,5 mL en incubeer dit gedurende ten minste 10 minuten op ijs. Centrifugeer het lysaat 10 minuten lang bij 10.000 ×g bij 4 °C.

Breng na de centrifugatie het geklaarde cellysaat over naar een nieuwe buis. Voer een Bradford-assay uit om de eiwitconcentratie in het geklaarde cellysaat te bepalen. Bewaar dit bij -20 °C of ga direct over tot trypsinevertering of native PAGE om conformationele veranderingen van patroonherkenningsreceptoren te analyseren. Verdun eerst L1 tot een werkconcentratie van 2 µg/mL chloro-methylketon-behandelde of TPCK-trypsine in PBS in twee nieuwe buizen voor elke conditie. Pas de uiteindelijke eiwitconcentratie van de CL 13- en niet-geïnfecteerde controle-eiwitlysaten aan naar 25 µg in een eindvolume van 9 µL met PBS. Eén set lysaten wordt gebruikt als inputcontrole en de andere wordt behandeld met TPCK-trypsine. Voeg aan de onbehandelde controlebuizen 1 µL PBS toe aan de overige twee buizen.

Voeg één µL TPCK-trypsine met een concentratie van 2 µg/µL toe om de uiteindelijke concentratie op 0,2 µg/µL te brengen. Meng de reacties door te pipetteren. Incubeer de lysaten gedurende 25 minuten bij 37 °C.

Stop de reactie door vijf x denaturerende monsterbuffer toe te voegen en vervolgens vijf minuten te koken bij 95 °C. Het is belangrijk om de incubatietijd van de trypsine niet te verlengen. Houd er rekening mee dat een nauwkeurige timing van de trypsinevertering cruciaal is voor de detectie van resistente fragmenten zonder achtergrond; indien er geen resistente eiwitten worden gedetecteerd of als er er te veel worden gedetecteerd, dient de duur van de vertering dienovereenkomstig te worden aangepast.

Bewaar de monsters na het koken bij -20 °C of breng de monsters aan op twee sodiumdodecylsulfaat-polyacrylamidegels, bestaande uit een stapelgel van 5% boven een scheidingsgel van 12%. Scheid de eiwitten bij 25 mA per gel totdat het broomfenolblauw is uitgelopen.

Na het draaien van de gels worden de eiwitten van één gel overgebracht naar een polyvinylfluoride-membraan en geanalyseerd via western blotting met antilichamen gericht tegen RIG-I en PKR; de andere gel wordt gekleurd met Coomassie Brilliant Blue G-250. Bewaar de gel vervolgens in 25% ethanol, 8% azijnzuur en 4% glycerol bij 4 °C, of ga over tot beeldvorming en analyse. Om de oligomere toestanden van patroonherkenningsreceptoren te analyseren, worden 50 µg cellificaat in een eindvolume van 10 µL met PBS klaargemaakt, waarna 5x monsterbuffer wordt toegevoegd tot een eindconcentratie van 1x.

Laad de monsters onmiddellijk op een native polyacrylamidegel met een 5% stackinggel en een 8% resolvinggel. Elke vertraging zal leiden tot een verlies van native complexen. Laat de gel lopen bij 20 milliampère per gel bij vier graden Celsius.

Stop de elektroforese 45 minuten nadat de broomfenolblauw-band de gel heeft verlaten, na in totaal ongeveer 1,5 tot twee uur. Voer vervolgens Western blotting uit met antilichamen gericht tegen RIG-I en PKR, zoals beschreven in het bijbehorende document, om conformationele schakeling en oligo-inductie door herkenning van een viraal agonist door RIG-I of PKR te analyseren. Beperkte proteasedigestie en native PAGE werden uitgevoerd zoals beschreven in deze video; trypsinedigestie van mock-geïnfecteerde cellysaten resulteerde in een snelle degradatie van RIG-I, terwijl infectie met kloon 13 leidde tot de generatie van een resistent RIG-I-fragment van 30 kilodalton. PKR vertoont eveneens gedeeltelijke resistentie tegen trypsinedigestie in geïnfecteerde monsters, wat samenvalt met de fosforylering ervan. Om de efficiëntie en specificiteit van de trypsinedigestie te monitoren, werden de gels gekleurd met Coomassie Brilliant Blue G-250. Onbehandelde monsters vertonen gelijke hoeveelheden geladen eiwitten; het onderwerpen van mock- en C13-cellysaten aan trypsinedigestie leidt tot een vergelijkbare afname van de globale eiwithoeveelheden.

Dit toont aan dat tripsinebehandeling dezelfde efficiëntie heeft voor mock- en CL 13-geïnfecteerde monsters in niet-geïnfecteerde cellen. Alleen monomeren van R EYE en PKR werden gedetecteerd als aanvullende controle. De transcriptiefactor IRF three werd toegevoegd, die als monomeer aanwezig is, maar bekend staat om zijn dimerisatie bij activatie via R Eye.

Infectie met kloon 13 leidt tot een sterke accumulatie van rig eye oligomere complexen in de vorm van een smear, en van PKR- en IRF drie-dimeren of oligomeren als een gedefinieerde eiwitband. Deze resultaten tonen aan dat beperkte trips bij digestie en native page nuttige instrumenten zijn om conformationele veranderingen en oligo-vorming van rig eye en PKR na infectie te monitoren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het conformationele schakelen en de oligomerisatie van WIC eye en PKR kunt monitoren zodra u deze technieken beheerst.

Deze techniek kan in twee dagen worden uitgevoerd volgens deze procedure. Aanvullende methoden, zoals pro-assays, kunnen worden uitgevoerd om extra vragen te beantwoorden, zoals of er een stabiele interactie is met het stimulerende ligand na de ontwikkeling ervan. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van de aangeboren immuniteit om de activatiestatus van patroonherkenningsreceptoren in viraal gestimuleerde cellen te onderzoeken.