Name: Juxtacellular Monitoring en lokalisatie van Single neuronen in Sub-corticale hersenstructuren van Alert, Head ingetogen Ratten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Leer juxtacellulaire monitoring en lokalisatie van enkele neuronen in subcorticale hersenstructuren bij alerte, hoofd-vastgezette ratten. Deze methode maakt ondubbelzinnige isolatie van spiking-activiteit mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We zijn dankbaar aan de Canadian Institutes of Health Research (subsidie MT-5877), de National Institutes of Health (subsidies NS058668 en NS066664), en de US-Israeli Binational Foundation (subsidie 2003222) voor het financieren van deze studies.

Experimentele protocollen werden uitgevoerd op vrouwelijke Long Evans ratten (250-350 g) in overeenstemming met de federale overheid voorgeschreven verzorging van dieren en het gebruik richtlijnen en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Californië in San Diego. 1. acclimating de Rat naar Body Restraint OPMERKING: Plaats de rat op een beperkt dieet. Voer de rat eenmaal per dag direct na elke dagelijkse behandeling sessie de rat wennen aan de hoofdsteun (hieronder beschreven). Laat voldoende voer aan het dier op 80% van zijn aanvankelijke gewicht. Dit bedrag is ongeveer 6 gram voer per dag voor een 250 g vrouwelijke Long Evans ratten. <ol><li> Acclimatiseren de rat te worden behandeld door de mens. Zachtjes weerhouden de rat door de hand voor een periode van ongeveer 5 sec elke 30 sec. Doe dit gedurende 15 minuten per dag op 2 opeenvolgende dagen. Toezien op de ratten dagelijks op tekenen van stress tijdens de stageperiode. Verschijnselen zijn onder meer worstelen in reactie op terughoudendheid, stemgebruik, en tand-geklets. </li><li> Op de 3e dag, plaats de rat in een lichaam beperkende doek sok (Figuur 1) gedurende 15 minuten per dag op twee opeenvolgende dagen. </li><li> Op de 5de dag, plaats de rat in de sok en plaats de sok in een stijve buis van de experimentele mal (figuur 4). Laat de rat in de buis gedurende 15 minuten per dag 2 opeenvolgende dagen. </li><li> Voeden de rat direct na elke training. Aan het einde van de laatste sessie (6e dag) geven onbeperkte toegang tot voedsel. Kies voor implantatie alleen die ratten die geen tekenen van overmatige stress op de laatste trainingsdag vertonen. OPMERKING: Hoewel winkelwagentje ratten implantatie subjectief, in onze handen dan 90% van de ratten bleken reageert op gewenning en kunnen implantatie te ondergaan. </li></ol> 2. Implantatie van de opname kamer en hoofd-terughoudendheid mechanisme <ol><li> Maak een reconferentie draad door solderen blote roestvrij staaldraad om een ​​pin connector. Snijd de draad zodat 3-5 mm overblijfselen ontdekt door de pin. Autoclaaf de referentiedraad, samen met chirurgische instrumenten. </li><li> Dien ketamine / xylazine. Dien 95 mg / kg ketamine gemengd met 5 mg / kg xylazine intraperitoneaal. De initiële dosering duurt 1½ tot 2 uur. Supplement de anesthesie daarna elke 30-45 min, indien nodig. Smeer ogen van het dier met een oogzalf. </li><li> Controleer de teen terugtrekking reflex op het vlak van anesthesie bepalen en anesthesie handhaven nodig. </li><li> Plaats de rat in een stereotaxisch bedrijf frame met oor bars (Figuur 3A). Scheer het haar op het hoofd en ontsmet de wond met povidon-jood (10% oplossing). Zorg voor het oor bars juiste plaatsen zodat ze niet het trommelvlies beschadigen. Oor bars met stompe uiteinden zijn voorkeur. </li><li> Maak een insnijding met een scalpel onderlingeveer langs de middellijn van de schedel van de rostro-caudale ooghoogte aan de achterzijde van de oren. Gebruik een schaar te snijden en verwijderen 2-3 mm huidreepje aan weerszijden van de insnijding. </li><li> Schraap de periosteum op het oppervlak van de schedel bloot aan de laterale randen. Bedek de blootgestelde schedel met een dun laagje superlijm. </li><li> Boor een klein gaatje, met een iets kleinere diameter dan 0-80 schroeven, met behulp van een ½ mm diameter boor braam (zie Materialen sectie). Boor het gat direct posterior waar de bregma hechting aan de laterale rand, en bij 30-45 ° hoek in de schedel, waardoor de schroef kan gaan met de top meer zijdelingse dan de bodem. </li><li> Schroef in een 0-80 vlakke bodem machine schroef om het gat (ongeveer 3 slagen), bij 30-45 ° hoek. Wees voorzichtig niet te schroeven in te diep te voorkomen dat schade aan de onderliggende hersenweefsel. </li><li> Herhaal deze procedure voor 6 extra schroeven in de getoonde configuratie <strong&gt; (Figuur 3B). Toepassing superlijm aan de basis van alle schroeven. </li><li> Plaats een injectienaald in de stereotax manipulator. Meet vanaf de bregma hechtdraad, en een deuk in de schedel met de naald in de buurt, maar buiten de gewenste craniotomie locatie, als referentie merk. OPMERKING: In deze demonstratie, de stereotactische coördinaten van het merk zijn 3 mm achter en 1 mm lateraal van de bregma hechtdraad. </li><li> Markeer de deuk met een permanent marker. Let op de stereotactische coördinaten van het merk, zoals het zal dienen als een stereotaxisch referentiepunt (Figuur 3B). </li><li> Voeg een craniotomie gecentreerd op de gewenste coördinaten (3 mm posterior en 3 mm lateraal van bregma in dit voorbeeld). Laat de dura mater intact. Bedek de craniotomie met gemodificeerde kunstmatige cerebrospinale vloeistof (125 mM NaCl, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 3,1 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, pH 7,4) 13 (Figuur 3C). </li&gt; <li> Snijd een 0,2 ml centrifugebuis tot 4-5 mm in de lengte en snijd de dop. Plaats de buis op de schedel en centreren het over de craniotomie. </li><li> Breng tandheelkundig cement rond de bodem van de buis tot de bodem van de buis de schedel dichten. Wees voorzichtig niet te cement lekken in de blootgestelde craniotomie (Figuur 3D). </li><li> Boor een klein gaatje (ongeveer ½ mm diameter) in de contralaterale craniale bord en plaats voorzichtig de verwijzing draad. Construeer de verwijzing draad door het solderen van een pin die interfaces met de opname versterker aan het einde van de draad (zie paragraaf Equipment). Verplaats de verwijzing draad zodra het in de hersenen, omdat dit kan leiden tot schade. </li><li> Breng superlijm het gat waarin draad is ingevoegd. Dit zal de pin en draad op zijn plaats tijdelijk te dichten. </li><li> Meng de twee delen van de silicone gel kit (zie Materialen sectie) in ongeveer gelijke porties. Wacht twee minuten voor het mengen en fill de centrifugebuis ongeveer ⅓ vol met gel. </li><li> Bevestig een rechte hoek paal klem (zie Materialen sectie) om de hoofdsteun bar. Bevestig de kopplaat (Figuur 2A) naar de houderbeugels (Figuur 2B) bij 45 ° hellingshoek zodat de onderkant van de plaat naar de neus van het dier. Het is nuttig om een inclinometer gebruiken om de spoedhoek ingesteld zodat deze overeenkomt met de experimentele mal (figuur 4). </li><li> Bevestig de houderbeugels de stereotax manipulator arm zodat het zaagblad evenwijdig aan het oor bars. Verlaag de bar en de plaat zodat de plaat is posterior van de lambda hechtdraad en juist voor de caudale meest schroef. </li><li> Pak de voorste kop-bout (een 8-32 stud of schroef, zie ook Materiaal sectie) bij ongeveer 45 ° hoek met een helpende handen arm en klem, zodat de kop van de schroef naar beneden en naar de staart van het dier. Verlaag de schroef zodat het raakt de miererior 0-80 schroeven (Figuur 3F, G). </li><li> Zet de bout en plaat op zijn plaats met tandheelkundige acryl. Breng tandheelkundige acrylaat rond de botschroef koppen, referentiepen en rond de zijkanten van de centrifugebuis. Wacht ongeveer 10 minuten voor het tandheelkundige acrylaat drogen (Figuur 3H). </li><li> Breng een laag tandheelkundig cement rond de randen van het tandheelkundige acrylaat, cementeren de huid aan het implantaat. Wacht tot het cement droog. </li><li> Prik enkele gaatjes in de dop van de centrifugebuis, en plaats de dop op de buis. </li><li> Verwijder de helpende handen klem. Dan verwijder voorzichtig de kop houden bar van het stereotax en verwijder dan het hoofd plaat van de bar (Figuur 3I). </li><li> Verwijder het dier uit de stereotax en beheren post-operatieve zorg en het toezicht in overeenstemming met alle toepasselijke regels, voorschriften en wetten (bv Buprenorfine 0,02 mg / kg, elke 8-12 uur voor een minimum van 24hr). Als ontsteking ontstaat rond de randen van het implantaat, een dun laagje antibioticum zalf op de aangetaste plaats dagelijks tot opgelost. </li></ol> 3. Juxtacellular Monitoring van Neuronale Units <ol><li> Trek kwarts capillaire buizen op een kooldioxide-laser micropipet trekker (zie Equipment) met uiteinde diameters kleiner dan 1 pm (figuur 5A). OPMERKING: de verwarming parameters zullen variëren afhankelijk van het specifieke instrument, en dat het benodigde halsdiameter afhankelijk van de hersenen structuur van belang. Voor opnames in de rat thalamus, micropipetten hebben nekken variërend 5-7 mm. </li><li> Zet de pipet in plaats onder een differentieel interferentie contrast (DIC) microscoop uitgerust met lange werkende doelstellingen afstand. Gebruik boetseerklei om de pipet te houden op zijn plaats op het podium van de microscoop. </li><li> Beweeg langzaam een ​​glazen blok (0,5-1 cm dik, een stuk glas gebruikt voor het making ultra-microtoommessen is handig) in het gezichtsveld met de pipet tip. Met behulp van het podium micromanipulator, zachtjes aanraken van de pipet tip om het glas, waardoor het te breken. Herhaal dit zo nodig tot de pipettip buitendiameter is tussen 1-3 micrometer (Figuur 5B, C). Ervoor zorgen dat deze micropipetten hebben impedanties tussen ongeveer 5-15 MQ. </li><li> Bereid extracellulaire zoutoplossing (135 mM NaCl, 5,4 mM KCI, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES, pH 7,2 met NaOH) 8 en voeg 2% (w / v) Chicago Sky Blue. Met een spuit met een 30 G naald of kleiner, vul de achterkant van de pipet met de oplossing. Als alternatief voor enkele cel juxtacellular labeling voeg 2% (w / v) Neurobiotin of gebiotinyleerde dextraan amine (BDA-3000 of BDA-10000) aan de zoutoplossing plaats van Chicago Sky Blue. </li><li> Plaats de rat in de doek sok in de stijve buis op een passende experimentele jig ( <stronG&gt; Figuur 4) .Wait minste 72 uur na de operatie alvorens het dier op de hoofdsteun jig. Draai het koord rond het bovenste borstbeen, in plaats van de hals, obstructie van de luchtwegen te voorkomen. Als de ademhaling lijkt te worden gewerkt of belemmerd, maak de koord of verplaatsen naar achteren. Doe dit terwijl de rat is alert. </li><li> Bevestig de hoofd-remmende plaat op de rat naar de corresponderende stuk op de mal. Om dit te doen, eerst speld de hoofdsteun plaat op zijn plaats, en zet deze dan vast met behulp van een 4-40 schroef. Wees er zeker van te wachten tot het dier rustig is om te voorkomen dat men een te hoge koppel aan het hoofd. Plaats vervolgens een 8-32 moer op de-kop beteugeling bout die wordt ingeplant op de rat. Schroef vervolgens in een schroefdraad roestvrij stalen staaf op het hoofd-bout. Bevestig de stang aan de experimentele mal op zodanige wijze dat het kan worden vastgezet op hun plaats (figuur 4). LET OP: Het beveiligen van het dier met hoofd-bout evenals de hoofdsteun plaat minimizes buigen van de inrichting en verbetert opnamestabiliteit. In de meeste gevallen de opname kan beginnen op de eerste dag van het dier-head ingetogen. Echter, als het dier friemelt overmatig of vocalizes, bieden een dag van hoofdsteunbevestiging gewenning training voordat u begint met de opnames. In dit geval laat het dier op de mal gedurende 15 minuten en plaats het terug in zijn kooi. Herhaal deze stap en de volgende dag verder te gaan met het protocol. </li><li> Open de opname kamer en verwijder de siliconengel. Reinig de craniotomie behulp van fijne tang als weefsel is opnieuw gegroeid in de craniotomie. </li><li> Bevestig de pipet om de gemotoriseerde micromanipulator, en steek de stekker in het headstage voorversterker. Opmerking: In deze demonstratie wordt een kleine relais schakeling op de headstage gebruikt om te schakelen tussen de versterker geleidingsdraden en een externe stroombron met hoge compliance (figuur 6A-C). Merk op dat sommige versterkers hebben een geschikte ingebouwde hoge naleving bron(Zie Discussie en Materials secties). </li><li> Gebruik de gemotoriseerde micromanipulator om de punt van de pipet naar de stereotaxically geïdentificeerde merk in de opname kamer. Let op de coördinaten van deze locatie. Wees voorzichtig de punt van de pipet op de schedel niet te breken. </li><li> Beweeg de pipet om de gewenste opname plaats in de voorste-posterior en medio-laterale assen. Vooraf vervolgens de pipet ventraal door de dura toe tot ongeveer 500 pm dorsaal de beoogde opnamelocatie. </li><li> Langzaam vooruit de pipet terwijl u luistert naar stekelige gebeurtenissen op een audio-monitor van de versterkte spanning opgenomen tussen de pipet tip en de verwijzing draad. Zodra stekelige gebeurtenissen worden geïdentificeerd, blijven de pipet 0-100 micrometer bewegen totdat positief gaan spanning doorbuigingen van meer dan ongeveer 500 mV worden waargenomen. OPMERKING: De weerstand elektrode met een factor van ongeveer 1,5-10 when dit gebeurt. </li><li> Beginnen met het opnemen van een keer per eenheid is geïsoleerd als overeenkomstig stap 3.11, samen met alle andere gedrags- en fysiologische maatregelen van belang. In de huidige demonstratie, zijn zelf opgewekte vibrissa bewegingen gecontroleerd met high speed videografie (zie Materialen sectie). </li><li> Om de opname plaats te labelen, schakelt de elektrode leidt tot sluiten op de huidige bron. Er zijn verschillende manieren om dit te doen, met behulp van een relais schakeling (figuur 6A - C), een ingebouwde stroombron op de versterker, of handmatig (figuur 6D, zie stap 3.8 en discussie). Passeren -4 uA met 2 sec pulsen bij 50% inschakelduur voor 4 min tot iontoforetisch injecteren Chicago Sky Blue door de pipet. </li><li> Dood en perfuseren het dier na enkele etikettering procedures volgens de gangbare praktijk. Sectie de hersenen en tegenkleuring nodig identificeren de anatomische locatie van de opname zittene. Tegenkleuring het weefsel voor cytochroom oxidase reactiviteit als per 14. Als alternatief, het identificeren van de Chicago Sky Blue deposito&#39;s met behulp van fluorescentie microscopie. OPMERKING: Om nauwkeurig onderscheid te maken tussen verschillende gelabelde eenheden is het belangrijk dat alle labels zijn gemaakt met dezelfde pipet op dezelfde dag, zonder unclamping de pipet tussen de etiketten. In dit geval kan de opname locaties worden onderscheiden door hun relatieve locaties in post-hoc histologie, samen met de bekende manipulator coördinaten van elke site (zie stap 3.9). Voor ondubbelzinnige identificatie, markeer de etiketten ten minste 200 urn van elkaar, en niet meer dan 3-5 labels per hersengebied. </li></ol>

<ol><li>Fee, M. S., Leonardo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniature+motorized+microdrive+and+commutator+system+for+chronic+neural+recording+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniature motorized microdrive and commutator system for chronic neural recording in small animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 112 (2), 83-94 (2001).</li>
<li>Ventakachalam, S., Fee, M. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-miniature+headstage+with+6-channel+drive+and+vacuum-assisted+micro-wire+implantation+for+chronic+recording+from+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultra-miniature headstage with 6-channel drive and vacuum-assisted micro-wire implantation for chronic recording from neocortex.</a> Journal of Neuroscience Methods. 90 (1), 37-46 (1999).</li>
<li>Szuts, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wireless+multi-channel+neural+amplifier+for+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A wireless multi-channel neural amplifier for freely moving animals.</a> Nature Neuroscience. 14 (2), 263-269 (2011).</li>
<li>Roy, S., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wireless+multi-channel+single+unit+recording+in+freely+moving+and+vocalizing+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Wireless multi-channel single unit recording in freely moving and vocalizing primates.</a> Journal of neuroscience. 203 (1), 28-40 (2012).</li>
<li>Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+metrics+to+accompany+spike+sorting+of+extracellular+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Quality metrics to accompany spike sorting of extracellular signals.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 8699-8705 (2011).</li>
<li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+single-cell+staining+procedure+performed+in+vivo+under+electrophysiological+control%3A+morpho-functional+features+of+juxtacellularly+labeled+thalamic+cells+and+other+central+neurons+with+biocytin+or+Neurobiotin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin.</a> Journal of neuroscience. 65 (2), 113-136 (1996).</li>
<li>Person, A. L., Perkel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pallidal+neuron+activity+increases+during+sensory+relay+through+thalamus+in+a+songbird+circuit+essential+for+learning%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pallidal neuron activity increases during sensory relay through thalamus in a songbird circuit essential for learning.</a> The Journal of neuroscience. 27 (32), 8687-8698 (2007).</li>
<li>Kock, C. P., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiking+in+primary+somatosensory+cortex+during+natural+whisking+in+awake+head-restrained+rats+is+cell-type+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 106 (38), 16446-16450 (2009).</li>
<li>Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+activity+in+barrel+cortex+underlying+vibrissa-based+object+localization+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice.</a> Neuron. 67 (6), 10481061(2010).</li>
<li>Hellon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marking+of+electrode+tip+positions+in+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">The marking of electrode tip positions in nervous tissue.</a> The Journal of physiology. 214, 12P(1971).</li>
<li>Furuta, T., Deschênes, M., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+distribution+of+thalamocortical+boutons+in+barrels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anisotropic distribution of thalamocortical boutons in barrels.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (17), 6432-6439 (2011).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. (1986).</li>
<li>Kleinfeld, D., Delaney, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributed+representation+of+vibrissa+movement+in+the+upper+layers+of+somatosensory+cortex+revealed+with+voltage+sensitive+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Distributed representation of vibrissa movement in the upper layers of somatosensory cortex revealed with voltage sensitive dyes.</a> Journal of Comparative Neurology. 375 (1), 89-108 (1996).</li>
<li>Wong-Riley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+visual+system+of+monocularly+sutured+or+enucleated+cats+demonstrable+with+cytochrome+oxidase+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry.</a> Brain research. 171 (1), 11-28 (1979).</li>
<li>Moore, J. D., Deschênes, M., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-generated+vibrissa+motion+and+touch+are+differentially+represented+throughout+ventral+posterior+medial+thalamus+in+awake%2C+head-fixed+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Neuroscience+Annual+Meeting.+41+496.08%2FTT424+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Self-generated vibrissa motion and touch are differentially represented throughout ventral posterior medial thalamus in awake, head-fixed rats.</a> Society for Neuroscience Annual Meeting. 41 496.08/TT424 Society for Neuroscience. 41, (2011).</li>
<li>Khatri, V., Bermejo, R., Brumberg, J. C., Zeigler, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whisking+in+air%3A+Encoding+of+kinematics+by+VPM+neurons+in+awake+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Somatosensory+and+Motor+Research%22%5BJournal%5D)">Whisking in air: Encoding of kinematics by VPM neurons in awake rats.</a> Somatosensory and Motor Research. 27 (2), 344-356 (2010).</li>
<li>Hill, D. N., Curtis, J. C., Moore, J. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+motor+cortex+reports+efferent+control+of+vibrissa+position+on+multiple+time+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Primary motor cortex reports efferent control of vibrissa position on multiple time scales.</a> Neuron. 72 (2), 344-356 (2011).</li>
<li>Moore, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchy+of+orofacial+rhythms+revealed+through+whisking+and+breathing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hierarchy of orofacial rhythms revealed through whisking and breathing.</a> Nature. 497, 205-210 (2013).</li>
<li>Duque, A., Zaborszky, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuque%2C+A+%22Neuroanatomical+Tract-Tracing+3%22">Neuroanatomical Tract-Tracing 3</a>. , Springer. 197-236 (2006).</li>
<li>Neuroactive substances: Neuropharmacology by microiontophoresis. , Kation Scientific. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://kationscientific.com/fsubstances.html">http://kationscientific.com/fsubstances.html</a> Forthcoming.</li>
<li>Dyes and Tracers: Sitemarking and tracktracing by microiontophoresis. , Kation Scientific. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://kationscientific.com/fdyes.html">http://kationscientific.com/fdyes.html</a> Forthcoming.</li>
<li>Urbain, N., Deschênes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroactive+substances%3A+Neuropharmacology+by+microiontophoresis.+%28Kation+Scientific%29%2C+Dyes+and+Tracers%3A+Sitemarking+and+tracktracing+by+microiontophoresis.+%28Kation%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuroactive substances: Neuropharmacology by microiontophoresis. (Kation Scientific), Dyes and Tracers: Sitemarking and tracktracing by microiontophoresis. (Kation).</a> Journal of Neuroscience. 27 (45), 12407-12412 (2007).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

De bouw van de experimentele jig De beschrijving van de mechanische onderdelen gebruikt om de experimentele mal (figuur 4) op te bouwen wordt weggelaten uit het protocol, zoals kan worden geconstrueerd op verschillende wijzen. In deze demonstratie standaard opto-mechanische onderdelen en ondersteuning klemmen worden gebruikt om de hoofdsteun bar en het lichaam terughoudendheid buis (zie Materialen sectie) monteren. Soortgelijke...

Monitoring neuronale activiteit in een alarm dier actief bezig met een gedrags-taak is van cruciaal belang voor het begrijpen van de functie en de organisatie van het zenuwstelsel. Extracellulaire van de elektrische activiteit uit één neuronale eenheden is lang een nietje instrument systemen neurologie en is nog wijd gebruikt op dit moment. Een scala elektroden en configuraties zijn mogelijk afhankelijk van de wetenschappelijke en technische vereisten van een bepaald experiment. Chronisch geïmplanteerde microdrives of elektrode arrays worden vaak gebruikt in vrij bewegende dieren, waaronder vogels, knaagdieren en niet-humane primaten 1-4. Als alternatief worden acute penetraties met metaal of glas micro-elektroden via een externe micromanipulator vaak gebruikt voor het opnemen van verdoofde of-head ingetogen dieren. Glas micropipet elektroden het voordeel dat ze kunnen worden gebruikt in de juxtacellular of &quot;cel toegevoegd&quot; configuratie eenduidig ​​isolerenactiviteit van enkele neuronen, zonder de complicaties van post-hoc spike sorteren 5. Deze elektroden opname verder toestaan ​​van anatomisch geïdentificeerde cellen of locaties, omdat ze kunnen worden gebruikt om kleine afzettingen van kleurstof of neuroanatomisch tracers injecteren, of het vullen van de individuele cel opgenomen. Deze configuratie is met succes toegepast bij ratten, muizen en vogels 6-10. De hier beschreven techniek richt zich op juxtacellular monitoring en extracellulaire kleurstof afzettingen in signalering, hoofd ingetogen ratten. Merk op dat in tegenstelling tot enkele cel juxtacellular vult, deze kleurstof deposito&#39;s geven geen informatie over de morfologie van de cel of axonale projecties 11 voorzien, maar ze in staat de exacte anatomische lokalisatie tot ongeveer 50 pm en, kritisch, hebben een aanzienlijk hogere opbrengst in alert dieren. Informatie met betrekking tot eencellige juxtacellular vult wordt niettemin voorzien als een alternatieve strategie voor de anatomische kenmerken. Kortom, deprotocol bestaat uit drie belangrijke fasen. In de eerste fase wordt de rat gewend aan het lichaam terughoudendheid in een doek sok (figuur 1) over een periode van 6 dagen. In de tweede fase worden een hoofdsteun apparaat (figuur 2) en de opname kamer chirurgisch geïmplanteerd zodanig dat de rat in de stereotaxisch vliegtuig kan worden gehandhaafd gedurende meerdere opeenvolgende opnamesessies (figuur 3); Deze procedure kan de experimentator om bepaalde sub- corticale gebieden van de hersenen doelwit voor elektrofysiologisch onderzoek gebaseerd op standaard referentie coördinaten 12. De derde fase omvat het plaatsen van de rat in een geschikte mal voor het uitvoeren van de gedrags- en elektrofysiologische experimenten (figuur 4), het construeren van de elektrode uit een kwarts capillaire buis (figuur 5), waardoor juxtacellular neuronale opnamen die ondubbelzinnig isoleren afzonderlijke eenheden 6-9 en het markeren van de anatomische locatiop de opname onderzocht met Chicago Sky Blue kleurstof (figuren 6 en 7). De opnames worden uitgevoerd met gelijktijdige gedrags controle; zal echter de technische details van het gedrag afhankelijk van de wetenschappelijke doelen van elk experiment en dus buiten het bereik van een enkel protocol. Na voltooiing van de experimentele procedure die kan worden herhaald op verschillende dagen, wordt het dier gedood. De hersenen wordt gewonnen en verwerkt volgens standaard technieken neuroanatomisch behulp van helder veld of fluorescentiemicroscopie.

<table><tbody><tr><td>Ketaset (Ketamine HCl)</td><td>Fort Dodge</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xylazine solution)</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Betadyne (Povidone-Iodine)</td><td>CVS Pharmacy</td><td>269281</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 495</td><td>Grainger Industrial Supply</td><td>4KL86</td><td>20 - 40 cp cyanoacrylate</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Grip cement powder</td><td>Dentsply Intl</td><td>675571</td><td>Voor de basis van de opnamekamer</td></tr><tr><td>Grip cement liquid</td><td>Dentsply Intl</td><td>675572</td><td>Voor de basis van de opnamekamer</td></tr><tr><td>Silicone gel</td><td>Dow Corning</td><td>3-4680</td><td></td></tr><tr><td>Jet denture repair acrylic powder</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>N/A</td><td>Voor het bevestigen van het hoofdbeugelapparaat aan de schedel</td></tr><tr><td>Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>N/A</td><td>Voor het bevestigen van het hoofdbeugelapparaat aan de schedel</td></tr><tr><td>Chicago sky blue</td><td>Sigma</td><td>C8679</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>Voor perfusie en weefselfixatie</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td>Voor perfusie en weefselfixatie</td></tr><tr><td>Cytochrome C</td><td>Sigma</td><td>C2506</td><td>Voor cytochrome-oxidase kleuring, Figuur 7</td></tr><tr><td>Diaminobenzidine</td><td>Sigma</td><td>D5905</td><td>Voor cytochrome-oxidase kleuring, Figuur 7</td></tr><tr><td>Rat sock</td><td>Sew Elegant (San Diego, CA)</td><td>N/A</td><td>Op maat gemaakt, Figuren 1, 4</td></tr><tr><td>PVC tube 2 &frac12;&rdquo;</td><td>U.S. Plastic Co.</td><td>34108</td><td>Figuur 4</td></tr><tr><td>Subminiature D pins &amp; sockets</td><td>TE Connectivity</td><td>205089-1</td><td>Figuur 3</td></tr><tr><td>Stainless steel music wire 0.010&rdquo; diameter</td><td>Precision Brand Products, Inc.</td><td>21010</td><td>Figuur 3</td></tr><tr><td>Stereotaxic holding frame</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 900</td><td>Figuur 3</td></tr><tr><td>Stereotaxic ear bars</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 957</td><td>Figuur 3</td></tr><tr><td>Stereotaxic manipulator</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 960</td><td>Figuur 3</td></tr><tr><td>&frac12; mm drill burr</td><td>Henry Schein</td><td>100-3995</td><td></td></tr><tr><td>Quiet-Air dental drill</td><td>Midwest Dental</td><td>393-1600</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel 0-80 &frac18;&rdquo; screw</td><td>Fastener superstore</td><td>247438</td><td>Figuur 3</td></tr><tr><td>0.2 ml centrifuge tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-407-8A</td><td>Figuur 3</td></tr><tr><td>Custom head-holding bar</td><td>UCSD SIO Machine Shop</td><td>N/A</td><td>Op maat gemaakt, Figuren 2 - 4</td></tr><tr><td>Custom head-holding plate</td><td>UCSD SIO Machine Shop</td><td>N/A</td><td>Op maat gemaakt, Figuren 2 - 4</td></tr><tr><td>Right angle post-clamp</td><td>Newport</td><td>MCA-1</td><td>Figuren 3, 4; standaard opto-mechanische onderdelen voor de experimentele jig (Figuur 4) zijn ook van Newport Corp.</td></tr><tr><td>8-32 &frac34;&rdquo; screw</td><td>Fastener Superstore</td><td>240181</td><td>Voor hoofdbeugeling, Figuur 3</td></tr><tr><td>4-40 &frac14;&rdquo; screw</td><td>Fastener Superstore</td><td>239958</td><td>Voor hoofdbeugeling, Figuren 3, 4</td></tr><tr><td>Quartz capillary tubing</td><td>Sutter Instruments</td><td>QF-100-60-10</td><td>Figuur 5</td></tr><tr><td>Carbon dioxide laser puller</td><td>Sutter instruments</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Motorized micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrode amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td>Alternatief onderdeel: Molecular Devices Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>Microelectrode amplifier head stage</td><td>Molecular Devices</td><td>CV-7B</td><td>Alternatief onderdeel: HS-9Ax10 met Molecular Devices Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>Isolated pulse stimulator</td><td>A-M Systems</td><td>Model 2100</td><td>Alternatief onderdeel: HS-9Ax10 met Molecular Devices Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>Audio monitor</td><td>Radio Shack</td><td>32-2040</td><td></td></tr><tr><td>Pipette holder</td><td>Warner Instruments</td><td>#MEW-F10T</td><td>Alternatieve onderdelen: zie Bespreking, Figuur 6A</td></tr><tr><td>Electrode lead wire</td><td>Cooner wire</td><td>NEF34-1646</td><td>(optioneel), Figuur 6D</td></tr><tr><td>Relay voor versterker hoofd-stage</td><td>COTO Technology</td><td>#2342-05-000</td><td>(optioneel) Gebruikt met een op maat gemaakte printplaat (UCSD Physics Electronics Shop), Figuur 6A-C</td></tr><tr><td>Digitale videocamera</td><td>Basler</td><td>A602fm</td><td>(optioneel) Voor gedragsmonitoring, Figuur 7</td></tr><tr><td>Puralube vetzalf</td><td>Amazon.com, Inc</td><td>NC0138063</td><td></td></tr></tbody></table>

juxtacellular monitoring en lokalisatie van single neuronen in sub-corticale hersenstructuren van alert, head ingetogen ratten

Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

Er zijn verschillende technieken om de extracellulaire activiteit van enkele neuronale eenheden te monitoren. Echter, het monitoren van deze activiteit van diepe hersenstructuren bij zich gedragen dieren blijft een technische uitdaging, vooral als de structuren stereotaxisch moeten worden gericht. Dit protocol beschrijft handige chirurgische en elektrofysiologische technieken die het hoofd van het dier in het stereotaxische vlak houden en de spiking-activiteit van enkele neuronen ondubbelzinnig isoleren. Het protocol combineert hoofdbeperking van alerte knaagdieren, juxtacellulair monitoren met micropipet-elektroden en iontoforetische kleurstofinjectie om de neuronlocatie in post-hoc histologie te identificeren. Hoewel elk van deze technieken op zichzelf goed gevestigd is, richt het protocol zich op de specifieke kenmerken van hun gecombineerde gebruik in een enkel experiment. Deze neurofysiologische en neuroanatomische technieken worden gecombineerd met gedragsmonitoring. In het huidige voorbeeld worden de gecombineerde technieken gebruikt om te bepalen hoe zelfgeproduceerde vibrissa-bewegingen worden gecodeerd in de activiteit van neuronen in de somatosensorische thalamus. Meer in het algemeen is het eenvoudig om dit protocol aan te passen om neuronale activiteit te monitoren in combinatie met een verscheidenheid aan gedragstaken bij ratten, muizen en andere dieren. Cruciaal is dat de combinatie van deze methoden de experimentator in staat stelt om anatomisch geïdentificeerde neurofysiologische signalen direct te relateren aan gedrag.

<html> Neuronale eenheden in ventrale posterior mediale (VPM) thalamus coderen de fase van vibrissa beweging tijdens de zelf opgewekte kloppen 15,16. Figuur 7A toont steekproef stekelige activiteit van een VPM thalamische eenheid als een rat is actief kloppen. Figuur 7B toont een histogram van spike maal afgestemd op de momentane fase van vibrissa beweging 17. Er zijn meer pieken tijdens de terugtrekking fase van kloppen. Na de opname werd de locatie van het toestel...

Dit protocol beschrijft het ontwerp en de chirurgische implantatie van een hoofdbevestigingsmechanisme om neuronale activiteit in subcorticale hersenstructuren bij alerte ratten te monitoren. Het beschrijft procedures om afzonderlijke neuronen in de juxtaculaire configuratie te isoleren en om hun anatomische locaties efficiënt te identificeren.

Juxtacellular Monitoring en lokalisatie van Single neuronen in Sub-corticale hersenstructuren van Alert, Head ingetogen Ratten

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures ...

Het algemene doel van deze procedure is om de activiteit van individuele neuronen binnen de subcorticale hersenstructuren van waakzame, met een hoofdfixatie vastgezetten ratten te monitoren en te lokaliseren. Dit wordt bereikt door de rat eerst te laten wennen aan lichaamsfixatie in een stoffen sok. De tweede stap bestaat uit het chirurgisch implanteren van een hoofdfixatieapparaat en een registratiekamer, zodat de rat tijdens meerdere opeenvolgende registratiesessies in het stereotactische vlak kan worden gehouden.Vervolgens wordt de rat in een geschikte houder geplaatst voor het uitvoeren van de gedragsmatige en elektrofysiologische experimenten, waarna juxtacellulaire neuronale opnames worden uitgevoerd. Dit proces maakt een eenduidige isolatie van enkelvoudige units mogelijk. De laatste stap is het markeren van de anatomische locatie van de opnameplaats met Chicago Sky Blue-kleurstof, zodat deze in post hoc histologie gevisualiseerd kan worden.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van veelgebruikte methoden, zoals extracellulaire registratie met metalen micro-elektroden, is dat spikes van individuele eenheden ondubbelzinnig kunnen worden geïsoleerd en dat de

juxtacellular-monitoring-localization-single-neurons-within-sub

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De controle van de extracellulaire neurotransmitter niveaus in verschillende gebieden van de hersenen van vrij bewegende dieren biedt inzichten over het verband tussen neurotransmitters en gedrag. In vivo microdialyse gekoppeld met elektrochemische detectie zorgt voor een uitstekende anatomische en chemische resolutie, en informatie over hoe basale neurotransmissie wordt aangepast door farmacologische of fysiologische manipulaties.

Survivable stereotaxische Chirurgie in Knaagdieren

Extracellulaire opnames van neuronale activiteit met behulp van silicium sondes in de verdoofde rat wordt beschreven. Deze techniek maakt het mogelijk informatie te verkrijgen over verschillende hersengebieden die uit meer dan 100 neuronen tegelijk. Het geeft informatie met enkele cel resolutie over neuronale ensembles dynamiek in meerdere lokale circuits.

Opname Grootschalige Neuronale Ensembles met Silicon Probes in de verdoofde Rat

This video demonstrates the detailed procedure for preparing an anesthetized rat for electrophysiological recordings of brain activity from multiple sites. The scalp is dissected to access the skull, and holes are drilled at precise locations to install and secure electrodes. Tungsten microwire electrodes are then inserted into the targeted location to record the data.

In Vivo Electrophysiological Recordings of Brain Activities from Multiple Sites in Rats

Source: Maruoka, H., et. al. Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice. J. Vis. Exp. (2022)     This video shows a two-photon microscopy procedure for imaging neuronal activity and microglial dynamics in an awake mouse during visual stimulation, highlighting calcium transients and cellular interactions.

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in an Awake Mouse

Source: Moore, J. D., et al. Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the method of juxtacellular recording and staining in a restrained, awake rat. The procedure involves recording signals from neurons and injecting dye to precisely localize the recording site. This technique allows accurate mapping of neural activity to the brain's anatomical structure.

Juxtacellular Recording and Staining for Precise Mapping of Neural Activity in an Awake Rat 

Source: Lai, J., et al. Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates a microinjection-based technique for simultaneous neuronal recording and inhibition in the rat superior colliculus. The procedure involves stereotaxic targeting, skull drilling, and the insertion of an injectrode, which delivers an inhibitory neurotransmitter while recording neuronal activity. Light stimulation evokes...

Inhibition of Neuronal Activity and Its Detection Using Electrophysiology in a Rat

De structuur van neuronale netwerken begrijpen, functionele en morfologische karakterisering van individuele neuronen is een noodzaak. Hier tonen we juxtasomal biocytine etikettering, die elektrofysiologische opnames maakt in de extracellulaire configuratie, maar met behoud van de mogelijkheid om intracellulair het etiket van de neuron voor post hoc reconstructie van dendritische en axonale architectuur.

Juxtasomal biocytine Labeling om de structuur-functie relatie van de individuele corticale neuronen Studie

Deze methode zorgt voor een tastbaar, vertrouwde omgeving voor de muis te navigeren en te verkennen tijdens microscopische beeldvorming of eencellige elektrofysiologische opnames, die stevige fixatie van het hoofd van het dier nodig heeft.

Flat-gevloerd Air-opgeheven Platform: Een nieuwe methode voor het combineren Gedrag met Microscopie of Electrofysiologie op Awake vrij bewegende Knaagdieren

In deze studie wordt de methode gepresenteerd over het uitvoeren van multi-site in vivo elektrofysiologische opnamen van de hyperdirecte weg onder urethaananesthesie.

acuut<em&gt; In Vivo</em&gt; Elektrofysiologische opnamen van lokale veldpotentialen en multi-unit activiteit van de Hyperdirect Pathway in verdoofde ratten

Wanneer geïntegreerd met een kopplaat en een optisch ontwerp dat compatibel is met zowel enkelvoudige als twee-fotonmicroscopen, biedt de microprismalens een aanzienlijk voordeel bij het meten van neurale reacties in een verticale kolom onder verschillende omstandigheden, waaronder goed gecontroleerde experimenten in hoofdvaste toestanden of natuurlijke gedragstaken bij vrij bewegende dieren.

Langetermijnbeeldvorming van geïdentificeerde neurale populaties met behulp van microprisma's in vrij bewegende en met het hoofd gefixeerde dieren

Primaire sensorische gebieden in de neocortex vertonen unieke spontane activiteiten tijdens de ontwikkeling. Dit artikel beschrijft hoe individuele neuronactiviteiten en primaire sensorische gebieden kunnen worden gevisualiseerd om gebiedsspecifieke synchrone activiteiten bij neonatale muizen in vivo te analyseren.

In vivo visualisatie van spontane activiteit in de sensorische cortex van neonatale muizen met een resolutie van één neuron

Leer juxtacellulaire monitoring en lokalisatie van enkele neuronen in subcorticale hersenstructuren bij alerte, hoofd-vastgezette ratten. Deze methode maakt ondubbelzinnige isolatie van spiking-activiteit mogelijk.

Juxtacellular Monitoring en lokalisatie van Single neuronen in Sub-corticale hersenstructuren van Alert, Head ingetogen Ratten

Meer video's verkennen