A Novel Stretching platform voor toepassingen in de Cel en Weefsel Mechanobiology
3 juni 2014
We presenteren in dit artikel een nieuw strekken platform dat kan worden gebruikt om cel responsen op complexe anisotrope biaxiale mechanische vervorming onderzoeken en kwantificeren van de mechanische eigenschappen van biologisch weefsel.
Het algemene doel van deze procedure is om de nieuwheid van een anisotroop rekplatform aan te tonen dat kan worden gebruikt om enkelcellig antwoord op complexe mechanische vervorming te onderzoeken en om de mechanische eigenschappen van biologische weefsels te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst de flexibele membraan te fabriceren en deze membraan op een set klemmen te monteren. De tweede stap is om C twee C 12 cellen gedurende een nacht op de membraan te kweken en de volgende dag de klemmen op het rekplatform te monteren.
Vervolgens, in een tweede reeks experimenten, worden thoracale aortaweefsels van een muismodel afgewezen en gereinigd van eventueel bindweefsel. Vervolgens wordt het aortaweefsel op het rekplatform gemonteerd met behulp van een andere set klemmen. Uiteindelijk wordt het rekplatform gebruikt om een vervorming in cellen langs twee orthogonale richtingen te induceren die kunnen worden gekwantificeerd met behulp van een omgekeerde microscoop.
Of alternatief, een krachttransducer wordt geïntegreerd in het rekapparaat om de weefselstijfheid te meten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van de bestaande technieken, zoals uni actuele of biaxiale celrek, is dat het ons toestaat om de vervorming in twee orthogonale richtingen onafhankelijk te regelen in een transparante membraan waarop cellen zijn bevestigd, en daardoor toestaat voor live celbeeldvorming. Microscopie ook een zorgvuldige ontwerp van een andere set klemmen.
Met de integratie van een viersnarige gebruiker op het platform, kunnen we 10 celtesten uitvoeren op biologisch weefsel voor de kwantificering van hun mechanische eigenschappen. Deze video presenteert het Biaxiale Rekplatform, een op maat gebouwd apparaat dat kan worden gebruikt om het effect van substraatvervorming op cellulair niveau te onderzoeken en trektests uit te voeren op biologisch weefsel. Het ontwerp en de kenmerken van het Biaxiale rekplatform worden gedetailleerd beschreven in het bijbehorende manuscript om het effect van mechanische vervorming van enkele cellen te onderzoeken, moet eerst een flexibele en transparante substraat worden gemaakt waarop cellen kunnen hechten.
Om deze procedure te beginnen, pipet 500 microliter van een oplossing met fluorescente microsferen in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 16.200 G's. Gooi de supernatant weg en voeg 500 microliter isopropanol toe, gevolgd door vijf minuten vortexen. Zet de flacon een nacht in het donker om eventuele grote deeltjesaggregaten te laten sedimenteren. De volgende ochtend brengt u voorzichtig de SNAT over naar een schone microcentrifugebuis. Deze beadoplossing kan worden gebruikt om meer dan vijf substraten te fabriceren, omdat de beadoplossing de volgende drie dagen zal blijven sedimenteren.
Het is belangrijk om Resus te voorkomen door het pellet te suspenderen. Giet 0,5 gram van het verhardingsmiddel dat bij de PDMS-kit wordt geleverd in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg 15 microliters van de fluorescente kralen toe en vortex gedurende één minuut.
Herhaal dit nog vijf keer om in totaal 90 microliters aan kralen toe te voegen. Zet apart. Weeg 10 gram PDMS, voeg 0,5 gram van het verhardingsmiddel toe, aangevuld met fluorescente kralen en meng gedurende ten minste 12 minuten. Gebruik vervolgens de transferpipet om vier milligram van de PDMS met kralen over te brengen naar een SUH 2050 kruisvormig mal die eerder is vervaardigd met behulp van standaard fotolitografietechnieken.
De mal heeft een hoogte van 320 micrometer en een oppervlakte van 13,4 vierkante centimeter en kan 428 microliter of 440 milligram PDMS bevatten. Cure de PDMS gedurende twee uur bij 80 graden Celsius. Na het uitharden de substraat van de mal afpellen, het substraat kan twee weken in een petrischaal op kamertemperatuur worden bewaard zonder significante veranderingen en zijn mechanische eigenschappen te vertonen. Giet druppels PDMS in een petrischaal met een eindgrootte van ongeveer vier millimeter in diameter, cure ze ondersteboven gedurende twee uur bij 80 graden Celsius, de schaal moet ondersteboven worden gehouden om te voorkomen dat de druppels tijdens het uithardingsproces vlak worden.
Deze verankeringsfuncties kunnen wekenlang in een petrischaal worden bewaard. Behandel het substraat en acht verankeringsfuncties met luchtplasma, bind de functies aan elk uiteinde van het substraat op een afstand van vier millimeter van de vierkant gevormde indruk die op het substraat aanwezig is om het membraan op de klemmen te monteren. Wikkel elk uiteinde van het substraat rond de groef in het cilindrische gedeelte van de klemmen en zet het vast met de twee stelschroeven van bovenaf.
Schroef de vier klemmen op de klemhouder. Giet vervolgens PDMS op het kruispunt tussen het substraat en het gegroefde deel van de klemmen. Verspreid de ongecureerde PDMS rond het gegroefde cilindrische deel met behulp van een 1,5 millimeter zeskantsleutel.
Pour PDMS in de groeven totdat deze volledig zijn gevuld door capillaire actie en cure de assemblage gedurende twee uur bij 80 graden Celsius voor het zaaien van cellen op het membraan. Luchtplasma. Behandel de hele assemblage om het substraat te steriliseren en te functionaliseren om collageencoating mogelijk te maken.
Functioneer het gebied van het substraat waarop cellen worden gezaaid met één milliliter 0,02 molaire azijnzuur aangevuld met 16 microgram per milliliter rattenstaartcollageen bij kamertemperatuur gedurende één uur. De gewenste uiteindelijke collageendichtheid is vijf microgram per vierkante centimeter. Na één uur spoelt u het substraat drie keer met fosfaatbuffer en laat het gedurende ten minste 10 minuten drogen bij kamertemperatuur. Voeg 40 microliters kweekmedium toe, aangevuld met 10% foetaal bovien serum en 1% penicilline.
Streptomyces bevattende 2000 cellen in het centrale gedeelte van het substraat om een oppervlakte van één vierkante centimeter te bedekken. In dit voorbeeld is de celdichtheid 20 cellen per vierkante centimeter. De celdichtheid kan echter worden gewijzigd volgens experimentele vereisten.
Plaats de hele assemblage in een standaard cellenkweekincubator met het substraat naar boven,
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een vernieuwend rekplatform dat is ontworpen om de respons van individuele cellen op complexe anisotrope biaxiale mechanische vervorming te onderzoeken. Daarnaast kwantificeert het de mechanische eigenschappen van biologische weefsels.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Biomechanica
- Celbiologie
- Tissue Engineering
Achtergrond
- Het begrijpen van cellulaire reacties op mechanische krachten is van cruciaal belang in de biologie.
- Mechanische vervorming kan het celgedrag en de weefseleigenschappen beïnvloeden.
- Bestaande methoden simuleren complexe mechanische omgevingen mogelijk niet adequaat.
- Deze studie introduceert een platform dat een precieze controle over mechanische rek mogelijk maakt.
Doel van de studie
- Om de functionaliteit van een nieuw anisotroop stretchplatform aan te tonen.
- Om te onderzoeken hoe individuele cellen reageren op biaxiale mechanische vervorming.
- Om de mechanische eigenschappen van biologische weefsels met dit platform te kwantificeren.
Gebruikte methoden
- Fabricage van een flexibel membraan gemonteerd op klemmen.
- Kweken van C2C12-cellen op het membraan.
- Monteren van thoracisch aortawevsel van een muismodel op het platform.
- Induceren van deformatie in cellen langs twee orthogonale richtingen.
Belangrijkste resultaten
- Het platform induceerde succesvol gecontroleerde mechanische deformatie.
- Cellulaire responsen op de deformatie werden kwantitatief beoordeeld.
- De mechanische eigenschappen van de biologische weefsels werden gekarakteriseerd.
- De resultaten bieden belangrijke inzichten in cel-weefselinteracties onder mechanische stress.
Conclusies
- Het nieuwe rekplatform is effectief voor het bestuderen van cellulaire mechanica.
- Deze benadering kan ons begrip van weefselgedrag onder stress verbeteren.
- Toekomstige toepassingen kunnen weefselengineering en regeneratieve geneeskunde omvatten.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Mechanobiologie wordt in toenemende mate erkend als een kritische factor in ziekteprogressie en therapeutische respons, maar robuuste instrumenten voor het kwantificeren van cellulaire en weefselmechanica blijven beperkt. Het BAXS-platform maakt nauwkeurige, programmeerbare mechanische stimulatie en kwantitatieve stijfheidsmeting mogelijk op zowel enkelcel- als weefselniveau, wat direct bijdraagt aan vroege ontdekkingen en targetvalidatie in biopharma R&D. Deze mogelijkheid vergroot het voorspellende vertrouwen in mechanistische hypothesen en informeert risicogebaseerde portfoliobeslissingen in gevallen waarin mechanische signalen een rol spelen bij ziekten.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek mogelijk naar mechanotransductiepaden en cellulaire mechanosensitiviteit die relevant zijn voor het ontstaan van ziekten.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door nucleaire en cytoskeletale reacties op gedefinieerde mechanische stimuli te kwantificeren.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie voor targets die worden gemoduleerd door biomechanische krachten.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde, mechanisch responsieve cel- en weefselsystemen voor voor downstream compound-screening.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve read-outs van deformatie en stijfheid voor assay-standaardisatie.
- Maakt live-cell imaging mogelijk tijdens mechanische perturbatie, wat high-content screening-workflows ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt in vitro mechanische fenotypes aan weefselmechanica die relevant zijn voor de ziekte en waargenomen worden in preklinische modellen.
- Ondersteunt de continuïteit van mechanistische inzichten in de ontdekkingsfase naar preklinische validatie van therapeutische interventies gericht op weefselstijfheid of cellulaire mechanotransductie.
- Biedt kwantitatieve eindpunten voor het evalueren van de impact van biomarkers of therapieën op de mechanische eigenschappen van weefsels.
Integratie van Pipeline & Workflow
Het BAXS-platform integreert in het continuüm van ontdekking naar preklinische fase door hypothese-gestuurde mechanobiologische studies, de ontwikkeling van kwantitatieve assays en translationele validatie van mechanische eindpunten mogelijk te maken.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt het toetsen van de nulhypothese voor mechanotransductie en cytoskeletfunctie onder gecontroleerde rekvelden.
- Screening: Biedt gestandaardiseerde, kwantitatieve metingen van deformatie en stijfheid voor vergelijkbaarheid van assays.
- Analytica: Levert rekspanningscomponenten, stress-strain-curves en metrieken voor nucleaire deformatie voor robuuste statistische analyse.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro mechanistische bevindingen en ex vivo weefselmechanica in ziektemodellen.
- Herbruikbaarheid voor ondernemingen: Biedt een modulair, microscopie-compatibel platform dat aanpasbaar is voor verschillende celtypen en weefselsystemen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de selectie en validatie van targets op basis van mechanobiologie.
- Operationele waarde: Standardiseert protocollen voor mechanische stimulatie en meting voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door mechanische fenotypes te kwantificeren die gekoppeld zijn aan ziekteprogressie of therapeutische respons.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering mogelijk van programma's waarbij weefselmechanica een belangrijke drijver van de pathologie zijn.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in mechanobiologie, microscopie en kwantitatieve beeldanalyse.
- Vereist toegang tot geïnverteerde fluorescentie- of fasecontrastmicroscopie en krachttransducers.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de fabricage van substraten, klemmen en beeldvormingsprotocollen.
- Aanpasbaar aan diverse celtypen en weefselmonsters met een passend ontwerp van de klem en het substraat.
- De doorvoer kan beperkt worden door handmatige monsterpreparatie en beeldvormingseisen.
