Name: A Novel Stretching platform voor toepassingen in de Cel en Weefsel Mechanobiology (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-03T14:15:00.000+00:00
Duration: 16 min 46 s
Description: Ontdek een nieuw anisotropisch rekplatform voor cel- en weefselmechanobiologie met C2C12-cellen en muizenaorta. Deze methode kwantificeert mechanische eigenschappen en celreacties op complexe biaxiale vervorming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DT werd ondersteund door een postdoctorale studententijd van le Fonds de Recherche du Quebec-Nature et Technologies (FQRNT) en een MITACS Elevate Strategic Fellowship. CMC werd ondersteund door een postdoctorale studententijd van le Fonds de Recherche en Sante du Quebec (FRSQ) en de Ernest en Margaret Ford cardiologie begiftigd research fellowship van de Universiteit van Ottawa Heart Institute. EOB werd ondersteund door exploitatiesubsidies MOP80204 van het Canadese Institute for Health Research (CIHR) en T6335 van de Heart and Stroke Foundation van Ontario. De CIHR en Medtronic leveren collectief EOB met een peer-reviewed Research Chair (URC # 57093). AEP wordt gefinancierd door de Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Discovery Grant, een NSERC Discovery Accelerator Supplement en dankbaar erkent de steun van de Canada Research Chairs (CRC)-programma en een Early Onderzoeker Award van de provincie Ontario.

1. Mechanische vervorming van enkele cellen <ol><li> Fabricage van een PDMS Ondergrond met ingebouwde TL-Beads Vóór vervaardiging van het substraat, worden fluorescente microsferen in water oplossing gesuspendeerd in isopropanol kraal menging te verbeteren op het PDMS vanwege de hydrofobe aard. <ol><li> Pipetteer 500 ul van fluorescerende microbolletjes in een 1,5 ml microcentrifugebuis en centrifugeer bij 16.200 xg gedurende 10 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant en voeg 500 ul van isopropanol gevolgd door 5 min van vortexen. Plaats de flacon aan de kant &#39;s nachts in het donker, zodat elke grote deeltjes aggregaten naar sediment. </li><li> De volgende ochtend, verwijder voorzichtig de bovenstaande vloeistof om een ​​schone microcentrifuge flacon. Deze kraal oplossing kan worden gebruikt om meer dan 5 substraten fabriceren. OPMERKING: De kraal oplossing blijft sediment voor de komende 3 dagen. Wees voorzichtig om te voorkomen resuspenderen de pellet. </li><li> Giet 0,5 g hardingsmiddel ontvangende PDMS kit 1,5 ml microcentrifuge flacon met een wetenschappelijke evenwicht. Door opeenvolgende stappen, voeg een totaal van 90 ui bolletjes (in zes 15 pl toevoegingen), vortexen gedurende 1 minuut tussen elke toevoeging. Zet opzij. </li><li> Weeg 10 g PDMS en meng gedurende ten minste 12 minuten met 0,5 g van het hardingsmiddel aangevuld met fluorescerende kralen. </li><li> Fabriceren van een SU-8 2050 kruisvormige mal met behulp van standaard fotolithografietechnieken volgende instructies van de fabrikant. De gebruikte matrijs heeft een hoogte van 320 um en een oppervlakte van 13,4 cm2 (figuur 3). De schimmel kan 428 ul of 440 mg van PDMS bevatten. </li><li> Giet 400 mg van de PDMS met kralen in het kruis-vormige mal met behulp van een pipet en uitharden gedurende 2 uur bij 80 ° C. Na uitharding, trek het substraat uit de mal (figuur 5A). Het substraat kan in een petrischaal bij kamertemperatuur gedurende 2 weken zonder dat significante veranderingen in de mechanische eigenschappen. </li&gt; <li> Giet druppeltjes PDMS (verharder: PDMS met een verhouding van 01:20) in een petrischaal met een uiteindelijke grootte van ongeveer 4 mm in diameter en genezen ondersteboven gedurende 2 uur bij 80 ° C (Figuur 5B). Deze verankering functies kunnen in een petrischaal weken bewaard. OPMERKING: Houd de schotel ondersteboven te voorkomen dat de druppels van afvlakking tijdens het uitharden. </li><li> Air-plasma-treat (30 sec bij 30 W) de ondergrond en 8 verankering functies. Bind de functies aan weerszijden van het substraat op een afstand van 4 mm van de vierkante streepje op het substraat (Figuur 5C). </li></ol></li><li> Montage Membraan op de klemmen <ol><li> Wikkel elk uiteinde van het substraat rond de gegroefde cilindrische deel van de klemmen en zet het vast met de 2 stelschroeven van boven (Figuur 2B en Cijfers 5D-E). </li><li> Schroef de 4 klemmen op de klem houder en giet PDMS (verhouding 01:20) met behulp van een disposable transfer pipet op het grensvlak tussen het substraat en de gegroefde cilindrische gedeelte van de klemmen. Spreid de niet uitgeharde PDMS rond de gegroefde cilindrische deel met behulp van een 1,5 mm inbussleutel. </li><li> Voor PDMS (01:20) in de groeven totdat volledig gevuld door capillaire werking en genezen het samenstel bij 80 ° C gedurende 2 uur (Figuur 5F). </li></ol></li><li> Seeding Cellen op het membraan <ol><li> Air-plasma behandeling (30 sec bij 30 W) het geheel te steriliseren en functionaliseren het substraat mogelijk te maken collageenbekleding. </li><li> Functionaliseren het gebied van het substraat waar de cellen worden geënt met 1 ml 0,02 M azijnzuur aangevuld met 16 ug / ml rat-tail collageen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. De gewenste uiteindelijke collageen dichtheid 5 ug / cm 2. </li><li> Spoel het substraat 3x met fosfaatbuffer en laten drogen bij kamertemperatuur voor tenminste 10 minuten. </li><li> Voeg 40 ul kweekmedium aangevuld met 10% foetaal runderserum serum en 1% penicilline-streptomycine bevattende 2000 cellen in het middengedeelte van het substraat naar een gebied van 1 cm2 dekking (celdichtheid: 20 cellen / mm 2). Celdichtheid kan worden gewijzigd volgens experimentele eisen. </li><li> Zet het geheel in een standaard celkweek incubator met de ondergrond naar boven met de daling van het kweekmedium dat de cellen op. OPMERKING: Het samenstel moet met het substraat naar boven minstens 3 uur om de cellen stevig hechten bewaard. Om verdamping te voorkomen, 30 pl warm kweekmedium wordt toegevoegd in de druppel op de ondergrond elke 45 min gedurende 3 uur. </li><li> Na 3 uur, draait het geheel in een petrischaal gevuld met vers kweekmedium aan het substraat onder te dompelen en incubeer overnacht om cellen te vermenigvuldigen. </li><li> De volgende dag bereiden HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBSS, 20 mM Hepes, 120 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 0,8 mM MgSO4, 1,8 mM CaCl2 en 11,1 mM dextrose). Breng de pH op 7,4. OPMERKING: De HBSS oplossing moet dagelijks worden bereid en bij 37 ° C gehouden tijdens de experimenten. Deze fysiologische oplossing wordt gebruikt om de cellen op de microscoop podium handhaven door het nabootsen van de normale weefsel / bloed omgeving. </li><li> Monteer de set-up op omgekeerde fase contrast of fluorescentiemicroscoop Monteer de klem-substraat montage op de BAXS platform en motoren. Vul de petrischaal in de petrischaal verwarming met HEPES buffer (figuur 2D). </li></ol></li></ol> 2. Stijfheid Meting van klein kaliber Schepen <ol><li> Voorbereiding <ol><li> Krebs fysiologische oplossing: Maak een oplossing van 118,1 mM NaCl, 11,1 mm D-glucose, 25 mM NaHCO3, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2 PO 4, en 2,5 mM CaCl2. Stel de pH op 7,4 en de oplossing met zuurstof carbogen medisch gas (95% O 2/5% CO2) gedurende 30 minuten. OPMERKING: De Krebs solutiop moet dagelijks worden bereid en bij 37 ° C gehouden tijdens de experimenten. Deze fysiologische oplossing wordt gebruikt om de weefsels levend houden door het nabootsen van de normale weefsel / bloed omgeving. </li><li> Verzamel instrumentatie voor de dissectie en mechanische beoordeling van aorta-schepen: chirurgische schaar, gebogen pincet, micro-schaar, chirurgische microscoop ontleden, 50 ml polypropyleen centrifugeerbuisjes, en 10 ml serologische pipetten. De chirurgische en experiment procedure geen steriele omstandigheden dit vereisen. Monteer de klemmen van de BAXS platform samen met de load cell vooraf. </li></ol></li><li> Tissue Isolatie en Dissection Alle experimentele procedures waarbij laboratoriumdieren hebben door de Animal Care en gebruik Comite van de gebruikers instelling, die voldoet aan de Health Guide voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de gebruikers land worden goedgekeurd. <ol><li> Voer muis euthanasie met de inhalatie van 99% CO 2 (7 psi)in een plexiglas kamer (figuur 6A). </li><li> Open muis buik en snijd de thoracale aorta om de muis te bloeden. </li><li> Verwijder het membraan, de borstkas en de longkwabben (figuur 6B). OPMERKING: Om het risico van beschadiging van het weefsel te minimaliseren, houden het hart verbonden aan de aorta en vermijd direct contact met schip, maar manipuleren met behulp van het hart. </li><li> Verwijder het hart, de aorta wortel en de thoracale aorta door voorzichtig te snijden tussen het schip en de wervelkolom. NB: Gebruik geen rek in het vat tijdens het uitsnijden niet bewegen om de inwendige structuur van het weefsel intact (figuur 6C) te houden. </li><li> Onmiddellijk onderdompelen en houden het hart en de aorta in Krebs oplossing. </li><li> Knip en zorgvuldig wassen van de aorta in Krebs oplossing voor elk bloedstolsels te verwijderen. Verwijder bindweefsel met behulp van micro-schaar, pincet en chirurgische dissectie microscoop (Figuur 6D-E). LET OP: Houd alle schepen met een lengte en gebruik de AORtic wortel naar de oriëntatie schip te bepalen. </li></ol></li><li> Vaartuig Dimension Vaststelling en Montage Om de stijfheid van het vaartuig te bepalen worden de onbelaste scheepsafmetingen vereist en kan worden gemeten met een geijkte microscoop. <ol><li> Snij een aorta ring van ongeveer 2 mm in lengte en nauwkeurig met behulp van een geijkte microscoop instelling (figuren 6F-G) zijn lengte te meten. Zet dit segment opzij Krebs oplossing. </li><li> Snijd een aortaring zo klein mogelijk tussen elk van de segmenten 2 mm (figuur 6F). Zet dit kleine segment op een microscoop glasplaatje met het lumen naar boven en meet de wanddikte met een geijkte microscoop instelling (Figuur 6H). </li><li> Vul de petrischaal op de BAXS platform met Krebs oplossing en plaats de 2 mm aorta ringsegment op het trekken pinnen (inzet in Figuur 4C). </li></ol></li></ol> ge = &quot;altijd&quot;&gt; <img alt="Figuur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig5highres.jpg" width="500" /> Figuur 5. PDMS substraat fabricage en montage. A) Na uitharding wordt het substraat zorgvuldig afgepeld de SU-8 2050 schimmel en opzij gezet in een petrischaal. B) Verankering kenmerken gemaakt van PDMS en helpen om de ondergrond te bereiken over de klemmen. C) Substraat van verankerings eigenschappen klaar voor montage. D) Het substraat wordt op de klemmen 4, die vervolgens op de klemmendrager zijn aangebracht (zie inzet) gemonteerd. E) Gedetailleerd beeld van het substraat gemonteerd op de 4 klemmen. F ) Procedure gieten PDMS in de groef onder het substraat. De pijl geeft de PDMS langzaam vullen van de groef door capillariteit. 454fig6highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figuur 6. Bereiding en isolatie van de thoracale aorta. A) Voorbereiding chirurgische instrumenten en de muis gedood. B) via een longitudinale incisie in de buik, de borstkas en longen lobs verwijderd. C) De aorta wordt zorgvuldig verwijderd met het hart te manipuleren het weefsel. D) Het hart en de aorta worden in Krebs fysiologische oplossing. De aorta wordt gereinigd door alle bindweefsels. E) Uitgebreide showing hart en de aorta. F) Aorta segment voor stijfheid evaluatie samen met kleine segmenten voor diktemeting. GH) De precieze lengte (G) en dikte (H) elk segment vaartuig geëvalueerd middels een inverse microscoop en een analyseprogramma.

<ol><li>Yim, E. K., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-dependent+cell+signaling+in+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation.</a> Stem Cell Res Ther. 3, (2012).</li>
<li>Vogel, V., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+force+and+geometry+sensing+regulate+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Local force and geometry sensing regulate cell functions.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 265-275 (2006).</li>
<li>Wang, N., Tytell, J. D., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+at+a+distance%3A+mechanically+coupling+the+extracellular+matrix+with+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 75-82 (2009).</li>
<li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+and+diseases+of+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology and diseases of mechanotransduction.</a> Ann Med. 35, 564-577 (2003).</li>
<li>Janmey, P. A., Miller, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mechanical+signaling+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mechanical signaling in development and disease.</a> J Cell Sci. 124, 9-18 (2011).</li>
<li>Bukoreshtliev, N. V., Haase, K., Pelling, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+cues+in+cellular+signalling+and+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanical cues in cellular signalling and communication.</a> Cell Tissue Res. 352, 77-94 (2013).</li>
<li>Chen, Y., Pasapera, A. M., Koretsky, A. P., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation-specific+responses+to+sustained+uniaxial+stretching+in+focal+adhesion+growth+and+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Orientation-specific responses to sustained uniaxial stretching in focal adhesion growth and turnover.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, (2013).</li>
<li>Rosenzweig, D. H., Matmati, M., Khayat, G., Chaudhry, S., Hinz, B., Quinn, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Primary+Bovine+Chondrocytes+on+a+Continuously+Expanding+Surface+Inhibits+Dedifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Culture of Primary Bovine Chondrocytes on a Continuously Expanding Surface Inhibits Dedifferentiation.</a> Tissue Eng Part A. 18, 2466-2476 (2012).</li>
<li>Balachandran, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+strain+induces+dual-mode+endothelial-mesenchymal+transformation+of+the+cardiac+valve%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cyclic strain induces dual-mode endothelial-mesenchymal transformation of the cardiac valve.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 19943-19948 (1994).</li>
<li>Steward, R., Cheng, C. M., Ye, J., Bellin, R., LeDuc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stretch+and+shear+flow+induced+reorganization+and+recruitment+of+fibronectin+in+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Mechanical stretch and shear flow induced reorganization and recruitment of fibronectin in fibroblasts.</a> Sci Rep. 1, (2011).</li>
<li>Wang, D., Xie, Y., Yuan, B., Xu, J., Gong, P., Jiang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stretching+device+for+imaging+real-time+molecular+dynamics+of+live+cells+adhering+to+elastic+membranes+on+inverted+microscopes+during+the+entire+process+of+the+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">A stretching device for imaging real-time molecular dynamics of live cells adhering to elastic membranes on inverted microscopes during the entire process of the stretch.</a> Integr Biol (Camb). 2, 288-293 (2010).</li>
<li>Haskett, D., Johnson, G., Zhou, A., Utzinger, U., Van de Geest, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructural+and+biomechanical+alterations+of+the+human+aorta+as+a+function+of+age+and+location%5BTitle%5D)+AND+%22Biomech+Model+Mechanobiol%22%5BJournal%5D)">Microstructural and biomechanical alterations of the human aorta as a function of age and location.</a> Biomech Model Mechanobiol. 9, 725-736 (2010).</li>
<li>Duprey, A., Khanafer, K., Schlicht, M., Avril, S., Williams, D., Berguer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterisation+of+physiological+and+maximum+elastic+modulus+of+ascending+thoracic+aortic+aneurysms+using+uniaxial+tensile+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Vasc+Endovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">In vitro characterisation of physiological and maximum elastic modulus of ascending thoracic aortic aneurysms using uniaxial tensile testing.</a> Eur J Vasc Endovasc Surg. 39, 700-707 (2010).</li>
<li>Tremblay, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+mechanical+properties+of+materials+used+in+aortic+arch+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Thorac+Surg%22%5BJournal%5D)">A comparison of mechanical properties of materials used in aortic arch reconstruction.</a> Ann Thorac Surg. 88, 1484-1491 (2009).</li>
<li>Khanafer, K., Duprey, A., Zainal, M., Schlicht, M., Williams, D., Berguer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+elastic+modulus+of+ascending+thoracic+aortic+aneurysm+at+different+ranges+of+pressure+using+uniaxial+tensile+testing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+thoracic+and+cardiovascular+surgery%22%5BJournal%5D)">Determination of the elastic modulus of ascending thoracic aortic aneurysm at different ranges of pressure using uniaxial tensile testing.</a> The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 142, 682-686 (2011).</li>
<li>Van de Geest, J. P., Sacks, M. S., Vorp, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+aneurysm+on+the+biaxial+mechanical+behavior+of+human+abdominal+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">The effects of aneurysm on the biaxial mechanical behavior of human abdominal aorta.</a> J Biomech. 39, 1324-1334 (2006).</li>
<li>Guolla, L., Bertrand, M., Haase, K., Pelling, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+transduction+and+strain+dynamics+in+actin+stress+fibres+in+response+to+nanonewton+forces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Force transduction and strain dynamics in actin stress fibres in response to nanonewton forces.</a> J Cell Sci. 125, 603-613 (2012).</li>
<li>Wang, J. H., Goldschmidt-Clermont, P., Wille, J., Yin, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+endothelial+cell+reorientation+in+response+to+cyclic+mechanical+stretching%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Specificity of endothelial cell reorientation in response to cyclic mechanical stretching.</a> J Biomech. 34, 1563-1572 (2001).</li>
<li>Jungbauer, S., Gao, H., Spatz, J. P., Kemkemer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+characteristic+regimes+in+frequency-dependent+dynamic+reorientation+of+fibroblasts+on+cyclically+stretched+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Two characteristic regimes in frequency-dependent dynamic reorientation of fibroblasts on cyclically stretched substrates.</a> Biophys J. 95, 3470-3478 (2008).</li>
<li>Dahl, K. N., Ribeiro, A. J. S., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+shape%2C+mechanics%2C+and+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Nuclear shape, mechanics, and mechanotransduction.</a> Circ Res. 102, 1307-1318 (2008).</li>
<li>Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosignaling+to+the+cell+nucleus+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Mechanosignaling to the cell nucleus and gene regulation.</a> Annu Rev Biophys. 40, 361-378 (2011).</li>
<li>Chiquet, M., Gelman, L., Lutz, R., Maier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+mechanotransduction+to+extracellular+matrix+gene+expression+in+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">From mechanotransduction to extracellular matrix gene expression in fibroblasts.</a> Biochim Biophys Acta. 1793, 911-920 (2009).</li>
<li>Sullivan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+A-type+lamin+expression+compromises+nuclear+envelope+integrity+leading+to+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of A-type lamin expression compromises nuclear envelope integrity leading to muscular dystrophy.</a> J Cell Biol. 147, 913-920 (1999).</li>
<li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A%2FC+deficiency+causes+defective+nuclear+mechanics+and+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction.</a> J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).</li>
<li>Tremblay, D., Andrzejewski, L., Leclerc, A., Pelling, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+microtubules+play+distinct+roles+in+governing+the+anisotropic+deformation+of+cell+nuclei+in+response+to+substrate+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Actin and microtubules play distinct roles in governing the anisotropic deformation of cell nuclei in response to substrate strain.</a> Cytoskeleton. , (2013).</li>
<li>Cuerrier, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+over-expression+of+heat+shock+protein+27+attenuates+atherogenesis+and+enhances+plaque+remodeling%3A+a+combined+histological+and+mechanical+assessment+of+aortic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Chronic over-expression of heat shock protein 27 attenuates atherogenesis and enhances plaque remodeling: a combined histological and mechanical assessment of aortic lesions.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Tremblay, D., Cartier, R., Mongrain, R., Leask, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+dependency+of+the+vascular+smooth+muscle+cell+contribution+to+the+mechanical+properties+of+the+pig+ascending+aortic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Regional dependency of the vascular smooth muscle cell contribution to the mechanical properties of the pig ascending aortic tissue.</a> J Biomech. 43, 2448-2451 (2010).</li>
<li>Barker, A. J., Lanning, C., Shandas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+hemodynamic+wall+shear+stress+in+patients+with+bicuspid+aortic+valve+using+phase-contrast+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Quantification of hemodynamic wall shear stress in patients with bicuspid aortic valve using phase-contrast MRI.</a> Ann Biomed Eng. 38, 788-800 (2010).</li>
<li>Haga, J. H., Li, Y. S. J., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+effects+of+mechanical+stretch+on+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the effects of mechanical stretch on vascular smooth muscle cells.</a> J Biomech. 40, 947-960 (2007).</li>
<li>Frydrychowicz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+magnetic+resonance+angiography+and+flow-sensitive+4-dimensional+magnetic+resonance+imaging+at+3+Tesla+for+blood+flow+and+wall+shear+stress+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+thoracic+and+cardiovascular+surgery%22%5BJournal%5D)">Time-resolved magnetic resonance angiography and flow-sensitive 4-dimensional magnetic resonance imaging at 3 Tesla for blood flow and wall shear stress analysis.</a> The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 136, 400-407 (2008).</li>
<li>Boccafoschi, F., Mosca, C., Bosetti, M., Cannas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mechanical+stretching+in+the+activation+and+localization+of+adhesion+proteins+and+related+intracellular+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">The role of mechanical stretching in the activation and localization of adhesion proteins and related intracellular molecules.</a> J Cell Biochem. 112, 1403-1409 (2011).</li>
<li>Yang, G., Crawford, R. C., Wang, J. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+collagen+production+of+human+patellar+tendon+fibroblasts+in+response+to+cyclic+uniaxial+stretching+in+serum-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Proliferation and collagen production of human patellar tendon fibroblasts in response to cyclic uniaxial stretching in serum-free conditions.</a> J Biomech. 37, 1543-1550 (2004).</li>
<li>Goldyn, A. M., Rioja, B. A., Spatz, J. P., Ballestrem, C., Kemkemer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-induced+cell+polarisation+is+linked+to+RhoA-driven+microtubule-independent+focal-adhesion+sliding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Force-induced cell polarisation is linked to RhoA-driven microtubule-independent focal-adhesion sliding.</a> J Cell Sci. 122, 3644-3651 (2009).</li>
<li>Heo, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+stretch+and+reorientation+modulates+mesenchymal+stem+cell+morphology+and+fibrous+gene+expression+on+oriented+nanofibrous+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Fiber stretch and reorientation modulates mesenchymal stem cell morphology and fibrous gene expression on oriented nanofibrous microenvironments.</a> Ann Biomed Eng. 39, 2780-2790 (2011).</li>
<li>Zdero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+and+torsional+mechanical+characteristics+of+intact+and+reconstructed+scapholunate+ligaments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Linear and torsional mechanical characteristics of intact and reconstructed scapholunate ligaments.</a> J Biomech Eng. 131, (2009).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

De BAXS platform gepresenteerde vergemakkelijkt talrijke experimenten in de studie van mechanobiology uit onderzoek van enkelvoudige cellen tot volledige weefsels. Bovendien, het platform is zeer flexibel en configureerbaar, waardoor talrijke mechanische stimulatie experimenten en multi-axiale trekproeven. Het platform maakt ook het onderhoud van cellen en weefsels in fysiologische omstandigheden en toelaten om gelijktijdig microscopie tijdens het spannen experimenten. De twee experimenten in de vorige paragrafen beschr...

De mechanische micro speelt een belangrijke rol in vele celfuncties zoals proliferatie, migratie en differentiatie, die een grote invloed hebben op de ontwikkeling en homeostase van weefsels en ook ziekten 1-6. In de loop der jaren, hebben een veelheid van experimentele instrumenten gebruikt om mechanisch te stimuleren cellen of weefsels en meet mechanische eigenschappen van biologische weefsels met als doel het vergroten van ons begrip van de fundamentele mechanobiology en het bestuderen van het ontstaan ​​en de progressie van ziekten 6-17. Men moet echter vaak afhankelijk van verschillende experimentele apparatuur om de doelstellingen van een bepaalde studie te bereiken. Dit artikel presenteert een enkele, multi-functionele, biaxiale (BAXS) platform dat zorgt voor studies die de rol te onderzoeken dat de mechanische eigenschappen en de mechanische krachten spelen in de biologie aan de sub-cellulaire om hele weefsel lengteschalen. De BAXS platform biedt niet alleen voor de quantification van de mechanische eigenschappen van geïsoleerde weefsels, maar vergemakkelijkt ook het vermogen om eenvoudige, complexe en dynamische belasting velden aan levende cellen om hun reacties begrijpen strekken dat voorkomt in vivo. De BAXS platform onderhoudt ook de capaciteit om live-cell microscopie voeren tijdens mechanische testen en storingen op cellen en weefsels. De BAXS platform is een op maat gemaakte inrichting die kan worden gebruikt om het effect van substraat vervorming onderzoeken op cellulair niveau uitvoeren tractie op biologische weefsels (Figuur 1A). Een aluminium verwarming werd vervaardigd op een standaard 10 cm Petrischaal ontvangen en fysiologische oplossingen handhaven op 37 ° C met een temperatuurregelaar en Kapton heaters (Figuur 1B). Deze BAXS platform kan worden geïntegreerd op een omgekeerde fase contrast en / of fluorescentie microscoop en maakt gelijktijdige beeldvorming (figuur 1C).Kortom, de BAXS platform bestaat uit vier lineaire voice coil motoren waarvan de bewegende delen van miniatuur lineaire beweging kogellagers georiënteerd langs twee loodrechte assen (figuur 1D) zijn gemonteerd. Een lineaire positioneertafel is gemonteerd op elk van de vier motoren verticale beweging van het klemsysteem wordt gebruikt (figuur 1E) mogelijk. De positie van elke motor wordt bewaakt door een optische encoder met een resolutie van 500 nm (figuur 1F). Alle vier de motoren worden onafhankelijk geregeld met een motion controller in dienst optische encoder feedback om beweging commando&#39;s (figuur 1G) uit te voeren. Een LabVIEW interface biedt volledige controle over de omvang verplaatsing, snelheid en versnelling van elke motor om volledig klantgerichte, statische en dynamische vervorming van de cellen of weefselmonsters genereren. De gebruikte techniek om vervorming induceren wordt bereikt door eenvoudigweg allowing cellen stevig vasthouden aan een flexibel en transparant substraat en vervolgens stretching dit substraat met behulp van de vier motoren van de BAXS platform. De BAXS platform maakt het monteren van een op maat gemaakte set van klemmen aan het substraat op de voice coil motoren hechten. Hiervoor hebben we een reeks van klemmen waaraan een flexibel en transparant substraat van polydimethylsiloxaan (PDMS), kan worden bevestigd (figuren 2A-C en figuur 3). Als de klemmen worden blootgesteld aan fysiologische oplossingen werden alle onderdelen vervaardigd uit roestvast staal om voor sterilisatie. Deze klemmen zijn zorgvuldig ontworpen om het substraat zo dicht mogelijk bij het ​​microscoopobjectief brengen om de beeldkwaliteit te verbeteren terwijl het minimaliseren van de belasting van het substraat tijdens het spannen (fig. 2D). Dezelfde BAXS platform kan ook worden gebruikt om de stijfheid van kleine weefselmonsters te kwantificeren, met behulp van een geschikte set van klemmen met ADAPted steunen voor de weefselmonsters en een load cell om de krachten te controleren. Verschillende benaderingen kunnen worden genomen om een ​​weefsel te monteren op het platform BAXS motoren; in dit geval de roestvrijstalen insect minutiens kunnen kan haak door de opening van vaatweefsel om trekproeven (figuren 4A-B) verricht. Als alternatief voor dikke weefsels zonder natuurlijke opening, weefsel randen ofwel plaats gehouden met klemmen aan de spreekspoel motoren of gelijmd kleine glasplaatjes met biologische lijm en aan de motoren met de klemmen. Om treksterkte voeren tests een miniatuur load cell is vereist en kan gemakkelijk worden opgenomen op de BAXS platform motoren en gebruikt om de kracht die op het weefsel tijdens een cyclus strekken (figuur 4C) meten. Aangezien de BAXS platform is samengesteld uit vier motoren, de invoering van een tweede load cell kan men trekproeven uitgevoerd langs twee orthogonale richtingen. Dit vermogen maakt het mogelijk om quantify de mechanische stijfheid van een weefsel langs twee loodrechte richtingen in hetzelfde experiment. Belangrijk in alle configuraties, de cellen of weefselmonsters plaats altijd gehandhaafd op een temperatuur geregeld bad dat toegankelijk is voor de gebruiker. Dit vermogen maakt de invoering van farmacologische middelen in monster strekken om de temporele respons van het monster te onderzoeken. Bovendien, aangezien de optische as van de omgekeerde microscoop vrij blijft, alle vormen van microscopie nog beschikbaar voor de gebruiker. Ten slotte alle vier motoren van de BAXS platform onafhankelijk is het mogelijk om zeer configureerbare spanning velden toegepast om het monster plaats. In vivo cellen en weefsels worden blootgesteld aan complexe anisotrope strekken die geschikter nagebootst in dit platform, in tegenstelling de traditionele eenassige stretching platform 7,13,15,18,19. Bovendien zijn de fysische eigenschappenvan de veldstam on the fly kan worden gewijzigd tijdens een experiment. Deze vaardigheden kan de gebruiker de cellulaire en weefselniveau reactie op een groot aantal zeer complexe anisotrope, tijdelijk en ruimtelijk variërende spanning actiegebieden. Dit artikel beschrijft de voordelen en beperkingen van de BAXS platform, alsmede het ontwerp, de werkingsprincipes en de experimentele gegevens voor enkele cel en hele weefsel experimenten. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig1highres.jpg" width="500" /> Figuur 1. Overzicht van de BAXS platform. A) Bovenaanzicht van de BAXS platform met de vier voice coil motor. B) Gedetailleerd beeld van de petrischaal verwarmingselement gebruikt om cellen en weefsels bij 37 ° C. C te houden) Het platform kan op een omgekeerde microscoop worden gemonteerd live- cell imaging tijdens stretching experimenten.D) Gedetailleerd beeld van de voice coil motor; het bewegende deel van het platform. E) gedetailleerd beeld van de lineaire positionering podium waardoor verticale verplaatsing van de klem-systemen. F) Gedetailleerd beeld van de optische encoder die real-time positie van de motor zorgt voor de motion controller. G) Gedetailleerd beeld van de motion controller met de vier optische encoder ingangen en vermogens om de vier voice coil motoren. <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig2highres.jpg" width="500" /> Figuur 2. Spansysteem voor mobiele stretching experimenten. AB) Foto de details van de klemmen worden gebruikt om de PDMS substraat hechten aan de spreekspoel motoren strekken. C) Het substraat wordt gewikkeld rond het cilindrische gedeelte van de klem met de verankering Features zitten in de groef aan de top. Dan is de ondergrond wordt bevestigd met behulp van de stelschroeven dat het substraat te duwen / verankering functies in de bovenste groef. D) Illustratie van de BAXS platform met de klemmen die de ondergrond op zijn plaats. De inzet toont een gedetailleerd aanzicht van het substraat met cellen verbonden te zitten boven een dekglas en het microscoopobjectief. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig3highres.jpg" width="500" /> Figuur 3. Bill van materialen van het membraan en het spansysteem. Tekeningen toont de afmetingen van de belangrijkste onderdelen geïntegreerd in het biaxiale platform cel strekken experimenten. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig4highres.jpg" width="500" /> Figuur 4. Exruim van een klemsysteem voor stijfheid beoordeling van klein kaliber schepen. AB) Gedetailleerde foto&#39;s van het klemsysteem gebruikt om vervorming te induceren in een 1 mm diameter muis aorta. Roestvrij stalen pennen zijn zorgvuldig gevormd in open driehoeken, zodat het schip te glijden op beide pinnen. C) Illustratie van de BAXS platform met de klemmen houden van het vaartuig en een meetcel bevestigd tussen de vaste motor en de linker klem. De inzet toont een gedetailleerd bovenaanzicht van het vat gemonteerd op de pennen.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>De verhouding basis tot cross-linker die in dit protocol wordt gebruikt, is 20:1. Meng in een laminare kap om te voorkomen dat stof je &nbsp;vervuilt</td></tr><tr><td>FluoSpheres fluorescente microspheres</td><td>Invitrogen</td><td>F8810</td><td>Uit de buurt van licht houden.</td></tr><tr><td>Lineaire voicespoel</td><td>Moticont</td><td>LVCM-051-051-01</td><td>De motor komt in twee delen (magneet en spoel). Het moet op een kogellagersysteem worden gemonteerd om functioneel te zijn.</td></tr><tr><td>Kogellagerschuif</td><td>Edmund Optics</td><td>NT37-360</td><td>Miniatuur en kleine lineaire bewegingskogellagerschuiven</td></tr><tr><td>Lineaire positioneringsfase</td><td>Edmund Optics</td><td>38-960</td><td>Center Drive 1.25" Square Linear Translation Stages</td></tr><tr><td>Optische encoder</td><td>GSI microE systems</td><td>Mercury II 1600S - 0.5um resolutie</td><td>Reflectieve incrementele encoder.</td></tr><tr><td>Motion controller</td><td>Galil</td><td>DMC-2143(DIN)-DC48 met AMP-20440</td><td>4-assige controller met een 4-assige versterker</td></tr><tr><td>Belastingscel</td><td>Honeywell</td><td>31 laag</td><td>Miniatuur belastingscel met een bereik van 0-150 g</td></tr><tr><td>Insect minutiens pins (0.20 mm)</td><td>Pin Service Austerlitz Insect pins</td><td></td><td>Roestvrijstalen pinnen die in een geopende driehoekige vorm zijn gebogen</td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>Micro Chem</td><td>SU-8 2050</td><td>Permanente epoxy negatieve fotoresist. Uit de buurt van warmte en licht houden</td></tr><tr><td>Air-plasma behandelingssysteem</td><td>Glowresearch</td><td></td><td>Autoglow zuurstofplasma systeem</td></tr><tr><td>Rat-tail collageen</td><td>Invitrogen</td><td>A10483-01</td><td>Collageen I, rattenstaart 5 mg/ml</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td>DNA-specifieke fluorescerende kleurstof. In de koelkast bewaren.</td></tr><tr><td>Kapton (Polyimide Film) Geïsoleerde flexibele verwarmers</td><td>omega.ca</td><td>KHLV-0504/(10)-P</td><td>28 V flexibele verwarmers; kan worden geleverd met een 24 V</td></tr><tr><td>1/16 DIN Autotune Temperatuur en Proces Controllers</td><td>omega.ca</td><td>CN63200-R1-LV</td><td>Temperatuurregelaar; voeding 24 V.</td></tr><tr><td>DMEM kweekmedium</td><td>Hyclone</td><td>SH3024301</td><td>Dulbecco&rsquo;s Gemodificeerd 30 Eagle Medium. Bewaar bij 4 &#176;C</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Voorraad bevroren houden. Werkoplossing bij 4 &#176;C bewaren.</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH3039603C</td><td>Ingevroren bewaren.</td></tr><tr><td>Trypsine 0.05%</td><td>Hyclone</td><td>SH30236.02</td><td>Ingevroren bewaren. Digestie van celaanhechtingseiwitten voor subcultivatie</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Wisent Inc</td><td>330-050-EL</td><td>HEPES-gebufferde zout oplossing&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>HEPES-gebufferde zout oplossing / Krebs fysiologische oplossing</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td>HEPES-gebufferde zout oplossing / Krebs fysiologische oplossing</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td>HEPES-gebufferde zout oplossing / Krebs fysiologische oplossing</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-500</td><td>HEPES-gebufferde zout oplossing / Krebs fysiologische oplossing</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td>HEPES-gebufferde zout oplossing / Krebs fysiologische oplossing</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-1</td><td>Krebs fysiologische oplossing</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td>Krebs fysiologische oplossing</td></tr><tr><td>Carbogen 95% O2/5% CO2</td><td>Lindle</td><td>DIN:02154749</td><td>Krebs fysiologische oplossing oxygenatie</td></tr><tr><td>Nocodazol</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td>Microtubuli depolymerisatie agens</td></tr><tr><td>Cytochalasin-D</td><td>Sigma</td><td>C8273</td><td>Actine filamenten depolymerisatie agens</td></tr><tr><td>Anti-&alpha;-SMA-FITC</td><td>Sigma</td><td>F3777</td><td>Gebruikt om gladde spiercelcontent te kleuren en te kwantificeren</td></tr><tr><td>Picrosirius rood kleurstof</td><td>Fluka</td><td>43665</td><td>Gebruikt om collageengehalte te kleuren en te kwantificeren</td></tr></tbody></table>

a novel stretching platform voor toepassingen in de cel en weefsel mechanobiology

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Gereedschappen die het uitoefenen van mechanische krachten om cellen en weefsels of waarmee kan kwantificeren de mechanische eigenschappen van biologisch weefsel dramatisch bijgedragen tot het begrijpen van fundamentele mechanobiology. Deze technieken zijn uitgebreid gebruikt om aan te tonen hoe het ontstaan ​​en de progressie van verschillende ziekten sterk worden beïnvloed door mechanische signalen. Dit artikel presenteert een multi-functionele biaxiale (BAXS) platform dat mechanisch kunnen stimuleren enkele cellen of kwantificeren van de mechanische stijfheid van weefsels. De BAXS platform bestaat uit vier voice coil motoren die onafhankelijk kunnen worden bestuurd. Enkele cellen kunnen worden gekweekt op een flexibel substraat dat kan worden bevestigd aan de motor zodat men de cellen blootgesteld aan complexe, dynamische en ruimtelijk variërende spanning velden. Omgekeerd, doordat een kracht load cell, kan ook kwantificeren de mechanische eigenschappen van primaire weefsels ze worden blootgesteld aan deformatie cycli.In beide gevallen moet een goede set van klemmen worden ontworpen en gemonteerd aan de BAXS platform motoren om stevig vast te houden het flexibel substraat of het weefsel van belang. De BAXS platform kan op een omgekeerde microscoop worden gemonteerd gelijktijdige doorvallend licht en / of fluorescentie beeldvorming uit te voeren om de structurele of biochemische reactie van het monster tijdens het spannen experimenten onderzoeken. Dit artikel geeft experimentele details van het ontwerp en het gebruik van de BAXS platform en presenteert de resultaten voor enkele cel en hele weefsel studies. De BAXS platform werd gebruikt om de vervorming van kernen in enkele muis myoblast cellen in reactie meten spanning substraat en de stijfheid van geïsoleerde muis aorta meten. De BAXS platform is een veelzijdig instrument dat kan worden gecombineerd met verschillende optische microscopie om nieuwe mechanobiologische inzichten op de sub-cellulair, cellulaire en hele weefsel niveaus bieden.

Cel Stretching De BAXS platform werd gebruikt om de mechanische reactie van de kern in enkele muis myoblast cellen (C2C12) blootgesteld aan een substraat vervorming van 25% onderzocht. Myoblast cellen worden aangetroffen in het spierweefsel en worden voortdurend blootgesteld aan mechanische rek en compressie in vivo. De vorm en mechanische eigenschappen van de celkern blijkt een belangrijke rol spelen bij de regulatie van genexpressie en transcriptionele activiteit ...

We presenteren in dit artikel een nieuw strekken platform dat kan worden gebruikt om cel responsen op complexe anisotrope biaxiale mechanische vervorming onderzoeken en kwantificeren van de mechanische eigenschappen van biologisch weefsel.

A Novel Stretching platform voor toepassingen in de Cel en Weefsel Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Het algemene doel van deze procedure is om de nieuwheid van een anisotroop rekplatform aan te tonen dat kan worden gebruikt om reacties van individuele cellen op complexe mechanische vervorming te onderzoeken en om de mechanische eigenschappen van biologische weefsels te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst het flexibele membraan te vervaardigen en dit membraan op een reeks klemmen te bevestigen. De tweede stap is om C two C 12 cellen gedurende één nacht op het membraan te kweken, om de volgende dag de klemmen op het rekplatform te monteren.Vervolgens, in een tweede reeks experimenten, worden thoracische aortawefsels uitgenomen uit een muismodel en gereinigd van eventueel bindweefsel. Daarna wordt het aortawefsel op het rekplatform gemonteerd met behulp van een andere set klemmen. Ten slotte wordt het rekplatform gebruikt om een vervorming in cellen langs twee orthogonale richtingen op te wekken, die gekwantificeerd kan worden met een omgekeerde microscoop.Als alternatief is een krachttransducer geïntegreerd in het rekapparaat om de weefselstijfheid te meten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken, zoals uni-axiaal of bi-axiaal celrekken, is dat het ons in staat stelt om onafhankelijk de vervorming in twee orthogonale richtingen te beheersen in een transparant membraan waaraan cellen zijn gehecht, waardoor live-cell imaging mogelijk wordt. Voor microscopie is daarnaast een zorgvuldig ontwerp van een andere set klemmen vereist.Door de integratie van een gebruikersinterface met vier snaren op het platform, kunnen we tests uitvoeren op 10 cellen in biologisch weefsel voor de kwantificering van hun mechanische eigenschappen. Deze video presenteert het Biaxial Stretching platform, een op maat gebouwd apparaat dat kan worden gebruikt om het effect van substraatdeformatie op cellulair niveau te onderzoeken en trekproeven uit te voeren op biologische weefsels. Het ontwerp en de kenmerken van het Biaxial stretching platform worden in het bijbehorende manuscript gedetailleerd; om het effect van mechanische deformatie van individuele cellen te onderzoeken, moet eerst een flexibel en transparant substraat worden gefabriceerd waarop cellen kunnen hechten.Om deze procedure te starten, pipetteert u 500 µL van een fluorescerende microsfeeroplossing in een microcentrifugebuis van 1,5 mL en centrifugeert u deze gedurende 10 minuten bij 16.200 ×g. Verwijder het supernatant en voeg 500 µL isopropanol toe, gevolgd door vijf minuten vortexen. Zet het flacon gedurende de nacht in het donker om eventuele grote partikelaggregaten te laten sedimenteren; breng de volgende ochtend het supernatant voorzichtig over naar een schoon microcentrifugebuisje. Deze bolletjesoplossing kan worden gebruikt voor het vervaardigen van meer dan vijf substraten, aangezien de bolletjesoplossing gedurende de volgende drie dagen zal blijven sedimenteren.Het is belangrijk om te voorkomen dat Resus het pellet resuspendeert. Giet 0,5 gram van het uithardingsmiddel dat bij de PDMS-kit is geleverd in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter. Voeg 15 microliters fluorescente beads toe en vortex gedurende één minuut.Herhaal dit nog vijf keer om in totaal 90 µL kralen toe te voegen. Zet dit apart. Weeg 10 g PDMS af, voeg 0,5 g van het uithardingsmiddel toe, aangevuld met fluorescerende kralen, en meng dit gedurende ten minste 12 minuten. Gebruik vervolgens de transferpipet om vier mg van het PDMS met kralen over te brengen naar een kruisvormige SUH 2050-mal die eerder is vervaardigd met standaard fotolithografische technieken.De mal heeft een hoogte van 320 micrometers en een oppervlakte van 13,4 vierkante centimeters en kan 428 microliters of 440 milligram PDMS bevatten; laat het PDMS twee uur uitharden bij 80 °C. Pel na het uitharden het substraat van de mal af; het substraat kan twee weken in een Petrischaal bij kamertemperatuur worden bewaard zonder dat er significante veranderingen in de mechanische eigenschappen optreden. Giet druppels PDMS in een Petrischaal met een uiteindelijke grootte van ongeveer vier millimeter in diameter en laat deze twee uur ondersteboven uitharden bij 80 °C; de schaal moet ondersteboven worden gehouden om te voorkomen dat de druppels tijdens het uithardingsproces afplatten.Deze ankerpunten kunnen wekenlang in een Petrischaal worden bewaard. Behandel het substraat en de acht ankerpunten met luchtplasma; bevestig de ankerpunten aan beide uiteinden van het substraat op een afstand van vier millimeter van de vierkante inkeping op het substraat om het membraan op de klemmen te monteren. Wikkel elk uiteinde van het substraat rond het cilindrische groefgedeelte van de klemmen en zet deze op hun plaats vast met de twee stelschroeven aan de bovenzijde.Draai de vier klemmen vast op de klemhouder. Giet vervolgens PDMS op de interface tussen het substraat en het gegroefde gedeelte van de klemmen. Verdeel de ongeharde PDMS rond het gegroefde cilindrische gedeelte met een 1,5 millimeter inbussleutel.Giet PDMS in de groeven tot deze door capillaire werking volledig zijn gevuld en laat de assemblage twee uur uitharden bij 80 °C voordat de cellen op het membraan worden gezaaid. Behandel de gehele assemblage met luchtplasma om het substraat te steriliseren en te functionaliseren, zodat een collageencoating mogelijk is.Functionaliseer het gebied van het substraat waar de cellen gezaaid zullen worden met één milliliter 0,02 molar azijnzuur, aangevuld met 16 microgram per milliliter rattenstaartcollageen, gedurende één uur bij kamertemperatuur. De gewenste uiteindelijke collagenedichtheid is vijf microgram per vierkante centimeter. Spoel het substraat na één uur drie keer af met fosfaatbuffer en laat het gedurende ten minste 10 minuten drogen bij kamertemperatuur. Voeg 40 microliter kweekmedium toe, aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline.Streptomycine met 2000 cellen in het centrale gedeelte van het substraat om een oppervlakte van één vierkante centimeter te bedekken. In dit voorbeeld is de celdichtheid 20 cellen per vierkante centimeter. De celdichtheid kan echter worden aangepast op basis van de experimentele vereisten.Plaats de gehele opstelling in een standaard celcultuurbroedmachine met het substraat naar boven gericht, met daarop de druppel kweekmedium waarin de cellen zich bevinden. De opstelling moet gedurende ten minste drie uur met het substraat naar boven worden bewaard om de cellen de mogelijkheid te geven stevig te hechten en om verdamping te voorkomen. Er wordt 30 µL warm kweekmedium toegevoegd aan de druppel op het substraat.Keer na drie uur elke 45 minuten de gehele opstelling om in een Petrischaal gevuld met vers kweekmedium om het substraat onder te dompelen; incubeer dit een nacht om de cellen te laten prolifereren. Plaats de opstelling de volgende dag op een geïnverteerde fasecontrast- of fluorescentiemicroscoop. Monteer de klem-substraatopstelling op het biaxiale stretchplatform en vul de Petrischaal in de Petrischaalverwarmer met een vers bereide HEPs-gebufferde zoutoplossing.Deze fysiologische oplossing wordt gebruikt om de cellen op de microscooptafel in stand te houden door de normale bloedomgeving van het weefsel na te bootsen. Hetzelfde biaxiale stretchplatform kan ook worden gebruikt om de stijfheid van kleine weefselmonsters te kwantificeren. In deze demonstratie worden geïsoleerde muisaorta's gebruikt.Verwijder het diafragma, de borstkas en de longkwabben van de geëuthanaseerde muis om het risico op weefselschade te minimaliseren. Laat het hart verbonden met de aorta en vermijd direct contact met het bloedvat bij het manipuleren van het hart.Verwijder het hart, de aortawortel en de thoracale aorta door voorzichtig tussen het vat en de wervelkolom te snijden om de innerlijke structuur van het weefsel intact te houden. Let erop dat het vat tijdens de incisie niet wordt uitgerekt. Dompel het hart en de aorta onmiddellijk onder in Krebs-oplossing, die dagelijks vers wordt bereid en tijdens de experimenten op 37 °C wordt gehouden.Snijd de aorta uit en was deze zorgvuldig in Krebs-oplossing om bloedstolsels te verwijderen terwijl u onder een chirurgische dissectiemicroscoop werkt. Verwijder het bindweefsel met microschaartjes en pincetten. Het is belangrijk om de volledige lengte van het vat te behouden en de aortawortel te gebruiken om de oriëntatie van het vat te bepalen.De afmetingen van het onbelaste vat zijn vereist om de stijfheid van het vat te bepalen. Snijd een aortaring van ongeveer twee millimeter lengte en meet de lengte nauwkeurig met een gekalibreerde microscoopinstelling. Leg dit segment apart in Krebs-oplossing.Snijd vervolgens twee kleine aortaringen uit de secties van de aorta die overbleven na de verwijdering van het segment van twee millimeter. Neem één ring uit de sectie van de aorta vóór het segment van twee millimeter en een andere ring uit de sectie van de aorta na het segment van twee millimeter. Plaats beide aortaringen op een microscoopglas met het lumen naar boven gericht en meet de wanddikte met behulp van een gekalibreerde microscoopinstelling.De wanddikte van de aorta wordt gemeten en gemiddeld met behulp van deze twee ringen. Vul de Petrischaal op het biaxiale rekplatform met Krebs-oplossing en plaats het aortaringsegment van twee millimeter op de trekpinnen. In dit protocol werd het biaxiale rekplatform gebruikt om de mechanische respons van de kern in individuele myoblastcellen van muizen te onderzoeken die werden blootgesteld aan een substraatdeformatie van 25%verplaatsingsdeformatie.Relaties voortvloeiend uit het uitvoeren van standaard en zuivere uni-axiale rek worden getoond in deze representatieve resultaten. Fluorescerende beads worden handmatig geselecteerd in het eerste frame van de video en gevolgd van het ene frame naar het andere totdat de maximale rek in de horizontale en verticale richtingen is bereikt. Een MATLAB-script berekent automatisch de componenten van de groene rek-tensor voor elk frame en produceert een kalibratiecurve van de rek ten opzichte van de verplaatsing van de motor.In deze grafieken komen de blauwe en rode lijnen respectievelijk overeen met de component van de groene vervormde heer langs de horizontale en verticale richtingen. Deze resultaten illustreren de mogelijkheden van het biaxiaal rekplatform voor het induceren van een vervorming in het substraat langs twee orthogonale richtingen. Naast standaard uniaxiale of EQU biaxiale rekvelden kan het biaxiaal rekplatform complexe rekvelden in het substraat induceren.Paneel G laat zien dat het uitrekken van hetzelfde substraat met vier millimeter langs de x-as en een lichte rek langs de y-as van 1,5 millimeter, rood gemarkeerd, een puur uni-axiaal veld produceert zonder compressie-deformatie in het substraat. Paneel H laat zien dat het uitrekken van het substraat langs de x-as met 3,5 millimeter een deformatie van 25% en een compressie-deformatie van 7% produceert wanneer de uiteinden van het substraat langs de verticale as zijn gefixeerd, rood gemarkeerd. Dankzij de mogelijkheid om live-cell microscopie-imaging uit te voeren tijdens het uitrekken, werden de kernen gekleurd met een fluorescente live-cell kleurstof die aan het DNA bindt, waarna ze met 25% werden uitgerekt langs elke orthogonale rekas zoals hier geïllustreerd; tussen elke fase van de rekcyclus werden contrastbeelden en epi-fluorescentiebeelden van de ongedeformeerde en gedeformeerde kern verkregen. De lengtes van de grote en kleine kernas in de ongedeformeerde toestand en wanneer de kern sequentieel langs zijn grote en kleine as werd uitgerekt, werden bepaald met behulp van een ImageJ-plugin en gebruikt om de relatieve lengteverandering te berekenen.Langs elke as in deze staafgrafiek is de X-as of hoofdas in het blauw weergegeven, en de y-as of minderas in het rood. De vervormbaarheid van de kern vertoont een mechanische anisotropie, aangezien deze een aanzienlijk hogere vervormbaarheid vertoont langs de minderas in vergelijking met de hoofdas. De rol van het actine- en microtubuli-cytoskelet bij het reguleren van de nucleaire vervormbaarheid werd onderzocht door de actinefilamenten of microtubuli selectief te depolymeriseren met behulp van respectievelijk cyto D en nocodazol. Het depolymeriseren van de actinefilamenten of de microtubuli leidde tot een verlies van de anisotrope vervormbaarheid van de kern.Deze resultaten ondersteunen de bevindingen dat cytoskeletcomponenten krachten vanuit het substraat naar de nucleus overbrengen en tevens essentieel zijn voor het behoud van het natuurlijke mechanische gedrag van de nucleus. Tijdens de vervorming werd het biaxiale rekkingsplatform ook gebruikt om het effect van chronische overexpressie van heat shock protein 27 of HP 27 op de stijfheid van het vat te beoordelen. In een atherosclerose-gevoelig muismodel past een APOE-homozygoot negatieve status de histologische samenstelling van atherosclerotische laesies aan door het aantal intimale gladde spiercellen en het collageengehalte te verhogen.Om de impact van deze histologische remodellering op de mechanische eigenschappen van het vat te bepalen, werd het rekplatform gebruikt om de stijfheid van de aorta te meten. Deze grafiek toont een typische spanning-rekcurve verkregen door het rekken van een aortavat, waarbij de stijfheid wordt berekend bij een rek van 30%. De stijfheid is de helling van de raaklijn aan de curve, aangegeven door de rode lijn.Er werd vastgesteld dat de stijfheid van aortasegmenten van muizen met HSP 27-overexpressie significant was toegenomen met 41% in vergelijking met het controlemuismodel. Samen tonen de mechanische beoordeling in combinatie met de histologie van de vaten en de plaques aan dat de overexpressie van HSP 27 wordt gekenmerkt door een toegenomen vaatstijfheid en een hoger collageen- en gladdespiercelgehalte. Deze resultaten suggereren dat HSP 27 potentieel de stabiliteit van atherosclerotische laesies kan verhogen en daarmee het risico op plaque-ruptuur na de ontwikkeling ervan kan verminderen.Deze techniek biedt onderzoekers in het vakgebied van de bio-engineering een nieuwe manier om de celrespons op complexe en anisotrope mechanische vervorming te onderzoeken voor toepassingen in de mechanische biologie, maar stelt hen ook in staat om de mechanica van biologisch weefsel bij ziekten te monitoren.

a-novel-stretching-platform-for-applications-cell-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In dit protocol, tonen we de fabricage van een Microactuator reeks van verticaal verschoven berichten op de technologie gebaseerd is, en hoe deze basistechnologie kunnen worden gewijzigd om high-throughput mechanisch dynamische celkweek te voeren in zowel twee-dimensionale en drie-dimensionale cultuur paradigma's.

Microfabricated Platforms voor Mechanisch Dynamic Cel Cultuur

Er werd een nieuw beeldvormingsprotocol ontwikkeld met behulp van een op maat gemaakte motorgestuurde mechanische actuator om de meting van realtime-responsen op mechanische spanning in levende cellen mogelijk te maken. Relevant voor mechanobiologie, kan het systeem spanningen tot 20% toepassen terwijl het realtime beeldvorming met confocale of atomaire krachtmicroscopie mogelijk maakt.

Live cell imaging tijdens Mechanical Stretch

Celdifferentiatie wordt gereguleerd door een groot aantal micro-omgeving factoren, met inbegrip van zowel matrix samenstelling en de ondergrond eigenschappen. We beschrijven hier een techniek gebruikmaking cel microarrays in samenhang met trekkracht microscopie zowel celdifferentiatie en biomechanische cel- substraatinteracties als functie van de micro-omgeving context evalueren.

Een High-throughput Cell Microarray Platform voor Correlatieve Analyse van de Cel Differentiatie en trekkrachten

Hier presenteren we een op mechanica gebaseerd protocol om de gap junction connexin 43 te verstoren en de daaropvolgende impact te meten die dit heeft op endotheliale biomechanica via observatie van tracties en intercellulaire spanningen.

Perturbing endotheliale biomechanica via Connexin 43 structurele verstoring

De gepresenteerde methode omvat het uniaxiaal uitrekken van 3D zachte hydrogels ingebed in siliconenrubber terwijl live confocale microscopie mogelijk is. Karakterisering van de externe en interne hydrogelstammen en vezeluitlijning worden gedemonstreerd. Het ontwikkelde apparaat en protocol kunnen de reactie van cellen op verschillende stamregimes beoordelen.

Gecontroleerde stam van 3D-hydrogels onder live microscopiebeeldvorming

Deze studie presenteert een nieuw protocol om direct mechanische kracht uit te oefenen op de celkern door middel van magnetische microbeads die in het cytoplasma worden afgeleverd en om gelijktijdige live-cell fluorescerende beeldvorming uit te voeren.

Combinatie van 3D Magnetic Force Actuator en multifunctionele fluorescentie beeldvorming om Nucleus Mechanobiology te bestuderen

Hier wordt een methode gepresenteerd om afzonderlijke cellen mechanisch te fenotyperen met behulp van een op elektronica gebaseerd microfluïdisch platform dat mechano-node-pore sensing (mechano-NPS) wordt genoemd. Dit platform handhaaft een gematigde doorvoer van 1-10 cellen / s terwijl het zowel de elastische als viskeuze biofysische eigenschappen van cellen meet.

Mechano-Node-Pore Sensing: een snel, labelvrij platform voor multi-parameter single-cell visco-elastische metingen

Hier presenteren we een veelzijdig equibiaxiaal rekapparaat dat pneumatisch wordt bediend en compatibel is met microscopie met hoge resolutie.

Equibiaxiaal rekapparaat voor sterk vergrote live-cell confocale fluorescentiemicroscopie

Hier presenteren we een nieuw apparaat dat isotrope en uniaxiale spanningsgolfvormen op cellen toepast, terwijl het cultuur ondersteunt op substraten met instelbare stijfheid en aanpasbare eiwitmatrices. Dit eenvoudige, economische platform stelt onderzoekers in staat te onderzoeken hoe mechanische signalen de cellulaire functie reguleren in zowel fundamentele studies als ziektegerelateerde contexten.

Een nieuw platform voor in vitro cellulaire stretching en beeldvorming

Zelf-geassembleerde monolagen (SAM) gevormd uit lange keten alkaan thiolen op goud bieden goed gedefinieerde substraten voor de vorming van eiwit patronen en cel opsluiting. Microcontact printen van hexadecanethiol met behulp van een polydimethylsiloxaan (PDMS), stempel, gevolgd door opvulling met een glycol-beëindigde alkaan thiol monomeer produceert een patroon waarbij eiwitten en cellen adsorberen alleen aan de gestempelde hexadecanethiol regio.

Het creëren van twee-dimensionale Patterned Substraten voor eiwit en Cell opsluiting

Ontdek een nieuw anisotropisch rekplatform voor cel- en weefselmechanobiologie met C2C12-cellen en muizenaorta. Deze methode kwantificeert mechanische eigenschappen en celreacties op complexe biaxiale vervorming.

A Novel Stretching platform voor toepassingen in de Cel en Weefsel Mechanobiology

Meer video's verkennen