Een Low-cost methode voor het analyseren van de inbeslagneming-achtige activiteit en beweging in Drosophila
19 februari 2014
Met behulp van een webcam en een combinatie van gratis en goedkope software programma's, kan locomotief patronen in Drosophila melanogaster worden geanalyseerd om verschillen in de snelheid, afstand en tijd van de verschillende motorische activiteiten op te sporen.
Het algemene doel van deze procedure is om veranderingen in locomotorisch of epileptisch gedrag bij drosophila te identificeren. Dit wordt bereikt door de vliegen eerst met behulp van anesthesie in afzonderlijke flacons te scheiden. Vervolgens wordt een eenvoudige webcam gebruikt om de bewegingen van de vliegen op te nemen.
De gegevens worden vervolgens geïmporteerd in Image J om met de analyse te beginnen. Ten slotte wordt aangepaste fly-analysesoftware gebruikt om de afstand, snelheid en duur van de beweging tijdens de opnameperiode te bepalen. Uiteindelijk kan deze test veranderingen in locomotorisch of epileptisch gedrag tonen die geassocieerd zijn met genetische en farmacologische manipulaties.
Nu, deze goedkope opnametechniek die we gaan beschrijven, kan worden gebruikt om zowel epileptisch gedrag als activiteit in fruitvliegen te analyseren. In het bijzonder hebben we het gebruikt om genetische en farmacologische manipulaties te identificeren die het epileptisch gedrag bij deze vliegen wijzigen. Maar vandaag zal Chris Burner, een onderzoeksassistent in mijn lab, deze techniek demonstreren. Om te beginnen wordt de webcam ingesteld die de vliegen zal opnemen tijdens de locomotorische en epileptische tests.
Zodra de camera op zijn plaats staat, opent u het handige VI-softwareprogramma. Om de opname-instellingen aan te passen, selecteert u de optie time-lapse-afbeeldingen onder het tabblad vastleggen en wanneer het nieuwe venster wordt geopend, selecteert u de webcam als het vastleggingsapparaat. Voor de meeste experimenten is een videokadergrootte van zes 40 bij vier 80 voldoende. Onder de compressie-optie selecteert u de Intel IUV-codec en stelt u de seconden per frame in volgens de test.
Onder het geavanceerde tabblad maakt u voor elke opname een bitmap-afbeeldingsbestand en selecteert u een map voor het programma om de beeldstapel op te slaan nadat deze is opgenomen. Plaats vervolgens een dode vlieg op een vel papier. Klik op het vakje video-instellingen en pas onder het tabblad apparaatinstellingen de instellingen aan totdat de heldere witte achtergrond in helder contrast staat met de donkerdere vlieg.
Klik op de startknop om de opname te starten. Zodra de opnameperiode is afgelopen, klikt u op de stopknop. De beeldstapel zou nu in de geselecteerde map moeten staan om de locomotorische activiteitstest te beginnen.
Breng de vliegen over in afzonderlijke flacons met een katoenen plug. Laat de vliegen 20 tot 30 minuten ongestoord zitten voordat u verdergaat. Na deze tijd, tikt u zachtjes op de te testen vlieg uit de flacon en onder een petrischaaltjedeksel.
Het deksel moet kleine sleuven hebben om luchtstroom mogelijk te maken, plaats de vlieg onder de eerder ingestelde webcam. Wanneer u klaar bent, drukt u op start om de locomotorische activiteit te beginnen. De eerste stap van de epilepsietest is om twee dagen oude, epilepsie-gevoelige vliegen te voeren, ofwel standaard media of media gemengd met het te testen medicijn.
Na twee dagen voeren, brengt u de vliegen over door voorzichtig te tikken in afzonderlijke lege flacons en sluit de flacons met een katoenen plug. Laat de vliegen 20 minuten ongestoord zitten voordat u observeert. Wanneer u klaar bent, draait u een flacon 10 seconden op een laboratorium-vortex of met behulp van de hoogste instellingen.
Plaats onmiddellijk de geïmmobiliseerde vlieg op een wit vel papier direct onder de webcam. Eenmaal op zijn plaats, begint u met opnemen. Deze vliegactiviteit.
De vlieg zal snelle ongecoördineerde bewegingen onderbreken met perioden van verlamming. De opname wordt beëindigd zodra de vlieg zichzelf heeft rechtgetrokken. Om de gegevens te beginnen analyseren, opent u de gratis beeldverwerkingssoftware Image J. Eenmaal geopend.
Importeer de gewenste beeldstapel door eerst op het bestandstabblad te klikken en vervolgens op importeren. En tenslotte, beeldsequentie. Selecteer de map die de beeldstapel bevat en open een afbeelding.
Wanneer het dialoogvenster met sequentie-opties wordt geopend, selecteert u namen numeriek sorteren en vervolgens.OK. De beeldstapel wordt nu geladen in Image J. Selecteer vervolgens het tabblad afbeelding en stel het type waarde in op acht bits. Klik opnieuw op het tabblad afbeelding en selecteer drempel onder de aanpassingsoptie.
Dit stelt de drempel in alle afbeeldingen in, zodat elk bestaat uit een witte achtergrond met de vlieg die wordt omgezet in een zwarte stip. Dit opent ook het drempeldialoogvenster waar de afsnijpunten kunnen worden aangepast. Scan door de afbeeldingen om te zien of er extra zwarte stippen in zitten of of de stip ontbreekt.
Indien nodig, pas de drempel aan om eventuele problemen te verhelpen. Zodra de aanpassingen zijn gemaakt, selecteert u Toepassen in het drempeldialoogvenster. Wanneer het dialoogvenster om te zetten in masker wordt geopend, klikt u op OK om de beeldstapel naar een masker om te zetten.
Om de beweging van de vlieg in pixels te meten, selecteert u de multi-tracker-plug-in onder het tabblad plug-ins. Wanneer het dialoogvenster objecttracker verschijnt, klikt u op alle vier de gegeven opties en selecteert u.OK. De multi-tracker-plug-in zal vervolgens coördinaten aan het zwart toevoegen.
in elke plak en deze in het resultatenvenster vermelden, evenals de totale lengte in pixels. Het padenvenster geeft de grafische weergave van het pad dat de vlieg heeft genomen. Kopieer de X- en Y-coördinatenlijst uit het resultatenvenster en plak de gegevens in een Excel-spreadsheet.
Als er een plak in de stapel is zonder zwart. erin, zal het multi-tracker-programma bij die plak stoppen. Als dit gebeurt, stelt u de drempel opnieuw in om ervoor te zorgen dat de vlieg als zwart wordt geregistreerd.
in de plak in kwestie. Om de padlengten van pixels naar centimeters om te rekenen, neemt u een afbeelding van twee stippen op een lege witte vel papier op een bekende afstand van elkaar. Bepaal de XY-pixelcoördinaten voor de twee punten en gebruik deze informatie om het aantal pixels te bepalen dat overeenkomt met één
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie beschrijft een methode voor het analyseren van locomotorische patronen bij Drosophila melanogaster met behulp van een webcam en softwaretools. De aanpak maakt het mogelijk om verschillen in snelheid, afstand en duur van diverse motorische activiteiten te detecteren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsanalyse
- Genetica
Achtergrond
- Drosophila melanogaster is een modelorganisme in de neurowetenschappen.
- Locomotieve gedrag kan inzicht bieden in genetische en farmacologische effecten.
- Het analyseren van bewegingspatronen kan helpen bij het identificeren van gedragsveranderingen.
- Voor de analyse kunnen eenvoudige en kosteneffectieve methoden worden aangewend.
Doel van de studie
- Het identificeren van veranderingen in het locomotorisch gedrag of epileptische aanvallen bij Drosophila.
- Het gebruik van videoanalyse voor het kwantificeren van bewegingsmetrieken.
- Het beoordelen van de impact van genetische en farmacologische manipulaties op het gedrag.
Gebruikte methoden
- Vliegen worden onder narcose in individuele vials gescheiden.
- Een webcam registreert de beweging van de vliegen.
- Gegevens worden geïmporteerd in Image J voor de initiële analyse.
- Gespecialiseerde software analyseert de afstand, snelheid en duur van de beweging.
Belangrijkste resultaten
- De assay kan significante veranderingen in het locomotorische gedrag onthullen.
- Resultaten kunnen wijzen op de effecten van genetische modificaties.
- Farmacologische behandelingen kunnen worden beoordeeld via gedragsveranderingen.
- Kwantitatieve gegevens ondersteunen de analyse van motorische activiteiten.
Conclusies
- Deze methode biedt een betrouwbare manier om het locomotorisch gedrag bij Drosophila te bestuderen.
- Het kan worden gebruikt om de effecten van diverse behandelingen op het gedrag te onderzoeken.
- De aanpak is toegankelijk en kan worden aangepast aan verschillende onderzoeksbehoeften.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Kwantitatieve gedragsanalyse bij Drosophila maakt validatie van targets in een vroeg stadium en mechanische risicoreductie mogelijk voor de ontdekking van neuroactieve verbindingen en middelen voor het centrale zenuwstelsel. Deze kosteneffectieve, schaalbare assay ondersteunt snelle hypothesetesten en vergelijkingen tussen verschillende genotypen, wat het voorspellend vertrouwen bij de selectie van preklinische modellen vergroot. De toegankelijkheid ervan breidt de triage van portfolio's uit en versnelt functionele screening in translationele neurowetenschappelijke pijplijnen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek mogelijk naar genetische en farmacologische effecten op epileptische en locomotorische fenotypen.
- Ondersteunt functionele target-validatie door het kwantificeren van gedragsmatige eindpunten in ziekterelevante modellen.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie door directe meting van bewegingsparameters over verschillende genotypen en behandelingen.
- Verbetert het voorspellende vertrouwen voor de verdere ontwikkeling van neuroactieve kandidaten.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde Drosophila-modellen voor voor downstream compound-screening workflows.
- Standaardiseert de output van gedragsassays, waaronder afstand, snelheid en duur van de beweging.
- Maakt reproduceerbare, kwantitatieve beoordeling van medicamenteuze en genetische interventies mogelijk.
- Ondersteunt schaalbare, kosteneffectieve screening voor vroege evaluatie van compounds.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt gedragsmatige eindpunten van Drosophila uit met translationele biomarkerstrategieën in CNS-onderzoek.
- Zorgt voor continuïteit van genetische ontdekking naar preklinische farmacologie door fenotype aan interventie te koppelen.
- Verlaagt het risico bij beslissingen over verdere ontwikkeling door functionele resultaten in ziekterelevante systemen te kwantificeren.
- Maakt snelle iteratie en kruisvalidatie met zoogdiermodellen mogelijk wanneer dat gepast is.
Integratie van Pijplijn & Workflow
Deze assay is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot leadidentificatie en de selectie van preklinische kandidaten, in het bijzonder voor portfolio's gericht op het CZS en neuroactieve stoffen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen en de verduidelijking van signaalpaden door gedragsveranderingen na genetische of farmacologische manipulatie te kwantificeren.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor beweging en epileptische activiteit, wat een robuuste assay-gereedheid mogelijk maakt.
- Analytics: Biedt statistische metingen van afstand, snelheid en duur om experimentele condities te vergelijken.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen vroege ontdekkingsbevindingen en preklinische eindpunten die relevant zijn voor neurologische ziektemodellen.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een herbruikbaar, kostenefficiënt platform dat aanpasbaar is voor meerdere genetische achtergronden en verbindingen.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van CNS-targets.
- Operationele waarde: Standaardiseert en schaalt gedragsassays met een minimale investering in infrastructuur.
- Strategische waarde: Maakt beter geïnformeerde go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiënt portfoliomanagement mogelijk.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering en verdere ontwikkeling van neuroactieve kandidaten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in het omgaan met Drosophila en het ontwerp van gedragstesten.
- Basale beeldvormingsapparatuur (webcam) en toegang tot gratis/open-source analysesoftware zijn nodig.
- Standaardisatie van testcondities en data-analyseprotocollen tussen teams is vereist.
- Aanpasbaar aan diverse Drosophila-genotypen en farmacologische interventies.
- Resultaten kunnen worden beïnvloed door anesthesie voorafgaand aan de test, wat zorgvuldige procedurele controles noodzakelijk maakt.
