Cryo-elektron microscopie Specimen Voorbereiding door middel van een Focused Ion Beam

Het algemene doel van deze procedure is om een monster voor cryo TEM voor te bereiden door een gefocuste ionenbundel lamel uit een cryogenetisch bevroren bulkmonster te extraheren. Dit wordt bereikt door eerst het monster in vloeibare stikstof te plonsen, in te vriezen en het in de cryo gefocuste ionenbundel SEM te monteren. De tweede stap is om met de ionenbundel een dunne LA Melo uit te snijden en deze over te brengen naar een TEM raster door middel van een gekoelde nano manipulator.

Vervolgens wordt het TEM raster overgebracht van de SEM houder naar de TEM houder in een overdrachtsstation. De laatste stap is het overbrengen van de TEM houder naar de cryo TEM voor verdere analyse. Uiteindelijk wordt de cryo TEM gebruikt om hoge resolutiebeelden, tomo Grahams of röntgenkaarten van de geëxtraheerde lamel te tonen.

Deze techniek stelt ons in staat om zachte materie met uiteindelijke resolutie in de transmissie-elektronenmicroscoop te analyseren door de plaats van analyse vooraf te selecteren door andere microscopieën zoals lichtmicroscopie of scannende elektronenmicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals Mac cryo Microtomie, is dat voorbereidingsartefacten zoals compressie en def formatie van het monster worden vermeden. Monteer eerst twee TEM rasters voor gefocuste ionenbundel monsters.

Op de SEM overdrachtshouders bevestigt u de rasters door de bijbehorende schroeven met een schroevendraaier vast te draaien en sluit de luiken. Monteer een monsterstub die geschikt is voor het specimen en voeg een portie van het specimen toe. Gebruik bijvoorbeeld een pipette om druppels op een vlakke stub te deponeren. Monteer vervolgens de SEM overdrachtshouders op het vacuüm overdrachtsapparaat of VTD.

Nadat u vloeibare stikstof in de slushing station hebt toegevoegd en erop gepompt, opent u de station en plonst u het SEM overdrachtshouders in vloeibare stikstof. Pomp vervolgens opnieuw totdat het koken voltooid is en de slush opnieuw verkregen is. Trek vervolgens de SEM overdrachtshouders terug in de vacuümkamer van de VTD en sluit deze. Ventileer de slushing station en de cryo voorbereidingskamer. Ventileer de buitenste luchtsluis.

Vervolgens brengt u het VTD-seal in overeenstemming met de luchtsluis van de cryo voorbereidingskamer en pompt u. Wanneer een goed vacuümniveau is bereikt, meet u de luchtsluispimp om de seal van de VTD en de buitenste luchtsluis te openen. Plaats vervolgens de SEM overdrachtshouders.

Gebruik vervolgens een koud mes om de beschermende deksels van de TEM rasterslots te openen. Schakel de hoge spanning op de gefocuste ionenbundel SEM uit en open de binnenluchtsluis. Gebruik vervolgens de VTD om de SEM houder in de monsterkamer over te brengen.

Zodra de SEM houder in de koude fase is, ontkoppelt u de VTD door te duwen en te draaien. Trek de VTD-stang helemaal terug in de vacuümkamer van de VTD en sluit de binnenluchtsluis, de buitenluchtsluis en de VTD-seal. Op dit punt verwarmt u het precursorgas tot 24 tot 26 graden Celsius en plaatst u het gasinjectiesysteem of GIS-naald op een hoogte van ongeveer één millimeter boven het monstersoppervlak.

Tijdens het beeldvormen met de elektronenbundel opent u het gasklepje gedurende enkele seconden. Behandel vervolgens het depositum boven het gebied van belang, of ROI, door een ionenbundel van 1000 picoampere bij lage vergroting te gebruiken. Na het behandelen, kantel het monster naar 52 graden zodat het oppervlak loodrecht op de ionenbundel staat.

Frees weg. Twee terroristengroeven. Aan weerszijden van de ROI kantel het monster terug naar nul graden en gebruik de ionenbundel om de zijden en onderkant van de lamel weg te snijden, ervoor zorgen dat de snedemerken door de hele lamel gaan.

Zodra de GIS-naald is ingebracht, manoeuvreert u de nano manipulator totdat de punt in fysiek contact staat met de lamel, bij voorkeur aan de zijkant. Open het GIS-klepje gedurende enkele seconden en bewaak de cryo-depositie door continue beeldvorming met de elektronenbundel. Wanneer er een extra laagje van één tot twee micrometer platina is gecryo-gedeponeerd, sluit u het klepje en behandel vervolgens het platina alleen in de paar micrometer rond het punt waar de nano manipulator in contact staat met de lamel.

Gebruik vervolgens een hoge ionenbundelstroom om de lamel los te snijden. Manoeuvreer voorzichtig met de nano manipulator om de lamel uit de groeven te extraheren en beweeg deze minimaal 500 micrometer boven het monstersoppervlak. Nadat de naald is ingetrokken, laat u de monsterstandaard een paar millimeter zakken en beweegt u deze totdat een van de TEM rasters zichtbaar is.

Beweeg het bevestigingsgebied op het raster naar de werkpositie en steek de GIS-naald in. Vervolgens manoeuvreert u voorzichtig met de nano manipulator om de bevestigde lamel in fysiek contact te brengen met het bevestigingsgebied op het TEM raster, opent u het gasklepje gedurende enkele seconden en cryo-deponeert u een extra laagje van één tot twee micrometer platina. Behandel vervolgens het platina alleen in een paar micrometer rond het contactpunt tussen de lamel en het TEM raster. Gebruik vervolgens een hoge ionenbundelstroom om de lamel los te snijden van de nano manipulator.

Kantelt het monster naar 52 graden en gebruik de ionenbundel om het tot elektronentransparantie te verdunnen. Nadat u de cryo overdrachtsstation met droge stikstofgas hebt gespoeld, plaatst u de cryo overdracht TEM houder in de juiste sleuf van de cryo overdrachtsstation en vult u deze met vloeibare stikstof. Immers een schroevendraaier, het TEM monsterstandaardklemgereedschap en pincetten in een cryogene cup gevuld met vloeibare stikstof om hun punten af te koelen tot de gewenste temperatuur.

Zodra de VTD is gekoppeld aan de buitenste luchtsluis, brengt u de koude fase naar de overdrachtshoogte van 16 millimeter. Na het uitzetten van de hoge spanning, opent u de VTD-seal, de buitenste luchtsluis en de binnenluchtsluis. Gebruik vervolgens de VTD-stang om in de SEM overdrachtshouders te vergrendelen door te duwen en met de klok me