In vitro methode om E-selectine-gemedieerde interacties tussen Prostaat circulerende tumorcellen afkomstig van patiënten en humane endotheelcellen Observeer

Het algemene doel van deze procedure is om de interacties tussen zeldzame prostaatkankercellen en e selectine-expresserende endotheelcellen te onderzoeken met behulp van een microglijderflow-assemblage. Dit wordt bereikt door eerst een microglijder te coaten met fibronectine. De tweede stap is het kweken van humane navelstrengvene-endotheelcellen of VE in een dynamisch flow-systeem op een microglijder met een kleine kanaalbreedte.

Vervolgens worden de prostaatkankercellen gelabeld met een anti prostaat specifiek membraaneiwit of PSMA gehumaniseerde monoklonale antistof, die geïnternaliseerd raakt. De laatste stap is om de anti PSMA gelabelde prostaatkankercellen over de e selectine-expresserende VE te perfunderen. Uiteindelijk wordt videomicroscopie gebruikt om de interacties tussen prostaatkankercellen en de endotheelcellen te tonen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals parallel plate flow chamber en andere dynamische assemblages, is dat u met deze techniek de interacties tussen zeldzame prostaatkankercellen, zoals circulerende tumorcellen en gekweekte endotheelcellen in een dynamisch flow-systeem kunt onderzoeken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van metastase, zoals hoe metastaseren prostaattumorcellen door het bloedvatensysteem? Gebruiken ze hetzelfde mechanisme als leukocyten tijdens hun ion?

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze techniek worstelen omdat het het kweken van een monolaag endotheelcellen in een smalle kanaal onder perfusie onder de weefselkweekkap betreft. Eerst spoelt u de microglijder af met fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS. Bedek vervolgens de microglijder voorzichtig met 200 microliter van 50 microgram per milliliter fibronectine met behulp van een spuit met een ene milliliter lure lock-slang.

Dek de microglijder af met de deksel en houd deze 30 minuten in de weefselkweekkap. Perfundeer vervolgens 200 microliter warm qve-groeimedium over de microglijder en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Langzaam doseren van de vloeistof in de microglijder voorkomt het ontstaan van bellen in het kanaal.

Tijdens de perfusie bereidt u de vex-suspensie voor door vex te spoelen met PBS en 0,1% collagenase plus 0,05% EDTA in PBS gedurende één tot twee minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer de hve in twee milliliter groeimedium bij 180 keer G gedurende vijf minuten. Meet vervolgens de celconcentratie met behulp van een hemo cytometer en bereid 10 miljoen cellen per 100 microliter groeimedium voor.

Verwijder vervolgens voorzichtig het medium van de inlaat van de microglijder. Gebruik een 200 microliter pipettepunt, breng de microglijder naar het oogniveau en perfundeer voorzichtig 200 microliter van de bereide concentratie vex in het kanaal met behulp van een spuit met een ene milliliter lure lock-slang. Wees voorzichtig bij deze stap om het ontstaan van bellen te voorkomen. Als er bellen verschijnen, blijf perfunderen voor een iets langere tijd totdat de bellen het uitlaatkanaal binnenkomen.

Pipet vervolgens een gelijk volume van ongeveer 80 microliter VE-medium in zowel de inlaat als de uitlaat van de microglijder. Dit voorkomt dat cellen in beide richtingen stromen. Bedek de glijder en houd deze 1,5 uur in een incubator van 37 graden Celsius.

Om de flowkamer te beginnen, plaatst u een steriele 20 milliliter spuit, vrouwelijke en mannelijke lure connectors, een spuitpomp en slang in de incubator gedurende 15 minuten voor een minimale dode ruimte. Gebruik slang met een binnendiameter van 0,04 inch. Kleinere slangdiameter voorkomt het ontstaan van bellen.

Vervolgens vult u de 20 milliliter spuit met 12 milliliter warm VE-groeimedium. Verwijder de bel uit de spuit volledig. Vul de inlaat van de microglijder met VE-medium.

Verbind deze assemblage met de microglijder. Bevestig voorzichtig de uitlaatconnector aan de microglijder. Breng de opstelling naar de incubator en verbind deze met de spuitpomp.

Stel vervolgens de pomp in op een schuifsnelheid van 10 microliter per minuut voordat u de cellen overnacht in de incubator bij 37 graden Celsius laat staan. Demonteer de volgende dag de opstelling door de connector die aan de inlaat van de microglijder is bevestigd te verwijderen. Verwijder vervolgens de uitlaatconnector twee tot om de e selectine-expressie op endotheelcellen te upreguleren.

Bereid vers groeimedium voor met interleukine een bèta. Zuig het medium in een 10 milliliter spuit. Verwijder het overgebleven medium van de inlaat van de glijder en voeg vers medium toe dat de inlaat volledig vult.

Verbind de spuit met de glijder. Stel de spuitpomp in op een schuifsnelheid van 10 microliter per minuut gedurende vier uur in de incubator tijdens interleukine een bèta-incubatie van vex, bereid anti PSMA Alexa 4 88 antilichaam gelabelde prostaatkankercellen. Voeg eerst 0,05% trypsin EDTA toe aan de MDA prostaatkankercellen gedurende één minuut.

Stel de cellen niet langer bloot aan trypsin, omdat dit de glycopeptiden op het celoppervlak kan beïnvloeden. Centrifugeer de cellen bij 200 keer G gedurende vijf minuten. Resuspenseer vervolgens het MDA-celpalet in één milliliter Hanks Buffer en voeg het anti PSMA-antilichaam toe. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een donkere plaats en resuspensieer de cellen tijdens de incubatie.

Centrifugeer de celoplossing na 30 minuten bij 800 keer G gedurende vijf minuten. Zuig af en resuspenseer het pellet in één milliliter Hanks buffer. Tel de gelabelde MDA-cellen en breng de uiteindelijke concentratie tot 1 miljoen cellen per milliliter.

Vul een vijf milliliter spuit met de gelabelde MDA-cellen en verwijder de bellen. Schakel de omgekeerde microscoop in en stel de curlerverlichting in op 10 x objectief. Breng de spuitpomp op hetzelfde niveau als de monsterstandaard van de microscoop en stel deze in op een dime per centimeter vierkante schuifspanning.