In vitro methode om E-selectine-gemedieerde interacties tussen Prostaat circulerende tumorcellen afkomstig van patiënten en humane endotheelcellen Observeer

Het algemene doel van deze procedure is om de interacties tussen zeldzame prostaatkankercellen en E-selectine-expresserende endotheelcellen te onderzoeken met behulp van een micro-slide flow-assemblage. Dit wordt bereikt door eerst een micro-slide te coaten met fibronectine. De tweede stap is het kweken van menselijke navelstrengendotheelcellen of VE in een dynamisch flowsysteem op een micro-slide met een kleine kanaalbreedte.

Vervolgens worden de prostaatkankercellen gelabeld met een gehumaniseerd monoklonaal antilichaam tegen het prostaatspecifieke membraanantigeen of PSMA, dat vervolgens geïnternaliseerd wordt. De laatste stap is het perfunderen van de met anti-PSMA gelabelde prostaatkankercellen over de E-selectine-expresserende VE. Ten slotte wordt videomicroscopie gebruikt om de interacties tussen de prostaatkankercellen en de endotheelcellen aan te tonen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de parallelle plaatstroomkamer en andere dynamische assemblages, is dat u met deze techniek de interacties tussen zeldzame prostaatkankercellen, zoals circulerende tumorcellen en gekweekte endotheelcellen in een dynamisch stroomsysteem, kunt onderzoeken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van metastase, zoals: hoe metastaseren prostaattumorcellen via het bloedvatenstelsel? Gebruiken zij hetzelfde mechanisme als dat door leukocyten wordt gebruikt tijdens hun extravasatie?

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze techniek moeite hebben, omdat het betrekking heeft op het kweken van een monolaag endotheelcellen in een smal kanaal onder perfusie in de weefselkweekkap. Spoel eerst de microslide met fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS. Coat daarna de microslide voorzichtig met 200 µL fibronectine van 50 µg/mL met behulp van een lure-lockspuit van 1 mL.

Dek het microdiaal af met het deksel en bewaar het gedurende 30 minuten in de weefselkweekkap. Perfuseer vervolgens 200 microliters warm qve-groeimedium over het microdiaal en incubeer dit gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Langzaam toevoegen van de vloeistof in het microdiaal voorkomt belvorming in het kanaal.

Bereid tijdens de perfusie de vex-suspensie voor door de vex te spoelen met PBS en 0,1% collagenase plus 0,05% EDTA in PBS toe te voegen gedurende één tot twee minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer de hve in twee milliliters groeimedium bij 180 ×g gedurende vijf minuten. Meet vervolgens de celconcentratie met een hemocytometer en bereid 10 miljoen cellen per 100 µL groeimedium.

Verwijder vervolgens voorzichtig het medium uit de inlaat van de microdia. Breng de microdia op ooghoogte en gebruik een 200 µL pipetpunt en een 1 mL lure-lock spuit om voorzichtig 200 µL van de bereide concentratie vex in het kanaal te perfunderen. Voorzichtigheid is bij deze stap vereist om belvorming te voorkomen; als er bellen verschijnen, blijf dan iets langer perfunderen totdat de bellen het uitlaatkanaal bereiken.

Pipette vervolgens een gelijk volume van ongeveer 80 µL VE-medium in zowel de inlaat als de uitlaat van de microslide. Dit voorkomt de stroom van cellen in beide richtingen. Dek de slide af en bewaar deze gedurende 1,5 uur in een incubator op 37 °C.

Om te beginnen met de assemblage van de stroomkamer, plaatst u een steriele spuit van 20 milliliter, vrouwelijke en mannelijke luer-connectoren, een spuitenpomp en slangen gedurende 15 minuten in de incubator om het dode volume te minimaliseren. Gebruik slangen met een binnendiameter van 0,04 inches. Een kleinere slangdiameter voorkomt belvorming.

Vul vervolgens de spuit van 20 milliliter met 12 milliliter warm VE-medium. Verwijder de luchtbel volledig uit de spuit. Vul de inlaat van de micro-slide met VE-medium.

Verbind deze assemblage met de micro-dia. Bevestig de uitlaatconnector voorzichtig aan de micro-dia. Plaats de opstelling in de incubator en sluit deze aan op de spuitenpomp.

Stel de pomp vervolgens in op een afschuifsnelheid van 10 µL per minuut voordat de cellen een nacht in de incubator bij 37 °C worden gelaten. Demonteer de volgende dag de opstelling door de connector aan de inlaat van de micro-slide te verwijderen. Verwijder daarna de uitlaatconnector om de expressie van E-selectine op endotheelcellen te upreguleren.

Bereid vers groeimedium voor dat interleukine one beta bevat. Zuig het medium op in een spuit van 10 milliliter. Verwijder het resterende medium uit de inlaat van het objectglas en voeg vervolgens vers medium toe zodat de inlaat volledig is gevuld.

Verbind de spuit met het objectglas. Stel de spuitpomp in op een afschuifsnelheid van 10 µL per minuut gedurende vier uur in de incubator tijdens de incubatie van vex met interleukine one beta; bereid prostatekankercellen voor die gelabeld zijn met anti-PSMA Alexa 488-antilichamen. Voeg eerst 0,05%trypsine EDTA toe aan de MDA-prostatekankercellen gedurende één minuut.

Stel de cellen niet gedurende langere tijd bloot aan trypsine, omdat dit de glycopeptiden op het celoppervlak kan beïnvloeden. Centrifugeer de cellen bij 200 ×g gedurende vijf minuten. Resuspendeer vervolgens het MDA-celpellet in één milliliter Hank's Buffer en voeg het anti-PSMA-antilichaam toe; incubeer dit gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een donkere plaats, waarbij de cellen tijdens de incubatie telkens worden geresuspendeerd.

Centrifugeer de celoplossing na 30 minuten gedurende vijf minuten bij 800 ×g. Aspireer het supernatant en resuspendeer de pellet in één milliliter Hank's buffer. Tel de gelabelde MDA-cellen en breng de uiteindelijke concentratie op 1 miljoen cellen per milliliter.

Vul een spuit van vijf milliliter met de gelabelde MDA-cellen en verwijder de luchtbellen. Zet de omgekeerde microscoop aan en stel de belichting in bij een 10 x objectief. Plaats de spuitenpomp op dezelfde hoogte als de objecttafel van de microscoop en stel deze in op een schuifspanning van één dime per vierkante centimeter.

Open vervolgens de Zeiss Axio vision-software. Selecteer het objectief op het computerscherm. Maak een nieuwe map aan onder de optie tools in de software.

Open de optie smart experiments in Axio vision en pas de instellingen aan om gedurende 30 minuten korte video's van 32 seconden op te nemen. Stel voor live fluorescentievideo de beeldopties in. Deze parameters helpen om video's te verkrijgen die dicht bij de videoframerate van de Zeiss MRM-camera liggen om de volledige breedte van het stroomkanaal met een 10x objectief op het computerscherm te visualiseren; gebruik hiervoor een CM-montageadapter. Schakel de kwiklamp in voordat u de spuit en de connector met de cellen op de spuitenpomp plaatst. Bevestig vervolgens de connector aan het gevulde inlaatkanaal van de microdia die interleukin one beta gestimuleerde ax bevat.

Verbind het uitlaatkanaal met de connector die aan de slang is bevestigd. Plaats de slang in een schaaltje of een conische buis van 15 milliliter om de doorstroom op te vangen. Start de infusie door de micro-slide met 10 microliters per minuut.

Observeer de interacties tussen endotheelcellen en gelabelde MDA-cellen of gelabelde CTC's afgeleid van patiënten onder 488 nanometer. Filter op de epifluorescentiemicroscoop. Start de opname van het experiment als 32 korte video's.

Meet tijdens de analyse van de opname de rolsnelheid. De rolsnelheid wordt gemeten door de door de cellen afgelegde afstand te delen door de tijd. Hier wordt een overnight-cultuur van een monolayer endotheelcellen getoond.

Op het microscopische objectglas. De schaalverdelingen tonen aan dat 100% van het objectglas zichtbaar is bij gebruik van een 5x objectief, terwijl 70% zichtbaar is bij gebruik van een 10x objectief; voor geselecteerde gemedieerde interacties worden rollende cellen aan de randen niet meegerekend, waardoor meer dan 70% van het objectglas beschikbaar is voor videoregistratie en playback-analyse. De boxplot toont de distributie van de rol-snelheden van zowel ongelabelde als anti-PSMA-gelabelde MDA-cellen op interleukine-1β-gestimuleerde endotheelcellen onder verschillende afschuifspanningscondities.

Er werd geen significant verschil waargenomen in de rol-snelheden bij 1 en 5 dynes per vierkante centimeter bij een hogere schuifspanning van 10 dynes per vierkante centimeter. Een statistisch significant verschil werd waargenomen tussen de rol-snelheden van ongelabelde en anti-PSMA-gelabelde MDA-cellen. Een time-stitched video, opgenomen met bloed van een prostaatkankerpatiënt, laat drie soorten interacties zien tussen gelabelde prostaat-CTC's en lectine-expresserende endotheelcellen: tethering, waarbij CTC's hechten en opnieuw hechten; stabiele adhesie, waarbij CTC's zelfs na 30 seconden niet loslieten; en geen interacties, waarbij niet-interagerende CTC's het gezichtsveld binnenkomen. Micro-slides kunnen eenvoudig worden geimmunokleurd en fluorescent worden afgebeeld om de stevige adhesie van anti-PSMA-gelabelde MDA-cellen aan te tonen.

Hier zijn endotheliale cellen te zien na perfusie over met interleukine one beta gestimuleerde endotheliale cellen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de interacties tussen zeldzame cellen, zoals circulerende prostaattumorcellen en S-selectine-expresserende endotheliale cellen, kunt onderzoeken volgens deze procedure. Andere methoden, zoals immunofluorescentie, kunnen ook worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de aanwezigheid van S-selectine-liganden.

Technieken zoals deze kunnen onderzoekers helpen om de verschillende stappen die betrokken zijn bij metastasering te begrijpen.