Molecular Profiling van de invasieve tumor micro in een 3-dimensionaal model van colorectale kanker cellen en

Het algemene doel van deze procedure is het karakteriseren van de specifieke biologie op de interface tussen maligne epitheelcellen aan het invasieve tumorfront en kankerassocieerde stromale cellen. Dit wordt bereikt door eerst primaire fibroblastculturen op te zetten uit colonimplantaten. De tweede stap is het construeren van organotypische co-cultuurmodellen met behulp van primaire colonfibroblasten en gecultiveerde colorectale kankercellen.

Vervolgens worden de organotypische modellen gefixeerd in formaline, gesneden op membraan-gemonteerde objectglazen en gekleurd met kristalviolet. De laatste stap is laser-microdissectie om binnendringende tumorcellen te scheiden van niet-binnendringende tumorcellen en kanker-geassocieerde stromale cellen. Uiteindelijk kunnen moleculaire profileringstechnieken worden gebruikt om de biologie van binnendringende en niet-binnendringende tumorcellen en stromale cellen in de omringende tumormicro-omgeving te karakteriseren.

We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we beseften hoe duidelijk binnendringende cellen te onderscheiden zijn van niet-binnendringende cellen in driedimensionale organotypische co-culturemodellen van colorectale kanker. Begin met het verkrijgen van monsters van normaal menselijk colonmucosa-weefsel rechtstreeks vanuit de operatiekamer in het laboratorium. Plaats een monster in het midden van een weefselkweekschaal van 10 centimeter en was de cultuur vervolgens drie keer met fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS aangevuld met penicilline, streptomycine en fungi zone.

Aspireer niet na de laatste wasbeurt; snijd het weefsel met steriele pincetten en een scalpel in kleine stukjes. Plaats vervolgens elk stukje in het midden van een kruis dat met het scalpelmes is getrokken. Beweeg de scalpel in een 12-wells plaat voorzichtig over het weefsel om de aanhechting aan de kweekplaat te bevorderen.

Plaats de monsters in 750 µL primair fibroblastengroeimedium, waarbij het weefsel volledig ondergedompeld moet zijn zonder dat het kan drijven. Plaats de monsters vervolgens gedurende de volgende vijf dagen in een incubator bij 37 °C en 5 tot 10% CO2. Na ongeveer zeven dagen zullen de fibroblasten langzaam vanuit de rand van het weefsel uitgroeien.

Dit zal na ongeveer drie tot vier weken duidelijker zichtbaar zijn. Wanneer er voldoende fibroblasten zijn uitgegroeid, voegt u 750 µL trypsine toe aan elke put nadat de cellen zijn losgekomen; voeg deze samen en breng ze over naar een T 25 weefkweekfles voor de fibroblast-geïmpregneerde organotypische gel. Bereid eerst een fibroblastcellesuspensie voor met 500.000 cellen per gel in aangevuld dmm.

Bereid de organotypische gels op ijs in de verhoudingen die in het tekstprotocol staan vermeld voor negen gels van één milliliter per gel. Bereid 10 milliliters en meng voorzichtig om luchtbellen te voorkomen. Voeg vervolgens één milliliter toe aan elke put van een 24-wells plaat en incubeer gedurende één uur bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer.

Voeg, nadat de gels één uur hebben kunnen stollen, één milliliter aangevuld DMEM bovenop de gels toe en plaats deze overnacht terug in de incubator. De volgende dag wordt het medium van bovenaf van de gels geaspireerd en wordt één milliliter medium met 500.000 colorectale kankerepitheelcellen op de met gel gecoate nylon vellen geplaatst.

Bereid vooraf steriele geautoclaveerde nylonvellen van 1,5 centimeter bij 1,5 centimeter voor met behulp van een steriele pincet. Plaats het benodigde aantal nylonvellen in een kweekschaal van 10 centimeter. Bereid het gelmengsel op ijs voor zoals beschreven in het tekstprotocol en voeg 0,1 molair natriumhydroxide toe aan het gelmengsel totdat het roze kleurt, wat aangeeft dat de oplossing is geneutraliseerd.

Voeg vervolgens 250 µL van deze oplossing toe aan elk nylonvel. Incubeer daarna 30 minuten bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 om de gel te laten stollen. Voeg vervolgens 10 mL van een 1% glutaraldehyde-oplossing in PBS toe aan elke cultuurschaal van 10 cm.

Zodra de gel is gestold, wordt deze gedurende één uur bij vier graden Celsius geïncubeerd, waarna de nylon vellen drie keer worden gewassen in PBS en één keer in aangevuld dme. Incubeer de vellen vervolgens een nacht in dezelfde buffer bij vier graden Celsius om de organotypische gels over te brengen op steriele stalen scaffolds voor invasie, die zijn geprepareerd door roestvrijstalen vellen in een driepootvorm te vouwen. Gebruik vervolgens een met ethanol gesteriliseerde pincet om in elke put van een zes-putjesplaat een stalen grid te plaatsen.

Plaats een gel-gecoat nylon vel met de collageenzijde naar boven op elk rooster. Draag de organotypische gels voorzichtig over van de 24-wells plaat naar het verhoogde nylon vel met behulp van een spatel, gesteriliseerd met ethanol. Vul de well met gesupplementeerd D mem totdat het nylon vel in contact is met het medium, maar niet ondergedompeld is.

Zorg ervoor dat het medium de organotypische gel niet raakt. Incubeer gedurende 14 dagen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5%CO2. Vervang het medium elke twee dagen.

Verwijder het volledige organotypische preparaat inclusief de nylonfolie uit het welletje en plaats dit op vershoudfolie. Halveer het organotypische preparaat en de nylonfolie met een schoon wegwerpscalpel en fixeer beide helften gedurende 24 uur in formaldehyde. Vervang na 24 uur de formaldehyde bij kamertemperatuur door 70% ethanol en laat dit een nacht staan voorafgaand aan het inbedden in paraffine, het snijden en het kleuren voor het uitvoeren van laser-microdissectie.

Eerst de organotypische coupes tot een dikte van 10 micron op membraanmontage-objectglazen. Na het behandelen van de coupes zoals beschreven in het tekstprotocol, bereid de laser-microdissectie voor met behulp van het gekozen platform. Plaats het objectglas met de gekleurde coupe die gemicrodissecteerd moet worden.

Plaats een microcentrifugebuis van 0,5 milliliter met de dop naar beneden in de opvangkas op de microscooptafel en voeg 50 microliters cellysebuffer toe aan de dop waarin het gemicrodissecteerde weefsel onder direct zicht zal worden opgevangen. Gebruik de joystick om het weefsel van belang te identificeren en annoteer via de software-interface de gekleurde organische sectie, waarbij de cellen die gemicrodissecteerd moeten worden bij het tumorinvasiefront worden gemarkeerd. Activeer de laser om de gemarkeerde sectie uit te snijden en het gemicrodissecteerde weefsel in de dop van de microcentrifugebuis te stuwen.

Ga verder met het verwerken van de monsters via een geschikte methode om de gewenste analyt te extraheren. Hier worden laser-microdissectiebeelden getoond van SW 480 colorectale kankercellen die het organotypische stroma invallen. Kristalviolet wordt gebruikt om de epitheelcellen van de colorectale kanker te markeren.

De invasieve tumoreilanden worden vervolgens gedefinieerd voordat de laserdissectie plaatsvindt en het uitgesneden fragment wordt getransporteerd naar een opvangapparaat. Niet-invaderende cellen en stromale cellen worden met dezelfde methodiek geïdentificeerd en geïsoleerd. De driedimensionale coculturen werden geanalyseerd middels micro-RNA-profilering om differentieel tot expressie gekomen micro-RNA's te vergelijken tussen cellen aan het invasieve tumorfront en cellen in de gestratificeerde tumorzones.

De gegevens werden gesorteerd op basis van de totale verandering en datawaarden van plus of min tweevoud. Veranderingen uit een representatief experiment worden gepresenteerd, waarbij de differentiële micro-RNA-genexpressie tussen de cellen van de invasieve marge en de cellen van de niet-invasieve marge wordt getoond. Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u anatomisch passende organotypische modellen construeert en hoe u laser-microdissectie gebruikt om individuele celpopulaties te isoleren voor verder onderzoek. Whoa.