Molecular Profiling van de invasieve tumor micro in een 3-dimensionaal model van colorectale kanker cellen en Ex vivo Fibroblasts
29 april 2014
Moleculaire profilering van laser gemicrodissecteerde cellen en stroma van synthetische, weefselengineering darmkanker modellen vertegenwoordigt een nieuwe benadering en manipuleerbaar te karakteriseren en ontleden de kenmerkende biologie op het grensvlak tussen tumorcellen aan de voorzijde en invasieve kanker geassocieerd stromacellen.
Het algemene doel van deze procedure is om de unieke biologie te karakteriseren op de grens tussen kwaadaardige epitheelcellen aan de invasieve tumorfront en kanker geassocieerde stromale cellen. Dit wordt bereikt door eerst primaire fibroblastculturen van colonische implantaten te vestigen. De tweede stap is om organotypische co-cultuurmodellen te construeren met primaire colonische fibroblasten en gekweekte colorectale kankercellen.
Vervolgens worden organotypische modellen gefixeerd in formin gesneden op op membraan gemonteerde slides en gekleurd met crestal violet. De laatste stap is laser microdissectie om invasieve tumorcellen te scheiden van niet-invasieve tumorcellen en kanker geassocieerde stromale cellen. Uiteindelijk kunnen moleculaire profileringstechnieken worden gebruikt om de biologie van invasieve en niet-invasieve tumorcellen en stromale cellen in de omringende tumormicro-omgeving te karakteriseren.
We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we ontdekten hoe duidelijk invasieve cellen te onderscheiden zijn van niet-invasieve cellen in driedimensionale organotypische co-cultuurmodellen van colorectale kanker. Om te beginnen, verkrijg monsters van normaal menselijk colon mucosaweefsel rechtstreeks uit de operatiekamer in het laboratorium. Plaats een monster in het midden van een 10 centimeter weefselkweekbakje, was vervolgens de cultuur drie keer met fosfaat gebufferd zout water of PBS aangevuld met penicilline, streptomycine en fungi zone.
Aspibeer niet na de laatste wasbeurt met steriele forceps en scalpel, snijd het weefsel in kleine stukken. Plaats vervolgens elk stuk op het midden van een kruis getekend met het scalpelblad. In een 12-wellplaat schudden de scalpel voorzichtig over het weefsel om het te laten hechten aan de cultuur.
De monsters in 750 microliters van primaire fibroblast groeimedia, die het weefsel onder water moeten zetten zonder het te laten zweven. Plaats vervolgens de monsters in een 37 graden Celsius, vijf tot 10%CO2 incubator gedurende de volgende vijf dagen. Fibroblasten zullen langzaam beginnen te groeien vanaf de rand van het weefsel na ongeveer zeven dagen.
Dit zal zichtbaarder zijn na ongeveer drie tot vier weken. En als er voldoende fibroblasten groeien, voeg dan 750 microliters trypsin toe aan elke put nadat de cellen zijn losgelaten en pool en breng ze over naar een T 25 weefselkweekkolf voor het fibroblast geïmpregneerde organotypische gel. Bereid eerst een fibroblastcellensuspensie met 500.000 cellen per gel in aangevuld dmm.
Maak de organotypische gels op ijs in de verhoudingen gevonden in het tekstprotocol voor negen gels op één milliliter per gel. Bereid 10 milliliter voor en meng voorzichtig om luchtbellen te voorkomen. Voeg vervolgens één milliliter toe aan elke put van een 24 Well plate en incubeer één uur bij 37 graden Celsius in een bevochtigde atmosfeer.
Om de gels na één uur te laten uitharden, voeg één milliliter aangevuld DM EM toe bovenop de gels en plaats ze terug in de incubator voor een nacht. De volgende dag. Aspibeer medium van de bovenkant van de gels en bedek één milliliter medium met 500.000 colorectale kanker epitheelcellen voor de gel gecoate nylon sheets.
Bereid steriele autoclaaf nylon sheets van 1,5 centimeter bij 1,5 centimeter van tevoren met behulp van steriele forceps. Plaats het vereiste aantal nylon sheets in een 10 centimeter kweekbakje. Bereid het gelmengsel op ijs zoals beschreven in het tekstprotocol en voeg 0,1 molair natriumhydroxide toe aan het gelmengsel totdat het roze wordt, wat aangeeft dat de oplossing is geneutraliseerd.
Voeg vervolgens 250 microliters van deze oplossing toe aan elk nylon sheet. Incubeer vervolgens bij 37 graden Celsius in een bevochtigde atmosfeer van 5%CO2 gedurende 30 minuten om het gel te laten uitharden. Voeg vervolgens 10 milliliter van een 1%glutaraldehyde oplossing in PBS toe aan elk 10 centimeter kweekbakje.
Zodra het gel is uitgehard, incubeer het bij vier graden Celsius gedurende één uur, was de nylon sheets vervolgens drie keer in PBS en eenmaal in aangevuld dme. Incubeer de sheets een nacht in dezelfde buffer bij vier graden Celsius om de organotypische gels op stalen roosters te brengen voor invasie, gesteriliseerde roosters die zijn voorbereid door roestvrijstalen platen te vouwen tot een staande driepootvorm. Gebruik vervolgens forceps, gesteriliseerd en ethanol om een stalen rooster in elk putje van een zes-wellplaat te plaatsen.
Plaats een gel gecoat nylon sheet met de collageenzijde omhoog op elk rooster. Draag de organotypische gels voorzichtig van de 24 well plate over naar het verhoogde nylon sheet met behulp van een spatel, gesteriliseerd en ethanol. Vul de put met aangevuld D mem totdat het nylon sheet in contact is met het medium maar niet ondergedompeld is.
Zorg ervoor dat het medium het organotypische gel niet raakt. Incubeer gedurende 14 dagen bij 37 graden Celsius in een bevochtigde atmosfeer van 5%CO2. Vervang het medium om de twee dagen.
Verwijder het hele organotypische inclusief nylon sheet uit de put en plaats het op klevend film. Snijd het organotypische en nylon sheet doormidden met behulp van een schone wegwerp scalpel en fixeer beide helften in formaldehyde gedurende 24 uur. Vervang formaldehyde bij kamertemperatuur na 24 uur door 70%ethanol en laat het een nacht staan voordat u in paraffine inbedt, doorsnijdt en kleurt om laser microdissectie uit te voeren.
Snijd eerst het organotypische tot een dikte van 10 micron op op membraan gemonteerde slides. Na behandeling van de secties zoals beschreven in het tekstprotocol, bereid u voor om laser microdissectie uit te voeren met behulp van het gekozen platformformaat. Plaats de glazen slide met de te microdisseceerbare staafsectie.
Leg de slide met de staafsectie op zijn kant op de microscooptafel, monteer een 0,5 milliliter micro centrifugeerbuisje in de opvangcassette en voeg 50 microliters cel lysat buffer toe aan de dop waarin microdisseceerde weefsel onder direct zicht zal worden verzameld. Gebruik de joystick om het weefsel van belang te identificeren en gebruik de software interface om de gekleurde organische sectie te annoteren, waarbij cellen worden gemarkeerd die moeten worden microdissectieert op he
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe aanpak om de biologie te karakteriseren op het grensvlak tussen kwaadaardige epitheelcellen en kanker-geassocieerde stromale cellen in colorectale kankermodellen. Door gebruik te maken van laser microdissectie, kunnen onderzoekers de verschillende cellulaire omgevingen binnen tumormicro-omgevingen ontleden en analyseren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Oncologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Colorectaal kanker omvat complexe interacties tussen tumorcellen en het omringende stroma.
- Het begrijpen van deze interacties is cruciaal voor de ontwikkeling van gerichte therapieën.
- Laser microdissectie maakt nauwkeurige isolatie van specifieke celtypen binnen tumoren mogelijk.
- Deze methodologie kan moleculaire profileringsinspanningen verbeteren.
Doel van de studie
- Om de biologie aan de invasieve voorkant van colorectale tumoren te karakteriseren.
- Om onderscheid te maken tussen binnendringende en niet-binnendringende tumorcellen.
- Om de rol van kanker-geassocieerde stromale cellen in tumorprogressie te analyseren.
Gebruikte methoden
- Oprichting van primaire fibroblastcultures uit colonische implantaten.
- Constructie van organotypische co-cultuurmodellen met fibroblasten en colorectale kankercellen.
- Fixatie en sectie van organotypische modellen voor analyse.
- Laser microdissectie om tumor- en stromacellen te scheiden.
Belangrijkste resultaten
- Moleculaire profilering onthult verschillende biologische kenmerken van tumor- en stromacellen.
- Gedeelte verschillen in genexpressie tussen binnendringende en niet-binnendringende cellen.
- Inzichten in de rol van de tumormicro-omgeving in kankerprogressie.
- Mogelijkheid voor het ontwikkelen van gerichte therapeutische strategieën op basis van deze bevindingen.
Conclusies
- Deze aanpak biedt een manipuleerbaar model voor het bestuderen van colorectale kankerbiologie.
- Laser microdissectie is een waardevol hulpmiddel voor het isoleren van specifieke celpopulaties.
- Het begrijpen van de tumor-stroma-interface kan toekomstige kankertherapieën informeren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding the molecular dynamics at the tumor-stroma interface enables early de-risking of colorectal cancer target hypotheses by revealing phenotype-specific signaling and microenvironmental dependencies. This approach supports predictive confidence in target validation by isolating invading cell populations for mechanistic profiling, informing portfolio triage before significant investment. The methodology bridges discovery biology and translational relevance through direct analysis of invasion-competent cells in a near-physiological 3D context.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by profiling gene expression differences between invading and non-invasive tumor cells at the invasive front.
- Operational Value: Provides a reproducible method to isolate phenotypically distinct cell populations for downstream molecular analysis.
- Strategic Value: Supports target de-risking by identifying stroma-dependent invasion mechanisms that may represent actionable nodes in CRC progression.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative molecular readouts (e.g., microRNA expression) from laser-dissected invading cells to inform biomarker-assay linkage.
- Operational Value: Standardizes stromal-tumor co-culture conditions to enable consistent, invasion-competent models for assay qualification.
- Strategic Value: Facilitates assay readiness by providing a defined biological system that recapitulates key stromal interactions relevant to drug response.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links discovery-phase molecular profiles to disease-relevant stromal interactions, supporting translational biomarker exploration in CRC.
- Operational Value: Enables continuity from 3D invasion models to preclinical validation by defining stromal contributions to tumor progression.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by clarifying whether targets are operative in invasion-competent microenvironments.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis-driven profiling of invasion-competent cells, supporting lead identification through microenvironmentally contextualized target validation, and informing preclinical work via stromal co-dependency mapping.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating invading tumor cells and associated stromal compartments for molecular profiling.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible 3D models that maintain stromal-tumor interactions critical for evaluating compound effects on invasion.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (e.g., fold-change in microRNA expression) that enable statistical comparison between invasive and non-invasive phenotypes.
- Translational Research: Connects molecular signatures from the invasion front to preclinical continuity by highlighting stroma-mediated mechanisms relevant to disease progression.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized platform for repeated use across multiple cancer-stroma interaction studies in oncology discovery.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct profiling of the invasive tumor microenvironment.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of stromal-tumor co-culture models across discovery teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing microenvironmentally contextualized target evidence, reducing late-stage biological attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their relevance in invasion-competent cellular contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture, 3D organotypic model assembly, and laser microdissection techniques.
- Dependent on access to laser microdissection platforms, molecular profiling tools (e.g., for microRNA analysis), and standardized fixation/sectioning workflows.
- Necessitates cross-team standardization of co-culture conditions, staining protocols, and dissection parameters to ensure reproducibility across sites.
- Adaptation considerations include optimizing fibroblast-to-cancer cell ratios and matrix composition for different stromal contexts beyond colorectal cancer.
- Practical limitations include the technical complexity of isolating pure cell populations from dense 3D matrices and potential RNA yield constraints from microdissected samples.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:32
Establishment of Primary Fibroblast Cultures from Colonic Explants
3:18
Organotypic Preparation
8:47
Results: MicroRNA Expression Profiling of Tissue from Laser-microdissected Organotypic CRC Models
10:06
Conclusion
6:52
Organotypic Fixation and Laser Microdissection of the Invasive Margin
