Evaluatie van de vaatfunctie bij patiënten met chronische nierziekte
16 juni 2014
De mate van vasculaire dysfunctie en bij te dragen fysiologische mechanismen kunnen bij patiënten met chronische nierziekte worden beoordeeld door het meten van de arteria brachialis flow-gemedieerde dilatatie, aorta-pulse wave velocity, en vasculaire endotheliale cel eiwit expressie.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de vasculaire functie te beoordelen bij patiënten met chronische nierziekte, dit wordt bereikt door eerst vasculaire endotheelcellen van patiënten te verzamelen. De aortapulsgolfsnelheid wordt vervolgens beoordeeld om de stijfheid van grote elastische slagaders te meten. Vervolgens wordt de door stroming gemedieerde dilatatie van de brachiale slagader gemeten om de vasculaire endotheelfunctie te beoordelen.
Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de vasculaire endotheelfunctie karakteriseren. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het vasculaire veld te beantwoorden, zoals wat er op cellulair niveau gebeurt met de expressie van verschillende eiwitten. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat er uitgebreide oefening en training vereist is om echografie te beheersen.
De procedure zal worden gedemonstreerd door Lonnie Perino, een onderzoeksassistent uit mijn laboratorium. Om te beginnen, bereidt u de plaats voor met een topisch antisepticum. Plaats vervolgens steriele fenestreerde doeken over de plaats.
Een getrainde verpleegkundige of arts moet een IV plaatsen en een hep lock-adapter bevestigen. Plaats twee J-draden op de doeken om de J-vorm te ontrollen. Trek de boog van de J op beide draden.
Eenmaal ontrolld, ontdoe de hep lock en voer de JWI ongeveer acht centimeter in de ader in. Duw de draad heen en weer meerdere keren voordat u deze verwijdert om te voorkomen dat er te veel bloed op de draad ophoopt. Gebruik vervolgens een draadsnijder om de draden af te knippen zodat ze in een 50 milliliter conische buis passen die ongeveer 30 milliliter dissociatiebuffer bevat.
Herhaal deze stappen voor de tweede draad wanneer de monsterverzameling voltooid is. Keer terug naar het natte laboratorium. Grijp de draden met een paar pincetten en houd ze 10 minuten in de buis maar boven de oplossing.
Gebruik een gemotoriseerde pipetter om de draden met dissociatiebuffer uit de buis te spoelen. Laat de buffer los zodat deze over de lengte van de draden loopt en schudden overtollig vocht in de buis. Verwijder de draden en centrifugeer het monster om pellet te vormen.
Haal de monsters op en suspendeer het pellet opnieuw in PBS voordat u centrifugeert. Gebruik daarna nog eens vijf minuten een pipettentip aan het uiteinde van een afzuigingsslaan om ongeveer twee milliliter in de buis achter te laten. Zuig de rest af zonder het pellet te verstoren.
Suspendeer het pellet en pipetteer het monster gelijkmatig in de ovale gebieden van acht eerder gelabelde dia's. Plaats de dia's gedurende vijf uur in de incubator bij 37 graden Celsius voordat u ze bewaart bij minus 80 graden Celsius totdat u klaar bent voor analyse. De proefpersoon moet veranderen in wegwerpshorts en liggend in een rustige, dim, temperatuur gecontroleerde kamer liggen.
Wanneer u klaar bent om te beginnen, plaatst u de elektroden voor de echografie en ons arteriële stijfheidsapparaat. Plaats vervolgens de bloeddrukmanchet op de proefpersoon. Begin met de bloeddrukmetingen na 20 minuten, herhaal de metingen tot de metingen binnen vijf millimeter kwik zijn.
Rust twee minuten tussen elke meting en voer minimaal drie uit. Palpeer vervolgens naar de pols van de brachiale slagader en plaats de sonometer om brachiale golfvormen op te nemen. Herhaal dit voor de radiale, femorale en carotide slagaders.
Meet de afstand tot elk van deze plaatsen vanaf de super sternale notch met een meetlint voor de brachiale, radiale en carotide slagaders en een aangepaste liniaal voor de femorale. Bereken vervolgens de carotide-brachiale, carotide-radiale en carotide-femorale pulsgolfsnelheid met behulp van gespecialiseerde software. Plaats de bloeddrukmanchet van de onderarm net distaal van het reon-proces.
Stel de vasculaire software in op triggermodus en neem minimaal 10 hartcycli van de basislijn van de brachiale slagader, echografiebeelden en bloedstroomsnelheidsmetingen op. Een mechanische arm kan worden gebruikt om de echografie-sonde te stabiliseren indien gewenst. Blaas vervolgens de bloeddrukmanchet van de onderarm op tot 250 millimeter kwik.
En begin een timer. Instrueer de deelnemer om heel stil te blijven. Begin met het opnemen van snelheden wanneer de timer vier minuten en 45 seconden aangeeft.
Laat de manchet los bij vijf minuten en schakel de echografie om om B-modusbeelden op te nemen. Wanneer de klok vijf minuten en 10 seconden aangeeft. Blijf opnemen totdat de klok zeven minuten aangeeft.
Neem vervolgens de bloeddruk van het onderwerp. Als de systolische bloeddruk groter is of gelijk is aan 100 millimeter kwik, plaats 0,4 milligram sublinguaal nitroglycerine onder de tong van het onderwerp en begin de timer. Begin met het opnemen van B-modus wanneer de klok drie minuten aangeeft en stop met opnemen.
Wanneer de klok acht minuten aangeeft. Om de gekleurde endotheelcellen te analyseren, moet een enkele blinde experimentator de dia's systematisch scannen. Endotheelcellen worden geïdentificeerd door positieve kleuring voor VE-cadherine en nucleaire integriteit wordt bevestigd door positieve kleuring voor dapi. Bovendien moeten de cellen worden gekleurd voor het eiwit van interesse.
Een totaal van 30 cellen per dia moet worden geïmagerd voor latere analyse. Herhaal dit proces voor elke dia in de gekleurde batch, inclusief de VE-controledi.
Kwalitatieve software wordt gebruikt om de intensiteit van de kleuring voor het primaire antilichaam van interesse te analyseren.
Deze afbeelding toont de basislijndiameter van de brachiale slagader verkregen tijdens de beoordeling van een patiënt met chronische nierziekte na het loslaten van de manchet gedurende twee minuten. Deze opname toont een R-golf gegeerde verandering in diameter. Deze golfvormen werden verkregen bij elk van de carotide en femorale slagaders.
Het verschil in tijd en afstand werd gebruikt om een rapport van de aortapulsgolfsnelheid te berekenen. Hier werden controle- en patiëntcellen geanalyseerd op nucleaire integriteit met DPI-expressie van endotheelcellen met VE-cadherine en voor het oxidantenzym N-A-D-P-H-oxidase. Terwijl
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie beoordeelt de vasculaire functie bij patiënten met chronische nierziekte door verschillende fysiologische parameters te meten. Belangrijke maatstaven zijn de flow-gemedieerde dilatatie van de arteria brachialis en de aortale polsgolfsnelheid, die inzicht bieden in de vasculaire endotheelfunctie en stijfheid.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschap
- Cardiovasculaire Gezondheid
- Chronische Nierziekte
Achtergrond
- Vasculaire dysfunctie komt veel voor bij chronische nierziekte.
- Inzicht in de endotheliale functie is cruciaal voor het management van de patiënt.
- Het meten van de arteriële stijfheid helpt bij het karakteriseren van de vasculaire gezondheid.
- Echografische beeldvormingstechnieken zijn essentieel voor deze beoordelingen.
Doel van de studie
- Om de vasculaire endotheliale functie bij patiënten met chronische nierziekte te evalueren.
- Om de aortale polsgolfsnelheid te meten ter beoordeling van de arteriële stijfheid.
- Om het begrip van eiwitexpressie op cellulair niveau te vergroten.
Gebruikte methoden
- Verzameling van vasculaire endotheelcellen van patiënten.
- Beoordeling van de polsgolfsnelheid van de aorta.
- Meting van de flow-gemedieerde dilatatie van de arteria brachialis.
- Analyse van de resultaten om de vasculaire functie te karakteriseren.
Belangrijkste resultaten
- De karakterisering van de vasculaire endotheliale functie werd gerealiseerd.
- De resultaten wezen op variaties in arteriële stijfheid tussen patiënten.
- Er werd inzicht verkregen in veranderingen in eiwitexpressie.
- De methodologie benadrukte de noodzaak van uitgebreide training in echografie.
Conclusies
- De studie biedt een kader voor het beoordelen van de vasculaire gezondheid bij chronische nierziekte.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de fysiologische mechanismen van vasculaire dysfunctie.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze methoden om verdere vasculaire implicaties te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Vasculaire dysfunctie bij chronische nierziekte vormt een niet-traditionele cardiovasculaire risicofactor die invloed heeft op beoordelingen van de veiligheid en werkzaamheid van geneesmiddelen. Het meten van de endotheliale functie en arteriële stijfheid biedt mechanistische inzichten voor het verminderen van cardiovasculaire risico's in de preklinische en klinische ontwikkeling. Deze beoordelingen ondersteunen de validatie van targets door pathofysiologische mechanismen te koppelen aan therapeutische interventies bij populaties met chronische nierziekte.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoek therapeutische hypothesen door endotheelafhankelijke dilatatie te kwantificeren als een functionele readout van de biologische beschikbaarheid van stikstofmonoxide.
- Operationele waarde: Maak pathway-verduidelijking mogelijk door markers voor oxidatieve stress te correleren met functionele vasculaire uitkomsten.
- Voorspellende waarde: Ondersteun portfoliotriage door verbindingen te identificeren die vasculaire dysfunctie in ziekte-relevante systemen verergeren of verminderen.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereid gevalideerde endotheliale cellsystemen voor voor downstream screening van verbindingen met behulp van gestandaardiseerde isolatie- en kleuringsprotocollen.
- Kwantitatieve resultaten: Genereer reproduceerbare metingen van stroomsnelheidsafhankelijke dilatatie en polsgolfsnelheid voor dosis-responsmodellering.
- Hergebruik van het platform: Stel schaalbare workflows op voor de beoordeling van de vasculaire functie over meerdere therapeutische gebieden waarbij endotheliale gezondheid betrokken is.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Gebruik cellen afkomstig van CKD-patiënten om de menselijke vasculaire pathofysiologie te modelleren en de translationele getrouwheid te verbeteren.
- Mechanistische risicoreductie: Koppel veranderingen in eiwitexpressie (bijv. NADPH-oxidase) aan functionele vasculaire uitkomsten om het werkingsmechanisme te verduidelijken.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Onderbouw go/no-go-beslissingen door vasculaire veiligheidssignalen in een vroeg stadium van het ontdekkingscontinuüm te integreren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert de functionele vasculaire beoordeling in de workflow voor ontdekking, waardoor cellulaire fenotypes worden gekoppeld aan uitkomsten op weefselniveau en de iteratieve verfijning van therapeutische kandidaten wordt ondersteund.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothese-testen door oxidatieve stresspaden te koppelen aan endotheliale functie via meetbare veranderingen in eiwitexpressie.
- Screening: Levert assay-klare endotheliale cellen met bevestigde levensvatbaarheid en markerexpressie voor toepassingen in compound-screening.
- Analytica: Biedt kwantitatieve, onafhankelijke read-outs (FMDBA, aPWV) die vergelijking tussen condities en signaaldetectie mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Slaat de brug tussen ontdekking en preklinische validatie door menselijke cellen te gebruiken om vasculaire dysfunctie geassocieerd met CKD te modelleren.
- Bedrijfsmatige Herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar platform voor het evalueren van vasculaire risico's binnen cardiovasculaire, metabole en renale therapeutische programma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door mechanistische ambiguïteit tussen moleculaire targets en vasculaire fenotypes te verminderen.
- Operationele waarde: Standaardiseert de beoordeling van de vasculaire functie door middel van reproduceerbare procedures voor celisolatie, beeldvorming en analyse.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege identificatie van vasculaire risico's mogelijk te maken, waardoor het risico op uitval in een laat stadium wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Faciliteert risicogecorrigeerde prioritering van kandidaten op basis van vasculaire veiligheidsprofielen in CKD-relevante modellen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in vasculaire echografie, isolatie van endotheelcellen en immunofluorescentietechnieken.
- Afhankelijk van toegang tot apparatuur voor arteriële stijfheid, echografie-systemen met een hoge resolutie en fluorescentiemicroscopie.
- Maakt cross-team standaardisatie tussen klinische, laboratorium- en beeldvormingsteams noodzakelijk voor monsterbehandeling en dataconsistentie.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het toepassen van het protocol op verschillende vasculaire bedden of diermodellen.
- Beperkt door de noodzaak van uitgebreide training om betrouwbare golfvorm- en beeldacquisitie te bereiken, met name bij de echografie-afhankelijke stappen.
