Name: Gemodificeerd In vitro Invasion Assay naar de mogelijke rol van hormonen, cytokines en / of groeifactoren in Bemiddelen Cancer Cell Invasion Bepaal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Leer een gemodificeerde in vitro-invasie-assay om de rol van hormonen, cytokines en groeifactoren in kankercel-invasie te onderzoeken. Deze methode helpt bij het begrijpen van metastase-mechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen financieringsbronnen van D’Youville College School of Pharmacy, Buffalo, NY.

1. Bereid de verschillende media en de extra componenten <ol><li> Voorafgaand aan experimenteren bereiden media bestaande uit DMEM of andere genoemde media met de toevoeging van ofwel normale FBS, houtskool gestript FBS of houtskool gestript FBS plus de component te testen. Merk op dat meerdere componenten kunnen worden getest in elk experiment. </li><li> Weeg en verdun de hormonen, groeifactoren, of cytokines adequate wijze te worden opgelost in de houtskool gestript serum op de fysiologische concentratie. </li></ol> 2. Bereid de Collageen Matrix on Ice <ol><li> Bereid 2 ml collageen I matrix bij 2,2 mg / ml door toevoeging van de volgende steriel gefilterde componenten op ijs: 200 pl 10x PBS (pH 7,4), 5,4 pl 1 N NaOH, 600 ui dubbel gedestilleerd H2O en 1,2 ml collageen I (bij 3.63 mg / ml). </li><li> Houd collageen I oplossing op ijs pas klaar voor de plaat. </li></ol> 3. Bereid Migratie / Invasion Platen voor Assay &lt;/ P&gt; <ol><li> Voor elke cellijn te testen Gebruik een 24-well plaat ruimte waarin 12 putjes bevatten inserts. Gebruik de extra 12 putten die niet inserts bevatten voor het toevoegen van de chemoattractant media en de overdracht van de inserts voor de experimentele set-up. OPMERKING: Een collageen matrix op platen met een polyethyleentereftalaat (PET) membraan en 8 urn poriegrootte is optimaal voor de cellijnen hier. Echter, een Matrigel matrix voorbeklede platen ook gesubstitueerd met poriegrootte verminderd in overeenstemming met de cellijn onderzocht. </li><li> Duidelijk label de plaat, met behulp van 3 putten per aandoening die wordt geanalyseerd (FBS migratie, CS-FBS migratie, FBS invasie, en CS-FBS invasie evenals FBS-migratie voor een controle, niet-invasieve cellijn). Assay migratie beweging door poriën in een PET membraan en assay invasie door verplaatsing door een collageen of Matrigel matrix en vervolgens door poriën in het membraan. Gebruik verschillende kleuren markers voor elke cel voorwaarde om eenid in de plating proces. </li></ol> 4. Verdeel de invasie Matrix <ol><li> Zorgvuldig Pipetteer 75 ul van de collageen matrix oplossing in de inzetstukken te gebruiken voor invasie assays. Wees voorzichtig om luchtbellen te vermijden. Verspreiden luchtbellen door het aanbrengen van een omgekeerde pipettip naar de oppervlakte. </li><li> Breng de plaat met de met collageen beklede inserts aan een 37 ° C en 5% CO2 incubator gedurende 30 min naar het gel kunnen stollen. </li></ol> 5. Plaat de cellen op het membraan of Invasion Matrix <ol><li> Ondertussen trypsinize cellen en media aan 10% FBS. Spin-cellen bij 200 xg gedurende 5 minuten op een tafelblad centrifuge en spoel 3x in serumvrij medium. </li><li> Resuspendeer in serum vrije media. Tellen cellen met een hemocytometer of geautomatiseerde dia teller. Voeg serumvrij medium tot een uiteindelijke concentratie van 5 x 10 4 cellen / ml. </li><li> Wanneer het collageen matrix (na 30 min) is gestold, voeg 700 ul van media met ofwel2% FBS gedefinieerd of houtskool-gestript FBS aan elk putje. Van de 12 inserts per plaat: <ul><li> 3 inserts hebben collageen en putten met media + 2% FBS </li><li> 3 inserts hebben collageen en putten met media + 2% CS-FBS </li><li> 3 inserts hebben geen collageen en putten met media + 2% FBS </li><li> 3 inserts hebben geen collageen en putten met media + 2% CS-FBS </li></ul><ol><li> Gebruik extra platen afhankelijk van het aantal factoren getest en een zonder collageen controle overeenkomstig elke conditie. </li></ol></li><li> Voeg celsuspensie aan de inserts op 5 x 10 4 cellen / ml, plating 500 ul cellen per insert in alle migratie en invasie inserts. </li><li> Incubeer de cellen gedurende 22 uur bij 37 ° C. </li></ol> 6. kwantificeren aantal migrerende en binnenvallen Cellen <ol><li> Stel kleuring putjes met methanol fixatief, eosine en hemotoxyline, in afzonderlijke putjes. </li><li> Gebruik wattenstaafjes om cellen en matrix uit elk putje te verwijderen.Rrepeat met tweede wattenstaafje aanvraag in voor elk goed. </li><li> Met forceps, dompel elke insert 5 maal gedurende 1 seconde in elk van de 3 oplossingen elkaar. </li><li> Laat inserts drogen O / N. </li><li> Ofwel i) Verwijder filters met een scalpel snijden voorzichtig rond de randen en monteren op een dia met dekglaasje en immersie olie of ii) kan de inzetstukken drogen O / N omgekeerd en gebruik de inzetstukken direct voor microscopie. </li><li> De volgende dag, bekijken dia&#39;s of inzetstukken onder een microscoop met een 20X objectief en neem 5 beelden uit verschillende regio&#39;s van het filter. Om de samenhang te verbeteren, neem 4 buitenste velden en één centrum. </li><li> Tellen cellen voor alle omstandigheden met behulp van ImageJ software en gelden voor de onderstaande formules. </li><li> Bepaal het percentage invasie als volgt: Bedoel # cellen binnenvallen door collageen Ik steek = een Bedoel # cellen migreren via besturingssokkel = b % Invasion = (a / b) x 100 </li><li> Bepaal de invasie Index in 2% FBS als volgt: % Invasie van cellen worden getest (in 2% FBS) = c % Invasie van controle invasieve cellen in (2% FBS) = d Invasion index (FBS) = (c / d) </li><li> Bepaal de invasie Index in 2% CS-FBS als volgt: % Invasie van cellen worden getest (in 2% CS-FBS) = e % Invasie van controle invasieve cellen in (2% CS-FBS) = f Invasie Index (CS-FBS) = (e / f) </li></ol> 7. Herhaal Experimenteel protocol Vergelijking Charcoal-gestript FBS Charcoal-gestript FBS + X n met meerdere factoren samen <ol><li> Herhaal deze procedure meerdere malen als nodig met verschillende onderdelen van &quot;X&quot; of een combinatie van componenten. </li><li> Breng de berekening van de bijdrage van elke factor &quot;X&quot; op de migratie en invasie effecten bepalen. </li></ol>

<ol><li>Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeinberg%2C+RA+%22The+Biology+of+Cancer%22">The Biology of Cancer</a>. , 2nd Edition, Garland Science. (2013).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hallmarks+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li>
<li>Valastyan, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metastasis%3A+molecular+insights+and+evolving+paradigms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms.</a> Cell. 147 (2), 275-292 (2011).</li>
<li>Dang, Z. C., Lowik, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+serum+factors+by+charcoal+treatment+promotes+adipogenesis+via+a+MAPK-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Removal of serum factors by charcoal treatment promotes adipogenesis via a MAPK-dependent pathway.</a> Mol Cell Biochem. 268 (1-2), 159-167 (2005).</li>
<li>Yohay, D. A., Zhang, J., Thrailkill, K. M., Arthur, J. M., Quarles, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+serum+in+the+developmental+expression+of+alkaline+phosphatase+in+MC3T3-E1+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of serum in the developmental expression of alkaline phosphatase in MC3T3-E1 osteoblasts.</a> J Cell Physiol. 158 (3), 467-475 (1994).</li>
<li>Zucker, S. N., Bancroft, T. A., Place, D. E., Des Soye,, Bagati, B., Berezney, A., R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dominant+negative+Cx43+mutant+differentially+affects+tumorigenic+and+invasive+properties+in+human+metastatic+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A dominant negative Cx43 mutant differentially affects tumorigenic and invasive properties in human metastatic melanoma cells.</a> J Cell Physiol. 228 (4), 853-859 (2013).</li>
<li>Fox, E. M., Andrade, J., Shupnik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+actions+of+estrogen+to+promote+proliferation%3A+integration+of+cytoplasmic+and+nuclear+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">Novel actions of estrogen to promote proliferation: integration of cytoplasmic and nuclear pathways.</a> Steroids. 74 (7), 622-627 (2009).</li>
<li>Meierjohann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP13+mediates+cell+cycle+progression+in+melanocytes+and+melanoma+cells%3A+in+vitro+studies+of+migration+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">MMP13 mediates cell cycle progression in melanocytes and melanoma cells: in vitro studies of migration and proliferation.</a> Molecular Cancer. 9, 201(2010).</li>
<li>Smalley, K. S., Haass, N. K., Brafford, P. A., Lioni, M., Flaherty, K. T., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+signaling+pathways+must+be+targeted+to+overcome+drug+resistance+in+cell+lines+derived+from+melanoma+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases.</a> Mol Cancer Ther. 5 (5), 1136-1144 (2006).</li>
<li>Both, N. J., Vermey, M., Dinjens, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+evaluation+of+various+invasion+assays+testing+colon+carcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">A comparative evaluation of various invasion assays testing colon carcinoma cell lines.</a> Br J Cancer. 81 (6), 934-941 (1999).</li>
<li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+cancer+metastasis%3A+the+%27seed+and+soil%27+hypothesis+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 453-458 (2003).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+to+mesenchymal+transition+in+human+breast+epithelial+cells+transformed+by+17beta-estradiol%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial to mesenchymal transition in human breast epithelial cells transformed by 17beta-estradiol.</a> Cancer Res. 67 (23), 11147-11157 (2007).</li>
<li>Huang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+hormone+regulation+of+miR-21+enhances+migration+and+invasion+of+hepatoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Thyroid hormone regulation of miR-21 enhances migration and invasion of hepatoma.</a> Cancer Res. 73 (8), 2505-2517 (2013).</li>
<li>Scheel, C., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+and+epithelial-mesenchymal+transition%3A+concepts+and+molecular+links%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells and epithelial-mesenchymal transition: concepts and molecular links.</a> Semin. Cancer Biol. 22 (5-6), 396-403 (2012).</li>
<li>Kojima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+TGF-beta+and+stromal+cell-derived+factor-1+%28SDF-1%29+signaling+drives+the+evolution+of+tumor-promoting+mammary+stromal+myofibroblasts.Proc%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.Proc.</a> Natl Acad Sci U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).</li>
<li>Maehara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+transforming+growth+factor-%CE%B21+in+invasion+and+metastasis+in+gastric+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncology%22%5BJournal%5D)">Role of transforming growth factor-β1 in invasion and metastasis in gastric carcinoma.</a> J. Clin. Oncology. 17 (2), 607-614 (1999).</li>
<li>Lu, Z., Jiang, G., Blume-Jensen, P., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor-induced+tumor+cell+invasion+and+metastasis+initiated+by+dephosphorylation+and+downregulation+of+focal+adhesion+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase.</a> Mol. Cell Biol. 21 (12), 4016-4031 (2001).</li>
<li>Korkaya, H., Liu, S., Wicha, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Cancer+stem+cells%2C+cytokine+networks%2C+and+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Breast Cancer stem cells, cytokine networks, and the tumor microenvironment.</a> J. Clin. Invest. 121 (10), 3804-3809 (2011).</li>
<li>Rosen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interrogation+of+HGF-SF+with+other+cytokines+in+tumor+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22EXS%22%5BJournal%5D)">The interrogation of HGF-SF with other cytokines in tumor invasion and metastasis.</a> EXS. 65, 301-310 (1993).</li>
<li>Sanz-Moreno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+and+JAK1+signaling+cooperate+to+control+actomyosin+contractility+in+tumor+cells+and+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">ROCK and JAK1 signaling cooperate to control actomyosin contractility in tumor cells and stroma.</a> Cancer Cell. 20 (2), 229-245 (2011).</li>
<li>Fleming, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+interactions+between+primary+human+human+fibroblasts+enhance+murine+mammary+gland+humanization+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Paracrine interactions between primary human human fibroblasts enhance murine mammary gland humanization in vivo.</a> Breast Cancer Res. 14 (3), (2012).</li>
<li>Sikora, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M.J.%2C+V.%2C+M.E.%2C+M.D.%2C+J.M%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+estrogen-independent+breast+cancer+growth+driven+by+low+estrogen+concentrations+are+unique+versus+complete+estrogen+deprivation.Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">M.J., V., M.E., M.D., J.M.</a> Mechanisms of estrogen-independent breast cancer growth driven by low estrogen concentrations are unique versus complete estrogen deprivation.Breast Cancer Res Treat. 134 (3), 1027-1039 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Tumormetastase is een meerstaps proces. De cellen moeten breken door de basaalmembraan, intravasate in ofwel het lymfestelsel of bloed microvaatjes, waarin zij worden getransporteerd naar afgelegen plaatsen. De tumorcellen vervolgens extravasatie en koloniseren een macrometastasis 12. Progressie door de epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT), tumor invasie en metastase is verbeterd door steroïde hormonen 13,14, groeifactoren 15-18 en cytokinen 19-21. Deze moleculen zijn...

Een nieuw invasie assay is ontwikkeld met het doel van het identificeren van de betrokkenheid van specifieke hormonen, cytokinen en / of groeifactoren zoals chemoattractanten in kankercel invasie. Het vermogen van tumorcellen binnen te dringen door de extracellulaire matrix (ECM) is een kenmerk van het metastatische fenotype 1-3. Invasion kamers zijn uitgebreid gebruikt als in vitro instrumenten kankercel invasie en migratie bestuderen en kunnen kennis verschaffen over de mechanismen van in vivo tumor invasie en metastase. De kamers bestaan ​​uit cilindrische celkweek inserts genest binnen de putten van celkweek platen. De bodems van de inzetstukken halfdoorlatende polycarbonaat of polystyreen membranen van gedefinieerde poriegrootte. In de standaard invasie assay worden cellen gezaaid op het inzetstuk membraan met serumvrij medium en geplaatst in celcultuur putjes die zijn gevuld met serum of serum-achtige chemoattractanten te set een chemoattractive kracht. Deze kracht drives cellen om door de semi-permeabele membraan (migratie) of door een coating van extracellulaire matrix (invasie), die vervolgens kunnen worden gekleurd met conventionele kleurstoffen detecteren en kwantificeren van het aantal cellen. Het aantal cellen wordt vervolgens genormaliseerd naar de mate van migratie en invasie in een invasieve cellijn. Met deze methode kan een onderzoeker om de invasieve potentieel van de verschillende celtypen onder verschillende omstandigheden, met inbegrip van genetische manipulaties evalueren. Hormonen, cytokinen en groeifactoren zijn kritische componenten van serum en worden steeds vaker blijken geassocieerd te zijn met het drijven het invasieve fenotype 4. Echter, de aard, de rol en de specificiteit van deze chemoattractive serum moleculen in het bemiddelen invasie nog steeds ongrijpbaar. De uitdaging blijft om te bepalen welke specifieke factoren in het serum of serum-achtige chemoattractants verantwoordelijk voor het rijden bentkankercel invasie evenals wat moleculen de invasie proces kan remmen. In dit verslag beschrijven we een methode om de mogelijke betrokkenheid van hormonen, cytokinen en / of groeifactoren die in serum evalueren, zoals moleculen drijven de chemoattractie en invasie van kankercellen. In deze voorgestelde gewijzigde protocol, wordt houtskool strippen gebruikt hormonen, cytokinen en groeifactoren van 2% foetaal runderserum (FBS) verwijderen tot 2% houtskool gestript FBS (CS-FBS) genereren. Beide 2% FBS en 2% CS-FBS worden gebruikt als middelen om de chemoattractive kracht kankercel invasie drijven. Met 2% CS-FBS als chemoattractive middel in vergelijking met normale 2% FBS biedt verscheidene voordelen waaronder eerste en meest prominent, de mogelijkheid om de kankerinvasie fenotype in de gereduceerde / relatieve afwezigheid van hormonen, cytokinen en groeifactoren te bestuderen. Het maakt het ook mogelijk de onderzoeker om te beoordelen of de collectieve verwijdering van hormonen, groeifactoren, en cytokines veroorzaakt een toename of afname van de invasieve index. De assay wordt vervolgens bepaald of de toevoeging van een individuele component, aangeduid als &quot;X&quot; kan remmen, verlagen, verhogen of herstellen de invasieve index op zijn oorspronkelijke waarde (zie figuren 2 en 3). Hoewel deze methode is specifiek voor het bereiken van fysiologische niveaus van de component die wordt verwijderd uit het serum tijdens houtskool strippen, moet worden opgemerkt dat houtskool strippen kunnen worden beïnvloed signaaltransductiewegen. Bijvoorbeeld is gerapporteerd dat houtskool strippen de alkalische fosfatase activiteit van osteoprogenitor cellen kan afnemen en induceren adipogenese door verlaging van MAPK activatoren 5. Houtskool gestript media zijn commercieel verkrijgbaar en zijn gebaseerd op het beschreven protocol dat houtskool gecombineerd met dextran en geïncubeerd met foetaal runderserum O / N 6. Deze test werd ontwikkeld in RespoNSE een resultaat gerapporteerd door Zucker et al. 7 De auteurs toonden dat een mutant fenotype die gap junction communicatie toonden een verhoging van de invasie index bij het ​​migreren naar media met normale 2% FBS. Deze stijging werd geëlimineerd met de vervanging van houtskool gestript serum. Uit deze resultaten concludeerden de auteurs dat deze mutant beïnvloed migratie naar een lipofiel molecuul (specifieker, een hormoon, groeifactor of cytokine) 7. Het is bekend dat hormonen, groeifactoren en cytokinen signaaltransductiewegen betrokken bij tumorontwikkeling en invasie 4. Het is dus belangrijk dat wetenschappelijke onderzoekers bepalen welke factor (en) drijven de tumor invasie van hun specifieke kankercellen of mutanten onder studie. De test is ontworpen om de rol van individuele componenten richten op de fysiologische concentratie zoals bepaald overeenkomstig het verschil tussen de concentratie van de component &amp;# 8220, X &quot;normale FBS en de CS-FBS. Door de ontwikkeling van deze test, kunnen de onderzoekers meer inzicht in de specifieke invasieve route voor hun systeem te krijgen. Hormonen, groeifactoren en cytokinen zijn vaak ingedeeld als tumor promotoren 8. Sommige van deze factoren zoals EGF worden gebruikt als directe bron voor chemoattractanten invasie kamers 9. Derhalve lijkt het waarschijnlijk dat deze vormen de belangrijkste onderdelen van het serum die directe tumorinvasie. Dit protocol stelt een eenvoudige, maar significante, wijziging van de gebruikelijke in vitro invasie assay waarmee een onderzoeker om de betrokkenheid van hormonen, groeifactoren en cytokines beoordelen mediëren het invasieve potentieel van kankercellen. Echter, de test om de onderzoeker met een antwoord over de vraag of de procedure effectief voor de studie zullen in een eerste stap in de analyse, zodat geen kostbare tijd en r gebruikenIDDELEN als overbodig beschouwd. Deze methode maakt gebruik van CS-FBS en vertrouwt op de onderzoekers beoordelingsmarge met betrekking tot welke moleculen na te streven als lead kandidaten die mogelijk bemiddelen kankercel invasie. De resultaten van deze analyses blijken bruikbaar te zijn om te bepalen welke serum bestanddelen dienen als chemoattractanten en remmers voor de bepaalde cellijn of mutant bestudeerd. Daarnaast kan deze aanpak helpt de onderzoeker bepalen wat de belangrijkste signaalwegen ofwel bevorderen of remmen kankercel invasie; Zo regisseren toekomst drug design.

<table><tbody><tr><td>BioCoat Control Inserts met 8,0 &micro;m PET-membraan</td><td>Corning</td><td>354578</td><td>12 in elk van twee 24-well platen. PET = polyethyleentereftalaat</td></tr><tr><td>Collageen I, rattenstaart</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Bron = rattenstaartpees, zuiverheid = 90%</td></tr><tr><td>Fixeermiddel; Diff-Quick</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9844047</td><td>Methanol-gebaseerd fixeermiddel, hematoxylline/eosine</td></tr><tr><td>Fétaal bovien serum</td><td>Life Technologies</td><td>16000</td><td>Aangeduid als FBS</td></tr><tr><td>Charcoal gestreept fétaal bovien serum</td><td>Life Technologies</td><td>12676</td><td>Aangeduid als CS-FBS</td></tr><tr><td>Fétaal bovien serum</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30070</td><td>Aangeduid als FBS</td></tr><tr><td>Charcoal gestreept fétaal bovien serum</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30068</td><td>Aangeduid als CS-FBS</td></tr></tbody></table>

gemodificeerd<em&gt; in vitro</em&gt; invasion assay naar de mogelijke rol van hormonen, cytokines en / of groeifactoren in bemiddelen cancer cell invasion bepaal

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Bloedserum dient als een chemoattractant richting die kankercellen migreren en binnen te vallen, hun intravasation faciliteren in haarvaten. De werkelijke moleculen waarnaar het migreren blijven ongrijpbaar. Deze gewijzigde invasie assay ontwikkeld om doelstellingen die celmigratie en invasie drijven identificeren. Deze techniek vergelijkt de invasie index onder drie voorwaarden te bepalen of een specifiek hormoon, groeifactor of cytokine speelt een rol in het mediëren van het invasieve potentieel van een kankercel. Deze omvatten i) normaal foetaal runderserum (FBS), ii) houtskool gestript FBS (CS-FBS), die hormonen, groeifactoren en cytokinen en iii) CS-FBS + molecule verwijderd (aangeduid als &quot;X&quot;). Een significante wijziging invasie CS-FBS vergeleken met FBS, geeft de betrokkenheid van hormonen, cytokinen of groeifactoren de regulering van de verandering. Individuele moleculen kunnen vervolgens weer worden toegevoegd aan CS-FBS hun vermogen om opnieuw te testenvers of redden van de invasie fenotype. Verder kunnen twee of meer elementen worden gecombineerd om de additieve of synergetische effecten van meerdere moleculen in besturen of remmen invasie evalueren. Kortom, deze werkwijze kan de onderzoeker bepalen of hormonen, cytokinen en / of groeifactoren spelen een rol bij invasie door als chemoattractanten en remmers van inval voor een bepaald type kankercel of een bepaalde mutant. Door het identificeren van specifieke chemoattractants en remmers, kan deze gewijzigde invasie assay helpen verhelderen signaalwegen die kankercel invasie sturen.

De invasie index wordt berekend voor elke conditie volgens normalisatie een invasieve cellijn. Voor onze experimenten gebruiken we de 1205Lu melanoma cellijn en gevestigde variant stabiele cellijnen onze invasieve lijnen en de premaligne invasieve variant WM793 waaruit de 1205Lu cellen werden afgeleid 10 dat dient als logische controle. Wij gebruiken ook collageen I als de invasie matrix, want dat is de belangrijkste component van de dermis. Dit is in overeenstemming met een eerdere studie waarbij de optimale...

Dit videoartikel beschrijft een gewijzigde in vitro methode om de rol van hormonen, cytokinen en/of groeifactoren bij het aanjagen van kankercelinvasie te onderzoeken.

Gemodificeerd<em&gt; In vitro</em&gt; Invasion Assay naar de mogelijke rol van hormonen, cytokines en / of groeifactoren in Bemiddelen Cancer Cell Invasion Bepaal

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het opzetten van een in vitro assay om de rol van hormonen, cytokinen en of groeifactoren bij het stimuleren van kankercelinvasie te onderzoeken. Dit wordt bereikt door in een tweede stap vast te stellen of er een verschil bestaat in de invasie-index tussen verschillende celvarianten of mutanten. De invasie-assay wordt herhaald met gebruik van met houtskool gestripte media, waardoor alle hormonen, groeifactoren of cytokinen uit het serum worden verwijderd.De invasie-assay wordt vervolgens herhaald met de toevoeging van een specifieke bekende factor aan het met houtskool gestripte medium om te bepalen of migratie naar die factor de invasie versterkt of remt. De resultaten tonen de veranderingen in de invasie-index voor specifieke celpopulaties die optreden tijdens migratie naar bekende experimentele factoren, gebaseerd op de normalisatie van de resultaten ten opzichte van de invasie-index van niet-invasieve celpopulaties. Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze methode toen ik een traditionele invasie-assay uitvoerde en merkte dat er een significant verschil was tussen de invasie-indices voor verschillende celmutanten.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de traditionele invasie-assay, is dat men met deze techniek specifiek de rol van hormonen, specifieke groeifactoren en cytokinen bij het bevorderen of remmen van celinvasie kan onderzoeken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het kankeronderzoek, waaronder welke factoren leiden tot kankermetastasen. De implicaties van deze techniek kunnen een therapeutische benadering bieden voor toekomstig geneesmiddelonderzoek. Gebruik voor elke te testen cellijn een 24-wellplaat met 12 inserts.Label vervolgens de platen volgens de te analyseren condities. Dispenseer daarna voorzichtig 75 µL van een vers bereide collageenmatrixoplossing in elke insert die zal worden gebruikt voor een invasie-assay, waarbij u erop let dat er geen bellen ontstaan. Incubeer de platen met de collageen-gecoate inserts vervolgens 30 minuten bij 37 °C en 5% CO2 om de gel te laten stollen.Voeg na het losmaken van de experimentele cellen met trypsine medium aangevuld met 10% FBS toe om het enzym te inactiveren en was de cellen drie keer met PBS. Resuspendeer vervolgens het pellet in serumvrij medium en tel de cellen. Voeg serumvrij medium toe tot een uiteindelijke concentratie van 50 000 cellen per milliliter zodra de collageenmatrix is gestold.Voeg na 30 minuten aan elke put 700 µL medium toe met ofwel 2% gedefinieerd FBS, 2% charcoal-stripped FBS of 2% charcoal-stripped FBS plus de aanvullende component. Voeg bovenop elke migratie- of invasie-insert 500 µL celсусpensie in serumvrij medium toe. Incubeer de assays gedurende 22 uur bij 37 °C.Voeg vervolgens methanol, fixatief, eosine en hematine toe aan drie van de lege putjes van de kamerplaat. Verwijder daarna de cellen en de matrix van de bovenkant van elk insert met twee opeenvolgende wattenstokjes. Gebruik vervolgens een pincet.Dompel elk insert vijf keer onder in elk van de drie kleuringsoplossingen, telkens één seconde per keer en in opeenvolgende volgorde, en laat de inserts gedurende de nacht ondersteboven drogen. Gebruik de volgende dag een 20 x objectief om beelden van de cellen op de inserts te verkrijgen door de gekleurde inserts direct te bekijken.Er worden vijf afbeeldingen gemaakt per monster, waaronder vier uit de buitenste velden van het membraan en één uit het centrum. Tel vervolgens met behulp van ImageJ-software de cellen voor elke afbeelding en bereken de invasie-index, genormaliseerd ten opzichte van een niet-invasieve cellijn. Dit model demonstreert de potentiële resultaten die tijdens een invasie-assay kunnen worden aangetroffen en hoe de overeenkomstige gegevens moeten worden geïnterpreteerd.Elke cirkel illustreert een representatief resultaat voor een gekleurd filter van een van de drie geteste condities, en elke stip representeert een cel die door de invasiematrix is gegaan en op de bodem van het membraan is gekleurd. De invasie-index wordt vervolgens voor elke conditie berekend op basis van de normalisatie ten opzichte van een niet-invasieve cellijn. In dit representatieve experiment werden bijvoorbeeld drie hormonen getest om een mogelijke x-factor te identificeren.Twee van de hormonen hadden geen effect op de invasie-index, maar er werd vastgesteld dat één hormoon remmende eigenschappen vertoonde. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer vier uur op dag één en één uur op dag twee worden uitgevoerd, mits alle stappen correct worden doorgevoerd. Tijdens het gebruik van deze techniek is het belangrijk om elke individuele celinsert zorgvuldig te labelen.We hebben een kleurgecodeerd systeem en verschillende stippen gebruikt om elke celinsert zorgvuldig te labelen. Vervolgens kunnen andere methoden, zoals in vivo muismodellen voor metastase, worden gebruikt om de in vitro resultaten te valideren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de fysiologische relevantie van factoren zoals hormonen, groeifactoren en cytokinen kan worden bepaald als enhancers of inhibitoren van celinvasie in een in vitro model.Bedankt voor uw interesse in onze video en veel succes met uw experimenten.

a-modified-vitro-invasion-assay-to-determine-potential-role-hormones

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een test om kwantitatief te meten Transforming Growth Factor (TGF)-β-geïnduceerde invasie in 3-dimensionale collageen gels is beschreven. Deze test maakt gebruik van de MCF10A reeks van cel-lijnen, die verschillende stadia van de ontwikkeling van borstkanker te vertegenwoordigen. Deze methode kan worden vastgesteld om te worden gebruikt met andere cellijnen en kan worden gebruikt om andere potentiële activatoren of inhibitoren van een invasie te onderzoeken.

Sferoïde Assay voor TGF-β-geïnduceerde Invasion Measure

Modellen van de tumorcel invasie in drie-dimensionale extracellulaire matrix beter aansluiten bij...

Modeling and Imaging 3-Dimensionale Collectief Cell Invasion

This video describes the technique of utilizing a native matrix to study tumor cell invasion. The technique used in this assay provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix.

Tumor Cell Invasion Assay: A 3D In Vitro Native Matrix-based Method to Assess Epithelial-mesenchymal Cell Interactions

Vaak gebruikt, zijn zeer toegankelijk methoden voor de behandeling van cel migratie en invasie in vitro beschreven. De eerste methode is de cel wondsluiting assay die celmotiliteit meet. De tweede methode is de transwell migratie en invasie assay die de chemotactische en invasieve vermogen van cellen beoordeelt.

In vitro cel-migratie en invasie assays

Ovariale kankercel invasie in de mesotheellaag van het peritoneum is een dynamisch proces in de tijd. Gebruik te maken van een real-time analyzer, kan de invasieve capaciteit van eierstokkanker cellen in een bolvormige-mesothelial cel co-cultuur model gekwantificeerd worden gedurende langere perioden, het verstrekken van inzicht in factoren die de het metastatische proces.

Evaluatie van eierstokkanker Sferoïde Hechting en Invasie van mesotheelcellen in Real Time

Invasie van omliggende normale weefsels is een typerend kenmerk van kwaadaardige tumoren. We bieden hier een eenvoudige, semi-geautomatiseerde microplaattest van invasie in een natuurlijke 3D biomatrix die met een aantal modellen van gevorderde menselijke kankers is geëxemplifeerd.

Driedimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Hier presenteren we een protocol om de invasie van tumorcellen bestuderen in levende normaal weefsel fragmenten in drie dimensies. Dit orgelcultuur techniek wordt vooral toegepast om potentieel anti-invasieve drugs testen in vitro.

Chick Heart Invasion Assay voor het testen van de Invasiviteit van kankercellen en de activiteit van potentieel anti-invasieve verbindingen

Deze methode evalueert de invasie van kankercellen uit sferoïden in een omringende 3D-matrix.  Sferoïden worden gegenereerd via de hanging drop-kweekmethode en vervolgens ingebed in een matrix bestaande uit basement membraanmaterialen en type I collageen.  Invasie uit de sferoïden wordt vervolgens gemonitord.

Een Cancer Cell Sferoïde Assay om Invasion beoordelen in een 3D-instelling

Dit protocol beschrijft een omgekeerde verticale invasie-bepaling die kan worden gebruikt om het kwantificeren van de mogelijkheden voor migratie en invasie van cellen in een driedimensionale omgeving met behoud van de cel-communicatie. Deze test is geschikt voor zeldzame en/of gevoelige cellen.

Verplaatsen naar boven: Een eenvoudig en flexibel In Vitro driedimensionale invasie Assay Protocol

De in vitro Cell Invasion assay wordt gebruikt om het potentieel van kanker metastasen te meten door het cellulaire potentieel voor invasie en migratie te kwantificeren met behulp van celkweek inserts met eiwit matrix. Cellen worden uitgedaagd om te migreren door de eiwit matrix en een poreus membraan, naar een chemoaantretant, en vervolgens gekwantificeerd door lichte microscopie.

Het gebruik van muizen-borstkanker tumor cellen in een in vitro invasie assay als een maat voor oncogene Celgedrag

Invasie is een belangrijk biologisch fenomeen bij de ontwikkeling en progressie van kanker. Dit proces wordt beïnvloed door niet-neoplastische cellen en componenten van de micro-omgeving van de tumor. Het doel van deze studie is het beschrijven van een alternatieve methode voor het analyseren van tumorcelinvasie in vitro met behulp van driedimensionale (3D) culturen.

Alternatieve strategie om in vitro celinvasie van 3D-culturen te analyseren

Leer een gemodificeerde in vitro-invasie-assay om de rol van hormonen, cytokines en groeifactoren in kankercel-invasie te onderzoeken. Deze methode helpt bij het begrijpen van metastase-mechanismen.

Gemodificeerd In vitro Invasion Assay naar de mogelijke rol van hormonen, cytokines en / of groeifactoren in Bemiddelen Cancer Cell Invasion Bepaal (Video) | JoVE Journal

Gemodificeerd

Meer video's verkennen