Vorming van biomembraan Microarrays met een zuigmond-gebaseerde Vergadering Methode
May 8th, 2014
Ondersteunde lipide dubbellagen en natuurlijke membraan deeltjes zijn handig systemen die de eigenschappen van celmembranen kunnen benaderen en diverse analytische strategieën worden opgenomen. Hier laten we een werkwijze voor het bereiden microarrays samengesteld ondersteunde lipide-bilaag beklede SiO2 parels, fosfolipide vesicula of natuurlijke membraan deeltjes.
Het algemene doel van deze procedure is om bio membraan micro-arrays te creëren met behulp van een eenvoudige bereidingsmethode. Dit wordt bereikt door eerst silica-kralen te coaten met lipide dubbellaag membranen. De tweede stap van de procedure is om de met lipiden beklede kralen op het siliconen micro-well substraat te deponeren.
De derde stap is om kralen die zich niet in micro-wells bevinden te verwijderen, met behulp van een polymethyl suboxaan squeegee. De laatste stap is om de met lipiden beklede kralen arrays te beeld met behulp van fluorescentiemicroscopie. Uiteindelijk kan deze methode worden gebruikt om bindingsconstanten voor toxine-lipide interacties te bepalen met behulp van een array beeldvormingsbenadering.
Deze methode kan worden gebruikt om arrays van sferische ondersteunde lipide dubbellagen en natuurlijke membraan deeltjes die zijn afgeleid van cellen te creëren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden is dat behalve de fabricage van de micro-wells, de techniek geen chemische modificatie vereist van zowel het substraat als de lipide membranen om ruimtelijk gedefinieerde bio membraan arrays te creëren. De toepassingen van deze techniek kunnen worden uitgebreid tot label-free detectie van lipide-eiwit interacties met behulp van oppervlakteplasma en resonantie op basis van nanometrische metaal gat arrays.
Hoewel deze methode inzicht kan bieden in lipide-eiwit interacties, kan deze ook worden toegepast op andere systemen zoals studies van cellulaire focale adhesie, Micro-well arrays en squeegee preparaties worden gedetailleerd beschreven in het tekstprotocol. Deze video begint met de bereiding van vesiculen. Eerst meng in een kleine glazen viaal de component lipiden voor de vesiculen.
Een totaal van een halve milligram lipide is in deze oplossing onder vacuüm gedroogde de mix voor zes uur. Maak vervolgens een 0,1 molaire natriumchloride oplossing en voeg een halve milliliter toe aan de gedroogde lipiden. Laat de mix overnacht incuberen bij kamertemperatuur.
De volgende dag, vortex de mix om de vesiculen te suspenderen. Sonificeer vervolgens de mix gedurende 20 minuten in een bad, sonificeer bij kamertemperatuur. Na de sonificatie, extrudeer de suspensie door een 100 nanometer polycarbonaat membraan filter.
Laat de suspensie in totaal 17 keer door de extrusie filter gaan. Bewaar vervolgens de geextrudeerde vesiculen in een glazen viaal bij vier graden Celsius. Eerst met behulp van 700 nanometer diameter siliciumdioxide kralen.
Maak een suspensie van 15 miljard kralen in 0,1 molaire natriumchloride. Vortex de suspensie en centrifugeer deze vervolgens 20 minuten bij 1700 Gs en gooi de supernatant weg. Herhaal de wassing door de kralen op te schorsen in nog een milliliter zout oplossing en ze nog eens 20 minuten te laten draaien.
Herhaal het proces vervolgens een derde keer om de sferische ondersteunde lipide dubbellagen of SSB's te vormen. Meng 25 microliters van de siliciumdioxide kralensuspensie met 200 microliters van de vesikel suspensie uit de vorige sectie. Vortex de mix en laat deze een uur incuberen bij kamertemperatuur. Centrifugeer vervolgens de mix gedurende 20 minuten bij 1700 Gs.
Gooi de supernatant weg. Het pellet is roze vanwege gebroken vesiculen met row DPPE op de kralen. Resuspendeer het in 225 microliters PBS bij PH 7,4.
Herhaal de centrifugatie en resuspensie stappen twee keer om de ongebroken vesiculen te verwijderen en de creatie van de SSB's te voltooien. Verdeel wafers van micro-well arrays in rechthoekige stukken met elk vier tot zes arrays. Vortex vervolgens de SSLB suspensie uit de vorige sectie en breng 10 microliters over naar elke micro-well array.
Wacht een uur tot de SSB's zich hebben gesetteld. Was vervolgens de array chips voorzichtig met PBS en dompel de array onder in PBS met behulp van de squeegee die vijf keer over het oppervlak van de ondergedompelde chips glijdt. Dit verwijdert SLP's die zich niet in de micro-wells bevinden.
Pak vervolgens elke array chip met behulp van een pincet en schud voorzichtig de PBS er af. Breng het vervolgens over naar een nieuwe PBS bad. De bovenste oppervlakken van de chips moeten nat blijven.
Verwijder een chip uit het bad en veeg weg. Verwijder het grootste deel van de PBS met behulp van een laboratorium doek. Laat genoeg PBS over om de array gehydrateerd te houden.
Voeg nu 200 microliters BSA oplossing toe aan de array om niet-specifieke binding te blokkeren. Laat de array een uur incuberen. Verwijder vervolgens de BSA met behulp van een micropipet en voeg 200 microliters cholera toxine oplossing toe.
Breng vervolgens de array terug naar de bevochtigde kamer. Wacht nog een uur, was vervolgens de array met PBS en veeg het overtollige PBS weg met behulp van een lap. Plaats vervolgens de array chip op een standaard microscoop slide en bevestig een 24 bij 40 millimeter vierkant dekglas op de array en ga door met beeldvorming.
Beeldanalyse kan worden gedaan met behulp van de Image J. Geautomatiseerde deeltjesanalyse functies. Daarna, voor elke array, vat de gemiddelde intensiteiten van de individuele SSB's samen als histogrammen. Na het gebruik van de omschreven methoden, toont een oppervlakte van 100 micron op een array 936 SSB's.
Terwijl bezettingsgegevens werden berekend en een histogram van SSLB fluorescente intensiteiten werd gegenereerd na een week in opslag. Dezelfde array werd opnieuw geanalyseerd op dezelfde manier, en er was geen verandering in fluorescente intensiteiten of array bezetting. Sequentiële depositie van verschillende SSB's met verschillende identificerende markeringen was ook mogelijk met de omschreven methoden.
De tweede SSB's werden gedeponeerd op één tiende. De concentratie van de eerste SSB's die werd gedeponeerd. Een overlay van beide markers wordt getoond voor een experiment.
Arrays werden gemaakt met SSB's met verschillende concentraties van GM één en blootgesteld aan een vaste concentratie van cholera toxine. Het omgekeerde werd ook uitgevoerd om de evenwichtsdissociatieconstante te bepalen. Voor GM één.
Cholera toxine binding arrays kunnen ook worden gemaakt van natuurlijke bio membranen, zoals deze array gemaakt van
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het creëren van biomembraan microarrays met behulp van ondersteunde lipide bilayers. Het proces omvat het coaten van silicabeadjes met lipide bilayers en het deponeren van deze beadjes op een siliconen microwell-substraat.
Belangrijke Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biofysica
- Analytische Chemie
Achtergrond
- Ondersteunde lipide bilayers bootsen eigenschappen van celmembranen na.
- Natuurlijke membraandeeltjes kunnen worden gebruikt in verschillende analytische strategieën.
- Microarrays vergemakkelijken de studie van biomoleculaire interacties.
- Fluorescentiemicroscopie wordt gebruikt voor het beeldvormen van de arrays.
Doel van het onderzoek
- Om een eenvoudige methode te ontwikkelen voor het bereiden van biomembraan microarrays.
- Om de bepaling van bindingsconstanten voor toxine-lipide interacties mogelijk te maken.
- Om de analytische mogelijkheden te verbeteren bij het bestuderen van membraandynamica.
Gebruikte methoden
- Coating van silicabeadjes met lipide bilayer membranen.
- Deponeren van lipide-gecoate beadjes op een siliconen microwell-substraat.
- Verwijderen van niet-microwell beadjes met behulp van een polymethyl suboxaan squeegee.
- Beeldvorming van de lipide-gecoate beadjes arrays met fluorescentiemicroscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle bereiding van met lipide bilayers gecoate microarrays.
- Gedemonstreerd beeldvormen van lipide-gecoate beadjes arrays.
- Mogelijke toepassing in het bestuderen van lipide interacties met toxines.
- Een eenvoudige en effectieve methodologie voor onderzoekers geboden.
Conclusies
- De methode maakt de creatie van functionele biomembraan microarrays mogelijk.
- Het kan worden gebruikt voor verschillende analytische toepassingen in neurowetenschappen en biologie.
- Toekomstige studies kunnen verdergaan met de interacties die met deze methode zijn bestudeerd.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This method enables the creation of stable, high-density supported lipid bilayer arrays for studying biomolecular interactions without chemical modification of substrates or membranes. It supports target validation and assay development by providing a reproducible platform for quantifying ligand-receptor binding, such as cholera toxin to ganglioside GM1, with long-term stability and multiplexing capability. The approach reduces mechanistic ambiguity in early discovery by isolating membrane-specific interactions in a controlled, scalable format.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lipid-protein interactions in a defined membrane environment to validate targets like ganglioside GM1.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantitative binding measurements using fluorescence intensity histograms.
- Predictive Value: Facilitates lead identification by measuring binding constants in a disease-relevant membrane system.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized SLB arrays with >75% well occupancy and consistent fluorescent readouts for reliable compound screening.
- Reproducibility: Maintains signal stability over one week, enabling longitudinal assay performance and cross-run comparison.
- Multiplexing Capability: Allows serial deposition of different SSLBs to profile multiple lipid targets in a single array format.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses natural membrane particles (e.g., myelin-derived lipid rafts) to study cell-specific membrane components in pathophysiological contexts.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by enabling biomarker-aligned assays, such as ganglioside enrichment in lipid rafts.
- Risk De-risking: Supports go/no-go decisions by providing predictive binding data from native-like membranes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical profiling, particularly for membrane-associated targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of lipid-mediated mechanisms by isolating bilayer properties from cellular complexity.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs via fluorescence intensity of individual SSLBs for hit confirmation.
- Analytics: Enables binding constant determination through histogram analysis of SSB intensities under varying ligand concentrations.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by using natural membrane particles to reflect disease-relevant lipid composition.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for multiple targets via sequential deposition without substrate re-functionalization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target-ligand interactions by reducing false positives from non-specific binding.
- Operational Value: Ensures standardization and scalability through bead-based self-assembly and squeegee purification.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling high-content screening with minimal reagent consumption.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of membrane targets based on quantitative interaction data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid vesicle preparation, bead functionalization, and fluorescence microscopy.
- Depends on access to microfabricated microwell arrays and controlled extrusion equipment for vesicle sizing.
- Necessitates standardization of washing and blocking steps (e.g., BSA incubation) to minimize noise across arrays.
- Adaptation to different membrane systems requires optimization of bead-to-lipid ratios and incubation times.
- Practical limitation: Array occupancy is typically >75%, leaving some wells empty, which must be accounted for in data analysis.
