Vorming van biomembraan Microarrays met een zuigmond-gebaseerde Vergadering Methode
8 mei 2014
Ondersteunde lipide dubbellagen en natuurlijke membraan deeltjes zijn handig systemen die de eigenschappen van celmembranen kunnen benaderen en diverse analytische strategieën worden opgenomen. Hier laten we een werkwijze voor het bereiden microarrays samengesteld ondersteunde lipide-bilaag beklede SiO2 parels, fosfolipide vesicula of natuurlijke membraan deeltjes.
Het algemene doel van deze procedure is om bio membraan micro-arrays te creëren met behulp van een eenvoudige bereidingsmethode. Dit wordt bereikt door eerst silica-kralen te coaten met lipide dubbellaag membranen. De tweede stap van de procedure is om de met lipiden beklede kralen op het siliconen micro-well substraat te deponeren.
De derde stap is om kralen die zich niet in micro-wells bevinden te verwijderen, met behulp van een polymethyl suboxaan squeegee. De laatste stap is om de met lipiden beklede kralen arrays te beeld met behulp van fluorescentiemicroscopie. Uiteindelijk kan deze methode worden gebruikt om bindingsconstanten voor toxine-lipide interacties te bepalen met behulp van een array beeldvormingsbenadering.
Deze methode kan worden gebruikt om arrays van sferische ondersteunde lipide dubbellagen en natuurlijke membraan deeltjes die zijn afgeleid van cellen te creëren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden is dat behalve de fabricage van de micro-wells, de techniek geen chemische modificatie vereist van zowel het substraat als de lipide membranen om ruimtelijk gedefinieerde bio membraan arrays te creëren. De toepassingen van deze techniek kunnen worden uitgebreid tot label-free detectie van lipide-eiwit interacties met behulp van oppervlakteplasma en resonantie op basis van nanometrische metaal gat arrays.
Hoewel deze methode inzicht kan bieden in lipide-eiwit interacties, kan deze ook worden toegepast op andere systemen zoals studies van cellulaire focale adhesie, Micro-well arrays en squeegee preparaties worden gedetailleerd beschreven in het tekstprotocol. Deze video begint met de bereiding van vesiculen. Eerst meng in een kleine glazen viaal de component lipiden voor de vesiculen.
Een totaal van een halve milligram lipide is in deze oplossing onder vacuüm gedroogde de mix voor zes uur. Maak vervolgens een 0,1 molaire natriumchloride oplossing en voeg een halve milliliter toe aan de gedroogde lipiden. Laat de mix overnacht incuberen bij kamertemperatuur.
De volgende dag, vortex de mix om de vesiculen te suspenderen. Sonificeer vervolgens de mix gedurende 20 minuten in een bad, sonificeer bij kamertemperatuur. Na de sonificatie, extrudeer de suspensie door een 100 nanometer polycarbonaat membraan filter.
Laat de suspensie in totaal 17 keer door de extrusie filter gaan. Bewaar vervolgens de geextrudeerde vesiculen in een glazen viaal bij vier graden Celsius. Eerst met behulp van 700 nanometer diameter siliciumdioxide kralen.
Maak een suspensie van 15 miljard kralen in 0,1 molaire natriumchloride. Vortex de suspensie en centrifugeer deze vervolgens 20 minuten bij 1700 Gs en gooi de supernatant weg. Herhaal de wassing door de kralen op te schorsen in nog een milliliter zout oplossing en ze nog eens 20 minuten te laten draaien.
Herhaal het proces vervolgens een derde keer om de sferische ondersteunde lipide dubbellagen of SSB's te vormen. Meng 25 microliters van de siliciumdioxide kralensuspensie met 200 microliters van de vesikel suspensie uit de vorige sectie. Vortex de mix en laat deze een uur incuberen bij kamertemperatuur. Centrifugeer vervolgens de mix gedurende 20 minuten bij 1700 Gs.
Gooi de supernatant weg. Het pellet is roze vanwege gebroken vesiculen met row DPPE op de kralen. Resuspendeer het in 225 microliters PBS bij PH 7,4.
Herhaal de centrifugatie en resuspensie stappen twee keer om de ongebroken vesiculen te verwijderen en de creatie van de SSB's te voltooien. Verdeel wafers van micro-well arrays in rechthoekige stukken met elk vier tot zes arrays. Vortex vervolgens de SSLB suspensie uit de vorige sectie en breng 10 microliters over naar elke micro-well array.
Wacht een uur tot de SSB's zich hebben gesetteld. Was vervolgens de array chips voorzichtig met PBS en dompel de array onder in PBS met behulp van de squeegee die vijf keer over het oppervlak van de ondergedompelde chips glijdt. Dit verwijdert SLP's die zich niet in de micro-wells bevinden.
Pak vervolgens elke array chip met behulp van een pincet en schud voorzichtig de PBS er af. Breng het vervolgens over naar een nieuwe PBS bad. De bovenste oppervlakken van de chips moeten nat blijven.
Verwijder een chip uit het bad en veeg weg. Verwijder het grootste deel van de PBS met behulp van een laboratorium doek. Laat genoeg PBS over om de array gehydrateerd te houden.
Voeg nu 200 microliters BSA oplossing toe aan de array om niet-specifieke binding te blokkeren. Laat de array een uur incuberen. Verwijder vervolgens de BSA met behulp van een micropipet en voeg 200 microliters cholera toxine oplossing toe.
Breng vervolgens de array terug naar de bevochtigde kamer. Wacht nog een uur, was vervolgens de array met PBS en veeg het overtollige PBS weg met behulp van een lap. Plaats vervolgens de array chip op een standaard microscoop slide en bevestig een 24 bij 40 millimeter vierkant dekglas op de array en ga door met beeldvorming.
Beeldanalyse kan worden gedaan met behulp van de Image J. Geautomatiseerde deeltjesanalyse functies. Daarna, voor elke array, vat de gemiddelde intensiteiten van de individuele SSB's samen als histogrammen. Na het gebruik van de omschreven methoden, toont een oppervlakte van 100 micron op een array 936 SSB's.
Terwijl bezettingsgegevens werden berekend en een histogram van SSLB fluorescente intensiteiten werd gegenereerd na een week in opslag. Dezelfde array werd opnieuw geanalyseerd op dezelfde manier, en er was geen verandering in fluorescente intensiteiten of array bezetting. Sequentiële depositie van verschillende SSB's met verschillende identificerende markeringen was ook mogelijk met de omschreven methoden.
De tweede SSB's werden gedeponeerd op één tiende. De concentratie van de eerste SSB's die werd gedeponeerd. Een overlay van beide markers wordt getoond voor een experiment.
Arrays werden gemaakt met SSB's met verschillende concentraties van GM één en blootgesteld aan een vaste concentratie van cholera toxine. Het omgekeerde werd ook uitgevoerd om de evenwichtsdissociatieconstante te bepalen. Voor GM één.
Cholera toxine binding arrays kunnen ook worden gemaakt van natuurlijke bio membranen, zoals deze array gemaakt van
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het creëren van bio-membraan microarrays met behulp van ondersteunde lipide dubbellagen. Het proces omvat het coaten van silica-beads met lipide dubbellagen en het aanbrengen hiervan op een substraat van siliconen microwells.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biofysica
- Analytische chemie
Achtergrond
- Ondersteunde lipide dubbellagen bootsen de eigenschappen van celmembranen na.
- Natuurlijke membraandeeltjes kunnen worden gebruikt in diverse analytische strategieën.
- Microarrays vergemakkelijken de studie van biomoleculaire interacties.
- Fluorescentiemicroscopie wordt toegepast voor het beelden van de arrays.
Doel van de studie
- Om een eenvoudige methode te ontwikkelen voor het prepareren van bio-membraan microarrays.
- Om het mogelijk te maken bindingsconstanten voor toxine-lipide interacties te bepalen.
- Om de analytische mogelijkheden bij het bestuderen van membraandynamiek te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Het coaten van silicabeads met lipide-dubbellaagmembranen.
- Het plaatsen van lipide-gecoate beads op een substraat van silicone microwells.
- Het verwijderen van beads buiten de microwells met een polymethylsiloxaan-trekker.
- Het afbeelden van de lipide-gecoate bead-arrays met fluorescentiemicroscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle preparatie van microarrays gecoat met een lipide dubbellaag.
- Gedemonstreerde beeldvorming van lipide-gecoate kraal-arrays.
- Potentiële toepassing bij het bestuderen van lipide-interacties met toxines.
- Biedt een eenvoudige en effectieve methodologie voor onderzoekers.
Conclusies
- De methode maakt de creatie van functionele bio-membraan microarrays mogelijk.
- Het kan worden ingezet voor diverse analytische toepassingen binnen de neurowetenschappen en biologie.
- Toekomstige studies kunnen uitbreiden op de interacties die met deze methode worden bestudeerd.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Deze methode maakt de creatie mogelijk van stabiele, hoogdichte arrays van ondersteunde lipide dubbellagen voor het bestuderen van biomoleculaire interacties zonder chemische modificatie van substraten of membranen. Het ondersteunt doelwitvalidatie en assay-ontwikkeling door een reproduceerbaar platform te bieden voor het kwantificeren van ligand-receptorbinding, zoals cholera toxine aan ganglioside GM1, met langetermijnstabiliteit en multiplexcapaciteit. De aanpak vermindert mechanistische ambiguïteit in vroege discovery-fasen door membraanspecifieke interacties te isoleren in een gecontroleerd, schaalbaar formaat.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar lipide-proteïne-interacties in een gedefinieerde membraanomgeving mogelijk om targets zoals ganglioside GM1 te valideren.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie via kwantitatieve bindingsmetingen met behulp van fluorescentie-intensiteitshistogrammen.
- Voorspellende waarde: Faciliteert lead-identificatie door bindingsconstanten te meten in een ziekterellevant membraansysteem.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Produceert gestandaardiseerde SLB-arrays met >75% bezetting van de wells en consistente fluorescentie-uitlezingen voor betrouwbare screening van verbindingen.
- Reproduceerbaarheid: Handhaaft signaalstabiliteit gedurende één week, wat longitudinale assayprestaties en vergelijking tussen verschillende runs mogelijk maakt.
- Multiplexing-capaciteit: Maakt seriële depositie van verschillende SSLB's mogelijk om meerdere lipide-doelwitten in één enkel array-formaat te profileren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Maakt gebruik van natuurlijke membraandeeltjes (bijv. myeline-afgeleide lipid rafts) om celspecifieke membraancomponenten in pathofysiologische contexten te bestuderen.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen fundamenteel onderzoek en preklinisch werk door assays mogelijk te maken die zijn afgestemd op biomarkers, zoals de verrijking van gangliosiden in lipid rafts.
- Risicoreductie: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door voorspellende bindingsgegevens van native-achtige membranen te leveren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische profilering, in het bijzonder voor membraangeassocieerde targets.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van lipidestuurde mechanismen door bilayer-eigenschappen te isoleren van de cellulaire complexiteit.
- Screening: Levert assay-klare, kwantitatieve resultaten via de fluorescentie-intensiteit van individuele SSLB's voor hit-bevestiging.
- Analytica: Maakt bepaling van de bindingsconstante mogelijk door histogramanalyse van SSB-intensiteiten bij variërende ligandconcentraties.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische validatie door gebruik te maken van natuurlijke membraandeeltjes die de ziekterelateerde lipidencompositie weerspiegelen.
- Herbruikbaarheid op bedrijfsniveau: Fungeert als een herbruikbaar platform voor meerdere targets via sequentiële depositie zonder refunctionalisering van het substraat.
Operationele en Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in target-ligandinteracties door het aantal fout-positieven door aspecifieke binding te verminderen.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en schaalbaarheid door bead-gebaseerde zelfassemblage en zuivering met een trekker.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door high-content screening mogelijk te maken met een minimaal verbruik van reagentia.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van membraantargets op basis van kwantitatieve interactiegegevens.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de preparatie van lipide vesikels, bead-functionalisatie en fluorescentiemicroscopie.
- Afhankelijk van toegang tot microgefabriceerde microwell-arrays en gecontroleerde extrusieapparatuur voor het bepalen van de vesikelgrootte.
- Vereist standaardisatie van was- en blokkeringsstappen (bijv. BSA-incubatie) om ruis over de arrays te minimaliseren.
- Aanpassing aan verschillende membraansystemen vereist optimalisatie van bead-lipideverhoudingen en incubatietijden.
- Praktische beperking: De bezetting van de array is doorgaans >75%, waardoor sommige wells leeg blijven, wat in de data-analyse moet worden meegenomen.
