Name: Een restrictie-enzym Based Klonen Methode om de Beoordelen In vitro Replicatie Capaciteit van HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Virussen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Leer een restrictie-enzym gebaseerde kloonmethode om de replicatiecapaciteit van HIV-1 Gag-MJ4 chimerische virussen in vitro te beoordelen. Deze techniek helpt onderzoekers bij het bestuderen van virale pathogenese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De onderzoekers danken alle vrijwilligers in Zambia die aan dit onderzoek hebben deelgenomen en al het personeel van het Zambia Emory HIV Research Project in Lusaka die dit onderzoek mogelijk hebben gemaakt. De onderzoekers willen Jon Allen, Smita Chavan en Mackenzie Hurlston bedanken voor hun technische assistentie en beheer van monsters. We willen ook Dr. Mark Brockman bedanken voor zijn discussies en genereuze donatie van de GXR25 cellen.
Dit onderzoek werd gefinancierd door R01 AI64060 en R37 AI51231 (EH) en de International AIDS Vaccine Initiative. Dit werk werd gedeeltelijk mogelijk gemaakt door de genereuze steun van het Amerikaanse volk via de United States Agency for International Development (USAID). De inhoud is de verantwoordelijkheid van de auteurs van het onderzoek en geeft niet noodzakelijkerwijs de opvattingen weer van USAID of de Amerikaanse overheid. Dit werk werd ook gedeeltelijk ondersteund door de Virology Core bij het Emory Center for AIDS Research (Grant P30 AI050409). DC en JP werden gedeeltelijk ondersteund door Action Cycling Fellowships. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Yerkes National Primate Research Center basissubsidie (2P51RR000165-51). Dit project werd ook gedeeltelijk gefinancierd door het National Center for Research Resources P51RR165 en wordt momenteel ondersteund door het Office of Research Infrastructure Programs/OD P51OD11132.

1 Versterking van de HIV-1 gag Gene uit Infected, Frozen Plasma <ol><li> Uittreksel viraal RNA in 140 gl ontdooid HIV-1 geïnfecteerde plasma middels een extractie kit. <ol><li> Indien haalbaar, onmiddellijk overgaan tot cDNA-synthese na RNA-extractie als onbevroren viraal RNA levert de beste versterking resultaten. Indien mogelijk ingesteld PCR Master Mix voor de eerste ronde van DNA amplificatie en bewaar bij 4 ° C voordat viraal RNA extractie. </li></ol></li><li> Reverse transcriptie-cDNA uit RNA en amplificeren eerste ronde DNA producten middels reverse-transcriptase en een thermostabiel DNA polymerase in een eenstaps RT-PCR. <ol><li> Neem RNA van -80 ° C vriezer (als bevriezing nodig was) en even ontdooien bij kamertemperatuur en breng vervolgens in koud blok. Breng 5 ul van RNA aan elke PCR buis die 45 gl master mix tot een eindvolume van 50 pi geven. Onmiddellijk plaatst resterende RNA monsters in -80 ° C vriezer. </li><li> Na enzym eenT OEGEVOEGDE de eerste ronde PCR Master Mix (tabel 1A), 45 pi aliquot in elk dunwandige PCR amplificatie buis voor het aantal gewenste reacties. Zorg ervoor dat PCR-buisjes met individuele caps te gebruiken en niet te strippen caps minimale kruisbesmetting tussen de monsters te garanderen. Plaats PCR buizen in een koud blok naar de temperatuurgevoelige RT enzym RNA template beschermen. Opmerking: De monsters moeten worden uitgevoerd in drievoud om adequaat te proeven van de virale quasispecies. Het is ook belangrijk om een ​​product met een high fidelity DNA polymerase-enzym te gebruiken om PCR geïntroduceerd verkeerde incorporatie minimaliseren. Verwijzen wij u naar de lijst met reagentia voor het aanbevolen product. </li><li> Na RNA template is toegevoegd aan alle reageerbuizen, transfer PCR buizen een thermocycler voor amplificatie met het cyclusprogramma in Tabel 1B beschreven. Opmerking: Het product van de amplificatie wordt gebruikt in een tweede ronde geneste PCR. </li></ol></li><li> Voer een geneste second-round PCR amplificatie met 1 pl van de eerste ronde PCR-amplificatie (1.2) als DNA-matrijs. <ol><li> Aliquot 49 ul van tweede-ronde-PCR master mix (tabel 2A) aan elke dunwandige PCR-buis voor het aantal reacties gewenst. Breng 1 pl van de eerste ronde PCR amplificatie aan elke reactiebuis een eindvolume van 50 pi geven. Opmerking: Dit zal als template DNA te dienen voor de tweede-ronde versterking. Het is ook belangrijk om een ​​DNA polymerase met een zeer hoge betrouwbaarheid en proeflezen mogelijkheden benutten om PCR geïntroduceerd verkeerde incorporatie minimaliseren. Verwijzen wij u naar de lijst met reagentia voor het aanbevolen product. </li><li> Transfer tweede ronde PCR-mix te thermocyclusinrichting en run-programma in Tabel 2B beschreven. Opmerking: Na voltooiing van het programma, de producten van deze reactie worden uitgevoerd op een agarose gel om de productie van het product te bevestigen. </li></ol></li><li> Voeg 3 ul 5x loading dye 5 &amp; #181, l 50 gl tweede ronde reactievolume en draaien met 120 V op een 1% agarose TAE-gel bevattende een UV-fluorescerende DNA vlek tot banden worden opgelost. Visualiseer 1,6 kb banden op een blauw licht verlichting (zie figuur 1A). </li><li> Voer de resterende 45 pl reactievolume op een 1% agarose TAE-gel die een DNA vlek en uitsnijden passende banden met een schoon scheermesje. <ol><li> Extraheer DNA uit de gel slice met een gel zuiveringskit, elueren in nuclease-vrij water, combineer drie positieve reacties per individu en product invriezen bij -20 ° C voor later gebruik. </li></ol></li></ol> 2 Voorbereiding gag Amplicons voor Klonen door invoeren van de nodige beperking Sites <ol><li> Versterken de Long Terminal Repeat (LTR) / 5 &#39;UTR gedeelte van de MJ4 plasmide (zie tabel 3). </li><li> Visualiseer 1,3 kb PCR-producten op verlichting, accijnzen positieve amplicons, gel zuiveren en zoals eerder bevriezenbeschreven (1.4,1.5 zie figuur 1B). </li><li> Maak gesmolten MJ4 LTR- gag ampliconen via &quot;splice-overlap-extensie&quot; PCR (zie tabel 4). </li><li> Visualiseren, accijnzen, te zuiveren, en vries het 3,2 kb ampliconen als in 1.4,1.5 (zie figuur 1C). </li></ol> 3 Klonen Amplified gag Genen in de MJ4, Subtype C, Infectious Molecular Clone <ol><li> Digest 1.5 ug MJ4 plasmide en 1,5 ug gezuiverd LTR- gag PCR product met BclI (methylering gevoelige) restrictie-endonuclease gedurende 1,5 uur bij 50 ° C (zie Tabel 5A). </li><li> Voeg 1 ul van NgoMIV de digestie reactie en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Voeg 5x loading kleurstof restrictiedigestie reacties en langzaam Electrophorèse het totale volume op een 1% agarose TAE-gel die een DNA gel kleuring voor 1-2 uur bij 100 V. zichtbaar, accijns en zuiveren deze banden voor klonering zoals eerder described (zie figuur 2). </li><li> Bereid ligatiereacties met gezuiverd LTR- gag insert en MJ4 vector-DNA bij een 3: 1 insert naar vector verhouding. Ligatiereacties Incubeer overnacht bij 4 ° C (zie Tabel 5B). </li><li> Transformeren JM109 chemisch competente bacteriën ligatieproducten en uitgespreid op LB agar platen met 100 ug / ml ampicilline en groei bij 30 ° C voor 22 + uur. <ol><li> Dooi JM109 competente cellen op ijs gedurende 15 minuten. Label 1.5 ml microcentrifugebuizen en chill op ijs. </li><li> Aliquot 50-100 ul van JM109 cellen pre-gekoelde 1,5 ml microcentrifugebuizen. Voeg 2,5-5 pi ligatie reactie op JM109 cellen, flicking buis licht te mengen en onmiddellijk terug te keren naar het ijs. Incubeer competente cellen met ligatieproduct op ijs gedurende 30 minuten. </li><li> Heat shock 1,5 ml microcentrifuge buisjes die JM109 competente cellen en ligatie reactie in een 42 ° C warmteblok gedurende 45 seconden en terugkeren naar ijs gedurende ten minste 3 minuten. </li><li> Voeg 50 pl SOC media aan elke microcentrifugebuis en plaat het gehele transformatie reactiemengsel op kamertemperatuur LB-agarplaten gesupplementeerd met 100 ug / ml ampicilline. </li><li> Overdrachtsplaten tot een 30 ° C incubator gedurende 20 uur, of totdat kolonies duidelijk gevormd. </li></ol></li><li> Extra geïsoleerde kolonies en groeien in 4 ml LB met 100 ug / ml ampicilline bij 30 ° C voor 22 + uur. </li><li> Spin down kweken bij 3200 xg gedurende 15 min, giet bouillon, en plasmide-DNA te extraheren. </li><li> Om te bevestigen klonen trouw miniprep DNA geknipt met HpaI en NgoMIV restrictie-enzymen in een dubbel digest bij 37 ° C gedurende 2 uur. Analyseer op 1% agarose-TAE gel (zie tabel 5C). </li><li> Type de LTR-gag insertgebied van elk plasmide met de volgende primers: GagInnerF1, GagF2, Rev1, Rev3 en GagR6 (Tabel 6) sequentie identiteit te bevestigen. </li><li> Vergelijk de gekloonde sequenties die zijn verkregen met de bevolking sequenties derived van de eerste gezuiverde amplicon van 1.5.1. Opmerking: Het is belangrijk de replicatie capaciteit van twee onafhankelijke klonen om uiteindelijk na te zorgen dat de in vitro replicatie fenotypes niet door backbone fouten die tijdens het klonen. </li></ol> 4 Generatie en titering replicatiecompetent Gag-MJ4 Chimeric Virussen <ol><li> Genereer replicatie competent virus door transfecteren 1,5 ug van het chimere plasmide MJ4 miniprep DNA in 293T-cellen met een 4: 1 verhouding van Fugene HD zoals beschreven door Prince c.s. 39. </li><li> Titer geoogst virusvoorraden op TZM-bl cellen zoals beschreven hieronder en in Prins et al 39. <ol><li> Plate TZM-bl cellen 24 uur vóór infectie met virus om een ​​30-40% confluente monolayer van cellen op de volgende dag. Dit kan gewoonlijk worden bereikt door toevoeging van 5 x 10 4 cellen in een totaal volume van 800 ul per putje in een 24-well plaat. </li><li> Na het toevoegen van cellen om het goed, beweeg de 24-well plaat naar voren en weer terug, dan van links naar rechts om de cellen efficiënt te distribueren. Nooit swirl - dit zal resulteren in cellen ophopen in het midden van de plaat. </li><li> De volgende dag, bereid 1% FBS in DMEM; deze wordt gebruikt om verdunnen DEAE-dextraan en virusvoorraden verdunnen. De DEAE-Dextran is 10 mg / ml of 125x, en een uiteindelijke concentratie van 80 ug / ml of 1x gewenst. </li><li> Neem virus voorraad te testen van -80 ° C vriezer en plaats op shaker te ontdooien op kamertemperatuur. </li><li> Met behulp van een multichannel pipet, serieel verdund virus voorraden in een ronde bodem weefselkweek behandelde plaat met 96 putjes met deksel. Dit is een 3-voudige verdunning protocol. Zie tabel 7 voor de verdunning regeling. </li><li> Verwijder het afdrukmateriaal uit gezaaid TZM-bl 24-well platen met behulp van een vacuüm aspirator zorg ervoor celmonolaag niet te verstoren. Verwijder het medium Slechts van een 24-well plaat op een moment, zodat cellenniet uitdrogen. </li><li> Voeg 150 ul van 1 x DEAE-Dextran + 1% FBS in DMEM mengsel aan elk putje met een 1.000 III pipet. Gebruik geen herhaling pipet als dit verstoort de monolaag. </li><li> Voeg 150 pi van elke virusverdunning de juiste goed. Virus In het midden van het putje en schud zachtjes gelijkmatig verdelen virus in de cel monolaag. Incubeer geïnfecteerde cellen gedurende 2 uur in een weefselkweek incubator bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Na 2 uur incubatie wordt 0,5 ml 10% FBS in DMEM aan elk putje en platen incubator keren nog eens 48 uur. </li><li> Na 48 uur moeten de cellen 100% confluent zijn. Omdat MJ4 is een replicatie competent virus, zal er enige celdood, maar dit is te verwachten. </li><li> Verwijder het afdrukmateriaal uit elk putje en voeg 400 ul / putje van de vaststelling oplossing (zie tabel 8A voor recept). Fix slechts een plaat tegelijk. Voeg fixeeroplossing met een 1.000 ul pipet en laat zitten voor 5 min bijkamertemperatuur. </li><li> Verwijder fixeeroplossing en was 3x met PBS met Ca 2 + / Mg 2 +. Gebruik een spuitfles voorzichtig toevoegen PBS aan de zijkant van de put te verstoren de monolaag. Na de derde wasbeurt, vlek plaat droog op absorberend papier. </li><li> Voeg 400 ul / putje kleuroplossing (zie Tabel 8B voor recept) aan elk putje van de 24-well plaat en incubeer bij 37 ° C gedurende ten minste 2 uur. Langere incubatietijd tijden zijn aanvaardbaar, maar incubatietijd moeten consistent tussen titering experimenten worden gehouden. </li><li> Was 2x met PBS met Ca 2 + / Mg 2 + en scoren voor infectie, of voeg PBS en bewaar bij 4 ° C voor het scoren later. Platen kunnen bij 4 ° C bewaard tot vier dagen, zolang de monolaag gehydrateerd blijft. </li><li> Om te scoren voor de infectie, gebruik maken van een permanent marker op putjes van de 24-well plaat verdelen in kwadranten. Tel alle blauwe cellen binnen een gezichtsveld, met een totale vergroting van 200X, eenmaal inelk van de vier kwadranten van een goed. </li><li> Bereken infectieuze eenheden per ul als volgt: [(# blauwe cellen / 4) x 67] / (pi virus toegevoegd) = IE / ul. Zie Tabel 8C voor volume gl virus toegevoegd aan elk putje. Gemiddeld aantal putjes tezamen; de getallen moet betrekkelijk Vertaald een nauwkeurige titratie. </li></ol></li></ol> 5 Voorbereiding van Cultuur Media en Voortplanting van GXR25 Cellen voor in vitro replicatie Assay <ol><li> Bereid compleet RPMI (cRPMI) voor de vermeerdering van GXR25 cellen. LET OP: Het is uiterst belangrijk om de cultuur GXR25 cellen ten minste 4 maanden voorafgaand aan de geplande replicatie-experimenten (zie tabel 9). </li><li> Split cellen 1:10 twee keer per week en onderhouden celdichtheid van 1 x 05-2 oktober x 10 6 cellen / ml. </li></ol> 6 In vitro replicatie van Gag-MJ4 Hersenschimmen in GXR25 (CEM-CCR5-GFP) Cellen <ol><li> De dag voor de infection, splitsen cellen om een concentratie van 2-3 x 10 5 cellen / ml, zodat zij in logaritmische groei op de dag van de infectie. </li><li> Op de dag van infectie te verwijderen virus voorraden van -80 ° C vriezer en ontdooien. Bereken de hoeveelheid virus die nodig is van elke stock volgens de IU / ul titer van TZM-bl cell assay om 5 x 10 5 GXR25 cellen te infecteren bij een multipliciteit van infectie van 0,05 met de volgende formule: Volume van het virus voor infectie (pi) = 1 pi / X IE x 0,05 x 500.000 OPMERKING: We kiezen een MOI van 0,05 en resulteert in een logaritmische groeifase voor alle virussen die we hebben getest. Het is belangrijk initiële experimenten om de optimale MOI bepalen logaritmische groei vangen van het virus te testen. </li><li> Verdun virus in cRPMI tot een volume van 100 ul (om een ​​0,05 MOI te bereiken) en voeg in een putje van een V-bodem weefselkweek behandelde plaat met 96 putjes. Opmerking: Omvat zowel een positive (MJ4 WT geïnfecteerde) en een negatieve (mock geïnfecteerde cellen) controle in elke set replicatie experimenten. Het opzetten van de plaat zodanig dat elke andere kolom is leeg om kruisbesmetting tussen de putten te beperken. De positieve controle is noodzakelijk, zoals later als een standaard worden gebruikt om de replicatie hellingen, die een maat is voor de replicatie snelheid van experimentele herhalingen zijn normaliseren. </li><li> Telling GXR25 cellen middels een geautomatiseerde celtelinrichting. Bereken het aantal cellen nodig totaal voor alle virussen (5 x 10 5 x # infecties). Aliquot het gewenste volume in een 50 ml conische buis en gecentrifugeerd om cellen te pelleteren. Bereken altijd voor 25% meer infecties dan nodig is. </li><li> Zuig media zorgvuldig en resuspendeer in cRPMI bij een concentratie van 5 x 10 5 cellen / 100 ul. </li><li> Pipet cellen in een steriele bak en meng. Een multi-kanaal pipet 100 ul cellen in elk putje van de 96-well plaat met de verdunde virus. Mix grondig. </li><li> Voeg 2 pl van 5 mg / ml (100x) oplossing van polybreen aan elke well en meng grondig cellen. </li><li> Incubeer bij 37 ° C in weefselkweek incubator met 5% CO2 gedurende 3 uur. </li><li> Om geïnfecteerde cellen te wassen, centrifuge 96-well V-bodemplaat cellen neer. Dan verwijder voorzichtig 150 pi van het medium en te vervangen door verse 150 ul van cRPMI zonder verstoring van de cel pellet. Herhaal 2 keer (inclusief centrifugatie) cellen voldoende wassen. </li><li> Na de laatste centrifugatie en toevoeging van 150 ul cRPMI, resuspendeer de celpellet met een multichannel pipet en voeg de gehele cel / virus mengsel (ongeveer 200 pl) van elk putje afzonderlijk 800 gl cRPMI in een putje van een 24-well tissue kweekplaat. </li><li> Place plaat in 5% CO 2 weefselkweek incubator bij 37 ° C. </li><li> Elke twee dagen, verwijder 100 ul supernatant van buitenzijde kweekputje en overbrengen naar een 96-well U-Bottom plaat en opslag bevroren bij -80 ° C tot actief virus kwantificering assay. OPMERKING: Zorgvuldige regeling van supernatanten in 96-well platen zal voor multi-channel pipet overdracht van kweeksupernatanten tijdens virion kwantificering via een radioactief reverse transcriptase (RT) assay. Elke plaat moeten monsters uit een infectie standaard bevatten om inter-plaat variatie normaliseren in de RT-assay uitlezing. </li><li> Na het verwijderen van elk 100 pl monster, split cellen 1: 2 grondig resuspenderen cellen en verwijderen helft van de resterende volume (450 pl). Herstel oorspronkelijke volume (1 ml) door toevoeging van 550 pl vers cRPMI aan elk putje. </li></ol> 7 Analyse van Reverse Transcriptase (RT) in celkweeksupernatanten Protocol aangepast van Ostrowski et al 40. <ol><li> Opgezet biologische veiligheid kap in een BSL-3-faciliteit voor gebruik met radioactieve stoffen. <ol><li> Leg absorberend papier in hood en vervang aspirator voor aspirator aangewezen voor radioactieve gebruik. Opmerking: Alle radioactief afval moet goed worden afgevoerd met het volgens de veiligheidsvoorschriften. </li></ol></li><li> Voeg 1-2 ul van 10 mCi / ml [α- 33P] dTTP en 4 ui van 1 M dithiothreitol (DTT) aan elke 1 ml van RT master mix (zie tabel 10 en Ostrowski et al. 40). </li><li> Meng zorgvuldig elk 1,5 ml microcentrifugebuisje van RT master mix, DTT, en [α- 33P] dTTP met een 1.000 ul pipet overgebracht in een steriele trog. </li><li> Breng 25 pl gelabelde RT mengen in elke well van 96-well dunwandige PCR plaat. Opmerking: Inclusief ruimte voor een positieve controle (MJ4 WT infectie) en negatieve controle (Mock-infectie). </li><li> Voeg 5 ul van elk supernatant van de PCR-plaat met de RT master mix. </li><li> Verbinding PCR plaat met zelfklevende folie deksel en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C in een thermocycler. Om veiligheidsredenen, rinse pipet tips met Amphyl en gooi tips in kleine container met Amphyl afval, die later zal worden vernietigd radioactief afval. </li><li> Na incubatie kleine gaatjes in het folie deksel met een 200 ul multichannel pipet. Opmerking: Als pipetuiteinden raken vloeistof in goed, vervang tips voordat u naar de volgende kolom of rij. </li><li> Mix monsters 5x en overdracht 5 ul van elk monster voor de DE-81 papier. Lucht drogen 10 minuten. </li><li> Was blots 5x met 1x SSC (natriumchloride, natriumcitraat), en vervolgens 2x met 90% ethanol bij 5 min per wasbeurt. Laat drogen. <ol><li> Plaats elke vlek in een aparte container wassen, zoals een sandwich opbergdoos, voeg voldoende wasbuffer (1 x SSC en 90% EtOH) ter dekking blot en schud 5 minuten. </li><li> Giet wasbuffer in aparte container en herhaal. Opmerking: De eerste 3 wast zijn radioactief beschouwd en moeten worden afgevoerd. De laatste 2 wasbeurten kan worden afgevoerd regelmatig. </li></ol></li><li> Eenmaal droog, autoefully wikkel blot in Saran wrap en blootstellen aan een phosphoscreen in een goed afgesloten cassette nacht bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Analyseer phosphoscreens met een fosforimager en kwantificeren radioactieve transcripties. </li><li> Teken een cirkel rond elke radioactieve signaal met behulp Optiquant software. De grafiek van de Digital Light Unit (EBA) waarden tot replicatie curves genereren. </li><li> Om replicatiecapaciteit scores genereren DLU-waarden log 10 getransformeerde en hellingen werden berekend met het dag 2, 4 en 6 tijdstippen. Replicatie hellingen worden vervolgens gedeeld door de helling van de WT MJ4 om genereren replicatiecapaciteit scores. Het is belangrijk te normaliseren op basis van de MJ4 WT waarden verkregen uit dezelfde RT plaat intra-assay variatie verminderen. </li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Door de lengte en de technische aard van dit protocol, zijn er verschillende stappen die kritiek zijn voor zowel de succesvolle constructie van chimere Gag-MJ4 plasmiden en voor kwantificering van virale replicatie capaciteit zijn. Hoewel het restrictie-enzym gebaseerde klonen strategie voor de invoering van buitenlandse gag genen in MJ4 beschreven in dit protocol heeft tal van voordelen ten opzichte van eerder gebruikte recombinatie gebaseerde methoden, kan het protocol technisch uitdagend zijn als kritische s...

Om zowel de gastheer en virale kenmerken die invloed HIV-1 pathogenese en progressie van het grootste belang voor rationeel vaccinontwerp. De cellulaire immuunreactie is een belangrijk onderdeel van de menselijke immune reactie op HIV-1 infectie. Cytotoxische T lymfocyten (CTL) zijn nodig voor de eerste controle van acute viremie en laat de host een steady state (set point) viral load 1,2 vestigen. Experimentele depletie van deze effectorcellen leidt tot verlies van virale controle 3,4. Ondanks dit, ontsnappen mutaties ontstaan ​​binnen het virale genoom dat CTL erkenning van viraal geïnfecteerde cellen 5-9 ondermijnen. Bepaalde HLA allelen zijn geassocieerd met lagere virale lading en tragere progressie van de ziekte zoals B * 57 B * 27 B * 81 en 10-15. Een deel van het beschermende voordeel van HLA klasse I allelen kan worden toegeschreven aan het feit dat ze gericht functioneel beperkte gebieden van het genoom, zoals Gagen selecteren op ontsnappingsmutaties dat het vermogen van het virus om te repliceren in vitro 16-21 verminderen. Hoewel ontsnapping van het cellulaire immuunsysteem is gunstig voor het virus in de context van de selectie HLA klasse I allel, kan het effect van deze mutaties differentiële gevolgen voor de ontvangende upon overbrenging moet een HLA-mismatch individuele 22,23. Daarom is het begrijpen van de effecten van de verzonden-HLA geassocieerd escape mutaties op de virale replicatie capaciteit zal belangrijk zijn om ons begrip van vroege HIV-1 pathogenese bevorderen. Hoewel er veel vooruitgang is geboekt bij de fitness gebreken van afzonderlijke escape mutaties geassocieerd met specifieke HLA klasse I allelen 24-29 te identificeren en te karakteriseren, natuurlijk voorkomende HIV-1 isolaten zijn unieke en complexe voetafdrukken van HLA-geassocieerde polymorfismen, waarschijnlijk als gevolg van het HLA gemedieerde immuun druk van verschillende immunogenetische achtergronden 30. In apet bestaan ​​analyse Goepfert et al. blijkt dat een accumulatie van HLA-geassocieerde mutaties in het uitgezonden Gag sequenties afgeleid van 88 acuut geïnfecteerde Zambians werd geassocieerd met een vermindering instelling viral load 31. Dit suggereerde dat de overdracht van schadelijke ontsnappingsmutaties, specifiek Gag, HLA-mismatch ontvangers verschaft een klinisch voordeel en kan het gevolg zijn van virale replicatie verzwakt. Moving forward, is het noodzakelijk om te bestuderen hoe complexe combinaties van Gag polymorfismen binnen natuurlijk voorkomende isolaten werken in overleg met de kenmerken van de uitgezonden virus zoals replicatie capaciteit, en hoe vroeg replicatie kunnen op hun beurt van invloed op HIV-1 klinische parameters en de late-fase definiëren pathogenese. Brockman et al. Eerst een verband tussen de replicatie capaciteit van gag-pro sequenties geïsoleerd tijdens de chronische fase infectie en virale lading in zowel subtype C en B-infecties aangetoond32-35. De experimentele benadering gepresenteerd in deze studies, hoewel geschikt voor de behandeling van in vitro replicatie aantal sequenties, verkregen uit chronisch geïnfecteerde individuen, heeft verschillende technische restricties en beperkingen maken het bestuderen van HIV-1 replicatie capaciteit subtype C acuut geïnfecteerde individuen moeilijk. Deze werkwijze berust op de recombinatie van populatiegebaseerde PCR-geamplificeerde sequenties in de subtype B NL4-3 provirus, dat gedeeltelijk afgeleid van LAV, een laboratorium aangepaste virus stock 36. Virusproductie werd bewerkstelligd door co-transfectie van een CEM-gebaseerde T-cellijn 37 met PCR amplicons en gedigereerd delta gag-pro NL4-3 DNA. Deze methode vereist de uitgroei van virus gedurende weken tot maanden, eventueel vertekening de aard van het teruggewonnen virus stock betrekking tot de virale quasispecies in vivo, en derhalve het veranderen van de meting van replicatie capaciteit in vitro. Deze methode is meer geschikt voor het bestuderen van chronisch geïnfecteerde individuen, waar het effectief kiest voor virus met de hoogste replicatieve capaciteit, en wanneer kloneren tal verschillende virale varianten van een groot aantal chronisch geïnfecteerde individuen is vrij arbeidsintensief en derhalve nog niet. Echter, in een acuut geïnfecteerde individu er doorgaans 01:59 varianten aanwezig, en zo het risico van vertekening de aard van het teruggewonnen virus stock elimineren, door in vitro selectie drukken, zorgt voor een nauwkeurigere bepaling van de in vitro replicatie capaciteit. Tweede methode vereist recombineren subtype C gag-pro-sequenties in een subtype B afgeleide ruggengraat en kan backbone onverenigbaarheid biases in de analyse introduceren. Vanwege deze beperkingen moeten grote aantallen sequenties worden geanalyseerd om mogelijke vertekeningen ingevoerd overwinnen. Hier beschrijven we een alternatieve experimentele voorkomendach geschikt voor het bestuderen van sequenties afgeleid van subtype C acuut geïnfecteerde individuen. We gebruiken een restrictie-enzym gebaseerde klonering strategie het gag gen afgeleid van acute infectie tijdstippen van HIV-1 subtype C geïnfecteerde individuen in het subtype C provirale backbone, MJ4 voeren. Het gebruik van MJ4 als gemeenschappelijke backbone waarin gag genen kloneren cruciaal voor de analyse van het subtype C afgeleide sequenties. MJ4 is afgeleid van een primair isolaat 38, en zou dus minder waarschijnlijk vertekening door subtype incompatibiliteit tussen de hoofdketen en gag gen. Bovendien is de benadering van het gebruik van restrictie-enzymen gebaseerde klonering maakt de provirale constructen rechtstreeks in 293T-cellen worden getransfecteerd, en voor het herstel van een klonale virus stock identiek aan de gekloneerde sequentie gag. De methode hieronder weergegeven is een high throughput methode voor het beoordelen van de replicatie capaciteit van subtype C afgeleid Gag-MJ4chimère virussen. Transfectie in 293T-cellen is eenvoudig en terugwinning van virus duurt slechts drie dagen. In vitro replicatie capaciteit getest op dezelfde CEM-CCR5 gebaseerde T-cellijn door Brockman e.a.. 37, maar met belangrijke protocol aanpassingen noodzakelijk voor een succesvolle replicatie subtype C MJ4 chimere virussen. Het gebruik van een geschikte T-cellijn plaats PBMC maakt grote aantallen subtype C MJ4-chimere virussen te testen met hoge assay reproduceerbaarheid. Ten slotte, wordt een radioactief reverse transcriptase assay voor het kwantificeren van virus in het supernatant kosteneffectiever dan met commercieel verkrijgbare p24 ELISA kits. Het geeft ook een hoger dynamisch bereik, die belangrijk zijn voor het detecteren zowel slecht en zeer replicerende virussen binnen dezelfde assay en voor het detecteren van subtiele verschillen in replicatie tussen isolaten. De conclusie is dat de hier gepresenteerde methode toegestaan ​​voorde grondige studie van de replicatie capaciteit van gag sequenties afgeleid van HIV-1 subtype C acuut geïnfecteerde individuen uit Zambia, en zoals geschreven, kan ook worden uitgebreid naar andere subtype C geïnfecteerde populatie te bestuderen. Een hoge mate van variatie in replicatie capaciteit tussen verschillende Gag isolaten waargenomen. Daarnaast konden we een statistisch verband tussen de replicatie capaciteit van het verzonden Gag en setpoint viral load als met CD4 + daling vertonen gedurende een periode van drie jaar 39. Dergelijke resultaten benadrukken het belang van het bestuderen van hoe doorgelaten virale kenmerken, zoals replicatie capaciteit, interactie met de gastheer immuunsysteem pathogenese beïnvloeden tijdens de vroege infectie en integraal voor het ontwikkelen van effectieve interventies vaccin evenals de behandeling zal zijn.

<table><tbody><tr><td colspan="4">PCR Reagents</td></tr><tr><td>GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'</td><td>IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, standard desalt</td></tr><tr><td>VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'</td><td>IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, standard desalt</td></tr><tr><td>GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'</td><td>IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, standard desalt</td></tr><tr><td>BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR 3'</td><td>IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, standard desalt</td></tr><tr><td>MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'</td><td>IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, standard desalt</td></tr><tr><td>MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCCTTCTAGC 3'</td><td>IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, standard desalt</td></tr><tr><td>BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3'</td><td>IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, standard desalt</td></tr><tr><td>GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'</td><td>IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, standard desalt</td></tr><tr><td>For3: 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'</td><td>IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, standard desalt</td></tr><tr><td>GagR6: 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3'</td><td>IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, standard desalt</td></tr><tr><td>Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3'</td><td>IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, standard desalt</td></tr><tr><td>Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA 3'</td><td>IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>25 nmol, standard desalt</td></tr><tr><td>CoolRack PCR 96 XT</td><td>Biocision</td><td>BCS-529</td><td></td></tr><tr><td>CoolRack M15</td><td>Biocision</td><td>BCS-125</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>Fisher</td><td>SH30538FS</td><td>Manufactured by Hyclone</td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>Simport PCR 8 Strip Tubes, Blue (Flat Cap)</td><td>Daigger</td><td>EF3647BX</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III one-step RT-PCR system</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>12574035</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot-start II DNA polymerase</td><td>Fisher</td><td>F-549L</td><td></td></tr><tr><td>PCR Nucleotide Mix</td><td>Roche</td><td>4638956001</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, high gel strength</td><td>Fisher</td><td>50-213-128</td><td></td></tr><tr><td>TAE 10X</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>AM9869</td><td></td></tr><tr><td>Promega 1 kb DNA ladder</td><td>Fisher</td><td>PRG5711</td><td>Manufactured by Promega</td></tr><tr><td>Sybr Safe DNA Gel Stain, 10,000x</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades, single-edged</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td>Manufactured by Surgical Design</td></tr><tr><td>Thermocycler, PTC-200</td><td>MJ Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microbiology &amp; Cloning Reagents</td></tr><tr><td>LB Agar, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth, Lennox</td><td>Fisher</td><td>BP1427-2</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 100 x 15 mm polystyrene Petri dishes</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 14 ml Polypropylene round-bottom tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>NgoMIV restriction endonuclease</td><td>New England BioLabs</td><td>R0564L</td><td></td></tr><tr><td>BclI restriction endonuclease</td><td>New England BioLabs</td><td>R0160L</td><td></td></tr><tr><td>HpaI restriction endonuclease</td><td>New England BioLabs</td><td>R0105L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase, 5 U/&mu;l</td><td>Roche</td><td>10799009001</td><td></td></tr><tr><td>JM109 competent cells, >108 cfu/&mu;g</td><td>Promega</td><td>L2001</td><td></td></tr><tr><td>PureYield plasmid miniprep system</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0 Blue Light Transilluminator</td><td>Invitrogen</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 18 centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cell Culture Reagents</td></tr><tr><td>Amphyl cleaner/disinfectant</td><td>Fisher</td><td>22-030-394</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD, 1 ml</td><td>VWR</td><td>PAE2311</td><td>Manufactured by Promega</td></tr><tr><td>Hexadimethrine bromide (Polybrene)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>Costar Plates, 6-well, flat</td><td>Fisher</td><td>07-200-83</td><td>Manufactured by Corning Life</td></tr><tr><td>Costar Plates, 24-well, flat</td><td>Fisher</td><td>07-200-84</td><td>Manufactured by Corning Life</td></tr><tr><td>Costar Plates, 96-well, round</td><td>Fisher</td><td>07-200-95</td><td>Manufactured by Corning Life</td></tr><tr><td>Flasks, Corning filter top/canted neck, 75 cm2</td><td>Fisher</td><td>10-126-37</td><td></td></tr><tr><td>Flasks, Corning filter top/canted neck, 150 cm2</td><td>Fisher</td><td>10-126-34</td><td>Manufactured by Corning Life</td></tr><tr><td>Conical Tubes, 50 ml, blue cap</td><td>Fisher</td><td>14-432-22</td><td>Manufactured by BD Biosciences</td></tr><tr><td>Conical Tubes, 15 ml, blue cap</td><td>Fisher</td><td>14-959-70C</td><td>Manufactured by BD Biosciences</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Fisher</td><td>MT25052CI</td><td>Manufactured by Mediatech</td></tr><tr><td>RPMI, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin/Glutamine, 100x</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS with magnesium and calcium, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>14040-133

een restrictie-enzym based klonen methode om de beoordelen<em&gt; in vitro</em&gt; replicatie capaciteit van hiv-1 subtype c gag-mj4 chimeric virussen

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

Het beschermende effect van veel HLA klasse I-allelen op HIV-1 pathogenese en ziekteprogressie wordt, gedeeltelijk, toegeschreven aan hun vermogen om geconserveerde delen van het HIV-1 genoom te targeten die moeilijk ontsnappen. Sequentie-veranderingen die worden toegeschreven aan cellulaire immuundruk ontstaan over het hele genoom tijdens infectie en, indien gevonden binnen geconserveerde gebieden van het genoom zoals Gag, kunnen de vermogen van het virus om zich te repliceren in vitro beïnvloeden. Transmissie van HLA-gelinkte polymorfismen in Gag naar HLA-onverenigbare ontvangers is geassocieerd met verlaagde set point virale belastingen. We veronderstelden dat dit te wijten kan zijn aan een verminderde replicatievermogen van het virus. Hier presenteren we een nieuwe methode voor het beoordelen van de in vitro replicatie van HIV-1 zoals beïnvloed door het gag gen geïsoleerd van acute tijdstippen van subtype C geïnfecteerde Zambianen. Deze methode gebruikt restrictie-enzym-gebaseerde klonering om het gag gen in een gewone subtype C HIV-1 provirale ruggengraat, MJ4, in te voegen. Dit maakt het geschikter voor de studie van subtype C sequenties dan eerdere op recombinatie gebaseerde methoden die de in vitro replicatie van chronisch afkomstige gag-pro sequenties hebben beoordeeld. Niettemin kan het protocol gemakkelijk worden aangepast voor studies van virussen van andere subtypen. Bovendien beschrijft dit protocol een robuuste en reproduceerbare methode voor het beoordelen van de replicatievermogen van de Gag-MJ4 chimere virussen op een CEM-gebaseerde T-cel lijn. Deze methode werd gebruikt voor de studie van Gag-MJ4 chimere virussen afkomstig van 149 subtype C acuut geïnfecteerde Zambianen en heeft de identificatie van residuen in Gag die de replicatie beïnvloeden, mogelijk gemaakt. Belangrijker nog, de implementatie van deze techniek heeft een dieper begrip mogelijk gemaakt van hoe virale replicatie parameters van vroege HIV-1 pathogenese zoals set point virale lading en longitudinale CD4+ T-cel afname bepaalt.

Om dit protocol, dat een proviraal plasmide in staat is het monteren van een volledig functionele, besmettelijke Gag-MJ4 hersenschimmen creëert goed uit te voeren, moet grote zorg worden genomen om de geschikte PCR amplicons genereren. Bepalen of de PCR de juiste maat gag amplicon heeft gegenereerd is cruciaal. Producten moeten binnen 100 basenparen (bp) van de ongeveer 1.700 bp amplicon weergegeven in figuur 1A. De exacte lengte van dit fragment is afhankelijk van het gag-gen onder st...

HIV-1-pathogenese wordt bepaald door zowel virale kenmerken als genetische factoren van de gastheer. Hier beschrijven we een robuuste methode die reproduceerbare metingen mogelijk maakt om de impact van de gag gensequentieverschil op de in vitro replicatiecapaciteit van het virus te beoordelen.

Een restrictie-enzym Based Klonen Methode om de Beoordelen<em&gt; In vitro</em&gt; Replicatie Capaciteit van HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Virussen

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Het algemene doel van deze procedure is om gag-genen afkomstig van personen geïnfecteerd met subtype-C HIV1 in een replicatiecompetent HIV1-plasmid te incorporeren, om zo het effect van gag-sequentiepolymorfismen op de HIV1-replicatiecapaciteit in vitro te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst het gag-gen uit het plasma van de patiënt te amplificeren. De tweede stap is het klonen van de gag-sequentie van de patiënt in de replicatiecompetente infectieuze moleculaire kloon MJ-four. Vervolgens wordt het gag-MJ-four chimeer-plasmid getransfecteerd om infectieuze virale stocks te genereren, waarna de titer wordt bepaald om de infectiviteit op een indicator-cellijn te beoordelen. De laatste stap is het meten van de in vitro replicatiecapaciteit in de GXR-25 T-cellijn. Uiteindelijk wordt een radiogemarkeerde reverse transcriptase-assay gebruikt om de virionproductie in de tijd te kwantificeren om zo de virale replicatiekinetiek te visualiseren.De methode die we vandaag gaan beschrijven, kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen binnen het HIV-onderzoeksveld. Hiertoe behoort het definiëren van de determinanten van de replicatieve fitness van HIV en het begrijpen van hoe de fitness van HIV de langetermijnpathogenese beïnvloedt. De methoden zullen vandaag worden beschreven door Jessica Prince en Dan Claiborne, twee van mijn promovendi.Om deze procedure te starten, wordt cDNA vanuit RNA reverse getranscribeerd en worden de DNA-producten van de eerste ronde geamplificeerd met behulp van een reverse transcriptase en een thermostabiele DNA-polymerase in een one-step RT-PCR. Voer vervolgens een nested PCR-amplificatie van een tweede ronde uit, waarbij één µL van de PCR-amplificatie uit de eerste ronde als DNA-template wordt gebruikt. Voeg daarna drie µL 5X laadkleurstof toe aan vijf µL van het reactievolume van de tweede ronde.Voer de elektroporese uit bij 120 volt op een 1% agarose TAE-gel die een UV-fluorescerende DNA-kleurstof bevat, totdat de banden gescheiden zijn. Visualiseer vervolgens de 1,6 KB-banden op een blauwe lichtilluminator. Voer daarna het resterende reactievolume van 45 microliter uit op een 1% agarose TAE-gel die de DNA-kleurstof bevat. Snijd de juiste banden uit met een schoon scheermesje en combineer drie positieve reacties per individu. Extraheer vervolgens DNA uit het gelstuk met behulp van een gelzuiveringskit en elueer dit in nucleasevrij water. Vries het product in bij minus 20 graden Celsius voor later gebruik. 0:15:56 In deze procedure worden, na amplificatie van de long terminal repeat five prime UTR-regio van het MJ-vier-plasmide, de 1,3 KB PCR-producten op de illuminator gevisualiseerd. Snijd de positieve ampliconen uit, zuiver ze vervolgens en vries ze in zoals eerder beschreven. Creëer daarna de gefuseerde MJ-vier LTR gag-ampliconen via splice overlap extension PCR. Visualiseer, snijd uit, zuiver en vries het 3,2 kb lange amplicon in. Digesteer nu 1,5 microgram MJ-vier-plasmide en 1,5 microgram gezuiverd LTR-gag PCR-product met BCL-one restrictie-endonucleasedurende 1,5 uur bij 50 graden Celsius. Voeg vervolgens één microliter NGOM-vier toe aan de digestiereactie en incubeer deze één uur bij 37 graden Celsius. Voeg daarna 5x loading dye toe aan de restrictiedigestiereacties. Voer langzaam elektroporese uit van het totale volume op een 1% agarose TAE-gel die een DNA-kleurstof bevat gedurende één tot twee uur bij 100 volt. Visualiseer, snijd uit en zuiver de aangegeven banden voor klonering zoals eerder beschreven.Bereid vervolgens de ligatiereacties voor met gezuiverd LTR-gag insert en MJ-four vector DNA in een insert-vectorverhouding van drie op één. Incubeer de ligatiereacties gedurende de nacht bij 4 °C.Transformeer vervolgens chemisch competente JM-109 bacteriën met ligatieproducten, uitgestreken op LB-agarplaten met 100 micrograms per milliliter ampicilline. Kweek de getransformeerde bacteriën gedurende ten minste 22 uur bij 30 degrees Celsius. Om de kloningsgetrouwheid te bevestigen, wordt het miniprep-DNA onderworpen aan een dubbele digestie met de restrictie-enzymen NGOM-four en HPA-one bij 37 degrees Celsius gedurende twee uur.Analyseer dit vervolgens op een 1% agarose TAE-gel. Bereken het benodigde volume virus vanuit elke voorraad op basis van de IU per microliter titer uit een TZM-BL-celassay, om vijf keer 10⁵ GXR-25-cellen te infecteren bij een multiplicity of infection van 0,05. Zorg ervoor dat u de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen draagt voor het werken met replicatiecompetent HIV, waaronder een volledige laboratoriumjas, mondmasker en dubbele handschoenen. Haal op de dag van infectie de virusvoorraden uit de vriezer van -80 °C en ontdooi deze. Verdun vervolgens het virus in C-R-P-M-I-medium tot een volume van 100 µL om een MOI van 0,05 te bereiken. Voeg dit toe aan de v-bodem weefselkweekbehandelde 96-wellplaat, inclusief zowel een positieve als een negatieve controle in elke set replicatie-experimenten, en richt de plaat zo in dat elke tweede kolom leeg blijft om kruiscontaminatie tussen de wells te beperken. Tel vervolgens de GXR-25-cellen met een automatische celsteller en bereken het totale aantal cellen dat nodig is voor alle infecties. Aliquoteer het vereiste volume in een conische buis van 50 mL en centrifugeer om de cellen te pelletteren. Aspireer vervolgens voorzichtig het medium en resuspendeer in C-R-P-M-I bij een concentratie van vijf keer 10⁵ cellen per 100 µL. Pipetteer de cellen in een steriel reservoir en meng grondig. Voeg vervolgens met een multichannel-pipet 100 µL cellen toe aan elke well van de 96-wellplaat die het verdunde virus bevat en meng grondig. Voeg daarna twee µL van een 5 mg/mL polybrene-oplossing toe aan elke well en meng de cellen grondig. Incubeer vervolgens gedurende drie uur bij 37 °C in een weefselkweekincubator met 5% CO2.Om de geïnfecteerde cellen te wassen, wordt de 96-wells V-bodemplaat gecentrifugeerd om de cellen te pelletteren. Verwijder vervolgens voorzichtig 150 µL van het medium en vervang dit door 150 µL vers C-R-P-M-I zonder het celpellet te verstoren. Herhaal deze procedure nog twee keer om de cellen voldoende te wassen. Na de laatste centrifugatie en de toevoeging van 150 µL C-R-P-M-I wordt het celpellet geresuspendeerd met een multikanalenpipet. Voeg het mengsel uit elke well toe aan 800 µL C-R-P-M-I in een well van een 24-wells weefselkweekplaat. Plaats de plaat vervolgens in een 5% CO2 weefselkweekincubator bij 37 °C. Overdraag elke twee dagen 100 µL supernatant van het oppervlak van de kweekwell naar een well van een 96-wells U-bodemplaat en vries dit in voor latere analyse met de RT-assay. Resuspendeer vervolgens de cellen grondig en verwijder de helft van het resterende volume om overgroei van de cellen te voorkomen. Herstel daarna het oorspronkelijke volume door 550 µL vers C-R-P-M-I aan elke well toe te voegen.Voeg bij deze procedure één tot twee microliter van 10 millicurie per milliliter DTTP en vier microliter van één molar DTT toe aan elke aliquot van één milliliter RT-mastermix. Meng elke 1,5 milliliter microcentrifugebuis met RT-mastermix, DTT en DTTP zorgvuldig met een 1000 microliter pipette en breng dit over naar een steriel trogje.Dispenseer vervolgens 25 µL van de gelabelde RT-mix in elke put van een 96-put PCR-plaat met dunne wanden. Voeg vijf µL van elk supernatant toe aan de PCR-plaat die de RT-mastermix bevat. Seal de PCR-plaat vervolgens met een adhesieve foliecover en incubeer deze twee uur lang bij 37 °C in een thermocycler. Maak na incubatie kleine gaatjes in de foliecover met een 200 µL multichannelpipet. Meng de monsters vijf keer. Breng vijf µL van elk monster over op DE-81 papier en laat alle monsters 10 minuten aan de lucht drogen. Plaats de blots in afzonderlijke wasbakken. Was de blots vervolgens vijf keer met 1X SSC. Was ze daarna twee keer met 90% ethanol gedurende vijf minuten per wasbeurt voordat ze aan de lucht worden gedroogd. Wikkel de blot na het drogen voorzichtig in Saranwrap en stel deze gedurende de nacht bij kamertemperatuur bloot aan het phosphoscreen in een luchtdicht gesloten cassette.Zodra ze klaar zijn, analyseert u de fosforbeeldschermen met een phosphor-imager en kwantificeert u de radioactieve transcripten.Getoond. Hier zijn de representatieve gelbeelden die de elektroforetische scheiding laten zien van de verschillende PCR-amplicons die nodig zijn om een patiëntafgeleid gag-amplicon te genereren dat in de MJ-four plasmid-backbone kan worden gekloond. Dit representatieve gelbeeld toont de elektroforetische scheiding van restrictiedigesten voor het klonen van patiënt-gag-genen in MJ four.En deze representatieve gelafbeelding toont de elektroforetische scheiding van restrictiedigesten van een gezuiverd gag MJ-four chimera plasmide-DNA. Deze grafiek toont de reproduceerbaarheid van de replicatie-assay over tijd in de GXR-25 cellijn. Dezelfde gag MJ four chimere virussen werden gebruikt om GXR-25 cellen te infecteren in twee onafhankelijke experimenten die ongeveer een jaar na elkaar werden uitgevoerd.Replicatiescores werden gegenereerd door de helling van log-getransformeerde DLU-waarden te berekenen en deze helling te normaliseren ten opzichte van wildtype MJ-four. De twee onafhankelijke metingen zijn sterk gecorreleerd en benadrukken de reproduceerbaarheid van assays die op verschillende tijdstippen en met cellen met verschillende passagen zijn uitgevoerd. Deze techniek baande de weg voor onderzoekers in het veld van HIV/AIDS om de virale determinanten van pathogenese te verkennen bij acute subtype C-infecties, het meest voorkomende subtype wereldwijd. Werken met replicatie-competent HIV kan extreem gevaarlijk zijn. Alle stappen waarbij levend virus betrokken is, moeten worden uitgevoerd in een BSL 2+ faciliteit. Alle oppervlakken moeten regelmatig worden gedecontamineerd en er moeten te allen tijde dubbele handschoenen worden gedragen.

a-restriction-enzyme-based-cloning-method-to-assess-vitro-replication

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit gevisualiseerd experiment is een gids voor het gebruik van een fluorescerende moleculaire kloon van HIV voor live confocale imaging experimenten.

Visualiseren Cel-cel Overdracht van hiv met behulp van TL-Klonen van HIV en Live confocale microscopie

Er zijn twee methoden van Heterokaryon vorming van HCV Beperking Factoren Ontdek

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

Het begrijpen van de conformatie van virale oppervlakte-antigenen is noodzakelijk om antilichaamneutralisatie te evalueren en het ontwerp van effectieve vaccin-immunogenen te begeleiden. Hier beschrijven we een cel-gebaseerde ELISA-test die de studie van de herkenning van trimeer HIV-1 Env, tot expressie gebracht aan het oppervlak van getransfecteerde cellen, door specifieke anti-Env antilichamen mogelijk maakt.

Conformationele Evaluatie van HIV-1 Trimere envelop glycoproteïnen met een cel-gebaseerde ELISA test

Groeiconcurrentie tussen bijna isogene virussen biedt een gevoelige meting voor het bepalen van relatieve replicatiefitheid. De hier beschreven protocollen omvatten de constructie van recombinante HIV-1-klonen, viruspropagatie en groeiconcurrentie en analysemethoden geoptimaliseerd om gevoelige en consistente resultaten op te leveren.

Paarsgewijze Groei Competitie Assay voor het bepalen van de Replicatie Fitness van Human Immunodeficiency Virussen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het creëren van een infectieus bacterieel kunstchromosoom dat een volledige cDNA bevat van de positieve-streng genomische RNA van het Japanse encefalitisvirus. Dit protocol kan worden gebruikt om een functionele cDNA van andere positieve-streng RNA-virussen te construeren, waardoor het een krachtig genomisch hulpmiddel wordt voor het bestuderen van virusbiologie.

Bacteriële kunstmatige chromosomen: Een Functional Genomics Tool voor de Studie van Positive-streng RNA-virussen

We beschrijven een cel-gebaseerde test om te melden aan de HIV-1 fusion via de uitdrukking van groen fluorescent proteïne aantoonbaar door stroom cytometry of fluorescentie microscopie. Het kan worden gebruikt voor het testen van remmers van virale toegang (specifiek aan de fusie stap) in cel-vrij en cel-naar-cel infectie systemen.

Een High-throughput Cre-Lox geactiveerd virale membraan Fusion Assay ter identificatie van de Inhibitors van HIV-1 virale membraan Fusion

We presenteren een genoom engineering workflow voor de generatie van nieuwe in vitro modellen voor HIV-1 infectie die recapituleren proviraal integratie op geselecteerde genomic sites. Doelgerichtheid van HIV-afgeleide verslaggevers wordt vergemakkelijkt door CRISPR-Cas9-gemedieerde, site-specific genoom manipulatie. Gedetailleerde protocollen voor eencellige kloon generatie, screening en juiste targeting verificatie worden geleverd.

CRISPR-Cas9-gebaseerde genoom Engineering voor het genereren van Jurkat verslaggever modellen voor HIV-1 infectie met geselecteerde proviraal integratie Sites

Hier presenteren we een diepe rangschikken benadering waarmee een onbevooroordeelde bepaling van ontluikende 3'-termini en vogelgriepvirus profielen van single-stranded DNA moleculen. De belangrijkste toepassing is de karakterisatie van ontluikende retrovirale complementaire Ani (cDNAs), de tussenproducten die tijdens het proces van retrovirale omgekeerde transcriptie gegenereerd.

Bepalende 3'-Termini en sequenties van ontluikende Single-Stranded virale DNA moleculen tijdens HIV-1 Reverse transcriptie in geïnfecteerde cellen

Een hoge doorvoersnelheid protocol voor functionele beoordeling van efficiënte reactivering van HIV en de ontmijning van latente proviruses is beschreven en toegepast door het testen van het effect van interventies op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren. Representatieve resultaten van het effect van latentie omkering van agenten op LTR-gedreven transcriptie, egaliseren en lamineren zijn verstrekt.

High Throughput In Vitro beoordeling van latentie omkering van agenten op HIV transcriptie, egaliseren en lamineren

Hier beschrijven we enkele gevestigde methoden om endoplasmatisch reticulum (ER) stress en activering van ongevouwen eiwitrespons (UPR) te bepalen, met bijzondere nadruk op HIV-1-infectie. Dit artikel beschrijft ook een reeks protocollen om het effect van ER-stress/UPR op HIV-1-replicatie en virion-infectiviteit te onderzoeken.

Het meten van endoplasmatisch reticulumstress en ongevouwen eiwitrespons in HIV-1-geïnfecteerde T-cellen en het analyseren van de rol ervan in HIV-1-replicatie

Leer een restrictie-enzym gebaseerde kloonmethode om de replicatiecapaciteit van HIV-1 Gag-MJ4 chimerische virussen in vitro te beoordelen. Deze techniek helpt onderzoekers bij het bestuderen van virale pathogenese.

Een restrictie-enzym Based Klonen Methode om de Beoordelen In vitro Replicatie Capaciteit van HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Virussen (Video) | JoVE Journal

Een restrictie-enzym Based Klonen Methode om de Beoordelen

Meer video's verkennen