Een restrictie-enzym Based Klonen Methode om de Beoordelen In vitro Replicatie Capaciteit van HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Virussen

Het algemene doel van deze procedure is om gag-genen afkomstig van subtype CHIV één besmette individuen te integreren in een replicatiecompetent HIV één plasmide. Om het effect van gag-sequentiepolymorfismen op de replicatiecapaciteit van HIV één in vitro te beoordelen, wordt dit bereikt door eerst het gag-gen uit het plasma van de patiënt te versterken. De tweede stap is om de door de patiënt afgeleide gag-sequentie te klonen in de replicatiecompetente infectieuze moleculaire klon MJ vier.

Vervolgens wordt het gag MJ vier chimera-plasmide getransfecteerd om besmettelijke virale stocken te genereren en getitreerd om de besmettelijkheid op een indicatorcellijn te beoordelen. De laatste stap is om de in vitro replicatiecapaciteit te meten in de G XR 25 T-cellijn. Uiteindelijk wordt een radioactief gelabelde reverse transcriptase-test gebruikt om de productie van virionen in de loop van de tijd te kwantificeren om de virale replicatiekinetica te visualiseren.

De methode die we vandaag gaan beschrijven, kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het hiv-veld. Deze omvatten het definiëren van de determinanten van de replicatiefitheid van hiv en het begrijpen hoe de fitheid van hiv de langdurige pathogenese beïnvloedt. De methoden worden vandaag beschreven door Jessica Prince en Dan Klaban, twee van mijn afgestudeerde studenten.

Om deze procedure te starten, reverse transcribeer CDNA van RNA en versterk de DNA-producten van de eerste ronde met behulp van reverse transcriptase en een thermostabiele DNA-polymerase in een stap RT-PCR. Gebruik vervolgens één microliter van de eerste ronde PCR-versterking als DNA-sjabloon en voer een geneste tweede ronde PCR-versterking uit. Voeg vervolgens drie microliters van vijf keer laadbuffer toe aan vijf microliters van het reactievolume van de tweede ronde.

Laat het lopen op 120 volt op een 1% aros, TAE-gel met een UV-fluorescente DNA-kleuring totdat de banden zijn opgelost. Visualiseer vervolgens de 1,6 KB-banden op een blauwlichtverlichter. Daarna laat u de resterende 45 microliter reactievolume lopen op een 1% aros, TAE-gel met de DNA-kleuring.

Snijd de juiste banden uit met een schone scheermes en combineer drie positieve reacties per persoon. Extraheer vervolgens DNA uit de gelplak met behulp van een gelzuiveringsuitrusting en gebruik het in het nucleasevrije water. Vries het product in op min 20 graden Celsius voor later gebruik in deze procedure.

Na het versterken van de lange terminale herhaling vijf prime UTR-regio van het MJ vier-plasmide. Visualiseer de 1,3 KB PCR-producten op de verlichter, snij de positieve amplicons uit, zuiver en bevries ze zoals eerder beschreven. Maak vervolgens de gefuseerde MJ vier LTR gag amplicons via splice overlap extension PCR.

Visualiseer, snij uit, zuiver en bevries de 3,2 kb lange amplicon. Vervolgens wordt 1,5 microgram MJ vier-plasmide en 1,5 microgram gezuiverde LTR gag PCR-product gedigest met BCL een restrictie-endonuclease gedurende 1,5 uur bij 50 graden Celsius. Voeg vervolgens één microliter NGOM vier toe aan de digestiereactie en incubeer deze gedurende één uur bij 37 graden Celsius.

Voeg vervolgens vijf keer laadbuffer toe aan de restrictiedigestiereacties. Electroforeseer het totale volume langzaam gedurende één tot twee uur op 100 volt op een 1% aros, TAE-gel met een A DNA-kleuring. Visualiseer, snij uit en zuiver de aangegeven banden voor klonering zoals eerder beschreven.

Bereid vervolgens de ligatiereacties voor met gezuiverd LTR gag. Voeg een MJ vier vector DNA toe met een insert tot vector verhouding van drie op één. Laat de ligatiereacties overnacht incuberen bij vier graden Celsius.

Transformeer vervolgens JM 1 0 9 chemisch competente bacteriën met ligatieproducten verspreid op LB auger platen met 100 microgram per milliliter. Laat de getransformeerde bacteriën groeien bij 30 graden Celsius gedurende ten minste 22 uur. Om de kloningsgetrouwheid te bevestigen, snijd het mini prep DNA met NGO M vier en HPA een restrictie-enzymen in een dubbele digest bij 37 graden Celsius gedurende twee uur.

Analyseer het vervolgens op een 1% aros. TAE-gel. Bereken het volume virus dat nodig is van elke stock op basis van de IU per microliter titer uit een TZM BL-celtest om vijf keer 10 tot de vijfde G XR twee vijf cellen te infecteren met een multiplicator van infectie van 0,05.

Zorg ervoor dat u de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen draagt voor het werken met replicatiefitheidsbekwaam hiv, wat onder meer een volledige jas, een gezichtsmasker en dubbele handschoenen omvat op de dag van infectie. Haal de virusstocken uit de min 80 graden Celsius vriezer en ontdooi ze. Verdun vervolgens het virus in C-R-P-M-I-media tot een volume van 100 microliters.

Om een MOI van 0,05 te bereiken, voegt u het toe aan de vbo-weefselkweek behandelde 96-well plate, inclusief zowel een positieve als een negatieve controle in elke set replicatie-experimenten en stel de plaat zo in dat elke andere kolom leeg is om kruisbesmetting tussen de wells te beperken. Tel vervolgens de GXR twee vijf cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller en bereken het aantal cellen dat in totaal nodig is voor alle infecties. Verdeel het vereiste volume in een 50 milliliter conische buis en centrifugeer om de cellen te pelleten.

Zuig vervolgens het medium voorzichtig af en suspendeer het in C-R-P-M-I met een concentratie van vijf keer 10 tot de vijfde cellen per 100 microliters, pipetteer de cellen in een steriele trog en meng grondig. Voeg vervolgens met behulp van een multikanaals pipetteerder 100 microliters cellen toe aan elke well van de 96-well plate met het verdunde virus en meng grondig. Voeg vervolgens twee microliters oplossing van vijf milligram per milliliter poly brain toe aan elke well en meng de cellen grondig.

Incubeer vervolgens bij 37 graden Celsius in een weefselkweekincubator met 5%CO2 gedurende drie uur om de geïnfecteerde cellen te centrifugeren. Centrifugeer de 96-well V-bode