Name: Vaccinia Reporter Virussen voor kwantificeren Viral Functie in alle stadia van genexpressie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-15T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Leer een methode voor real-time meting van virale infectiviteit en genexpressie met een fluorescerende reporter vaccinia virus. Deze aanpak identificeert specifieke stadia van virale replicatie die worden beïnvloed door kleine molecuul remmers.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken SIGA Technologies (Corvallis, OR) voor het verstrekken van ST-246. DKR werd ondersteund door een NIH opleiding subsidie ​​in immunologie aan de Universiteit van Boston (5T32AI 7309). Dit werk werd mede ondersteund door P41 086.180, NIH RO1AI1096159-01, en RO3 (tot JHC).

1. Plate Cellen <ol><li> Distantiëren HeLa-cellen van de plaat en verdund in kweekmedium (DMEM, 2 mM L-glut, 10% FBS) tot ongeveer 2,0 x 10 5 cellen / ml. Pipetteer 100 ul / putje in een zwarte wanden, duidelijke platte bodem 96-well platen (20.000 cellen / putje). </li><li> Incubeer cellen gedurende 24 uur tot confluent in een 37 ° C incubator + 5% CO2. </li></ol> 2. Cellen infecteren <ol><li> Verdun virus en cellen infecteren. <ol><li> Dooi TRPV (Triple virus; Vroege Venus, Intermediate mCherry, Late TagBFP) en PLV (Promotor-minder Venus) TL-virus en splitsen met behulp van sonicatie gedurende 5 minuten. Alternatief kan ruw virusvoorraden worden 1:1 gemengd met 0,25 mg / ml trypsine in infectie media en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Verdunnen ruwe virusvoorraden in 37 ° C infectie media (DMEM, 2 mM L-glut, 2% FBS). Voor hoge MOI infecties (10 PFU / cel), vul virus voorraad tot 1,0 x 10 7 PFU / ml veronderstelling 5 x 10 4cellen / putje en een inoculum volume van 50 pl. Plan infecteren 3 herhalingsputjes voor elke behandeling met TRPV en nog 3 herhalingsputjes voor dezelfde behandeling PLV om rekening te achtergrondfluorescentie specifiek voor elke behandeling. </li><li> Infecteren putten door toevoeging van 50 ul / putje verdund virus infectie media. Dit wordt gedefinieerd als de tijd = 0 uur na infectie (0 hpi). </li></ol></li><li> Verdun gewenste behandeling stoffen in infectie media. Voor alle behandelingen een enkel 2x master mix verdunning moet worden gemaakt en toegepast op bronnen (bv. 350 ul totaal volume voor zes 96-putten met 50 pi elk) repliceren. <ol><li> Verdun experimentele verbindingen in infectie media. </li><li> Verdun voertuig controle oplosmiddel (bijv. PBS, DMSO) in infectie media. Opmerking: Vergelijkbare uiteindelijke concentraties van voertuig-control oplosmiddelen worden gebruikt, zoals toegepast voor experimentele verbindingen (bijvoorbeeld als je IBT voorraad is gemaakt met DMSO en gebruikt bij een uiteindelijke concentrations van 1 pi / ml, vervolgens alleen DMSO bij 1 ul / ml als voertuig controle). </li><li> Verdun control stoffen in infectie media. Aanbevolen control verbindingen omvatten: 3,6 pM (1 ug / ml) 1-β-D-arabinofuranosylcytosine (AraC), 50 uM (11,7 ug / ml) isatine β-thiosemicarbazon (IBT), 60 uM (50 ug / ml) Rifampicine, of 5 uM (1.9 ug / ml) ST-246 8,15,16. Zie Representatieve resultaten voor de verwachte effecten. Opmerking: maken deze verdunning tweemaal (2x) de gewenste eindconcentratie aangezien dit in de verhouding 1:1 wordt toegevoegd om het volume reeds in de put. </li></ol></li><li> Onmiddellijk na de toevoeging van het virus, voeg 50 ul infectie media die gewenste behandelingen en controles als verdund in stap 2.2. Opmerking: Voor het analyseren van de remming voordat vroeg stadium uitdrukking, verbinding (s) kan direct worden toegevoegd aan de verdunde virusinoculum (stap 2.1.2) of aan gastheercellen vóór infectie (vóór stap 2.1.3). </li><li> Incubeer 6-24 uur in een 37 &amp; #176, C incubator + 5% CO2. </li></ol> 3. Fix Cells <ol><li> Fix cellen door het toevoegen van 100 pi 8% paraformaldehyde om besmetting media reeds in elk putje. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min beschermd tegen licht. Opmerking: Het wordt aanbevolen om 2x PFA (8%) rechtstreeks aan infectie media aan aerosolization van besmettelijke vaccinia die kan optreden voorkomen als een hoge-titer media rechtstreeks wordt omgekeerd in afval schaal voorafgaand aan de fixatie. </li><li> Verwijder fixatief door het omkeren plaat in het afval gerecht. </li><li> Voeg 100 ul van PBS kamertemperatuur. </li><li> Seal plaat met optisch heldere zelfklevende folie. Opmerking: Platen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C als niet onmiddellijk lezen. Zorg ervoor dat u verzegelde platen op kamertemperatuur komen vóór het lezen om condensvorming te voorkomen vervormen spectrofotometer metingen. </li></ol> 4. Kwantificeren Virus Growth <ol><li> Meet eindpunt fluorescentie bij 515:530 voor Venus, 587:610 voor mCherry en 415:457 fof TagBFP (Opwinding: Emissie golflengte in nm). Vier metingen moeten worden gemiddeld per putje met behulp van geoptimaliseerde gain-instellingen voor elk kanaal. Opmerking: de juiste emissie golflengte kan verschillen, afhankelijk van het specifieke model en filter kenmerken van uw bord lezer. Dit kan empirisch worden bepaald door het uitvoeren van een emissiegolflengte scan tot het punt waar het grootste verschil tussen TRPV en PLV voor elk kanaal te bepalen. </li><li> Normaliseren van de ruwe data om een ​​vergelijking tussen experimenten te vergemakkelijken. <ol><li> Voor elk kanaal, bepalen het gemiddelde van repliceren TRPV en PLV putten. </li><li> Trek de gemiddelde PLV-geïnfecteerde achtergrond metingen van de gemiddelde TRPV-geïnfecteerde experimentele metingen voor elke behandeling. </li><li> Normaliseren van de gegevens die door elke achtergrond afgetrokken waarde te delen door het enige voertuig waarde ook. </li><li> Zodra een experiment is meerdere keren, een one-way variantie-analyse (one-way ANOVA) testen en meerdere c herhaaldERGELIJKING post-test kan worden uitgevoerd om te bepalen of een van de behandelingen geeft een statistisch significant verschil met het enige voertuig behandeling voor elk kanaal. </li></ol></li></ol> . 5 Alternative Protocol: Kinetic plaatanalyses <ol><li> Voer alle stappen door toevoeging van behandelingen (stap 2.3). </li><li> Seal plaat met zelfklevende folie en plaats in plaataflezer kamer evenwicht gebracht tot 37 ° C. Opmerking: Speciale zorg moet worden genomen om platen constant te houden bij 37 ° C tot onnodige cel stress en condensatie te voorkomen. Voor kinetische testen, is het bijzonder belangrijk om een gebufferd medium (natriumbicarbonaat en HEPES) om juiste pH te handhaven zonder toevoeging van 5% CO2. </li><li> Set plaataflezer krijgen handmatig verzadiging van latere tijdstippen te voorkomen. Opmerking: Accurate winst optimalisatie kan worden verkregen door het uitvoeren van een eindpunt assays onder vergelijkbare omstandigheden. </li><li> Acquire per uur lezingen voor 8-24 hpi en normaliseren met behulp van simiLAR-procedure zoals in eindpuntassay (stap 4.2). </li><li> Individuele tijdstippen worden geanalyseerd op statistische significantie met vergelijkbare werkwijzen als eerder beschreven eindpunt assay. </li></ol>

<ol><li>Yen, J., Golan, R., Rubins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+infection+%26+temporal+analysis+of+virus+gene+expression%3A+part+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus infection & temporal analysis of virus gene expression: part 1.</a> J Vis Exp. 26 (26), (2009).</li>
<li>Hansen, S. G., Cope, T. A., Hruby, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiZyme%3A+a+novel+fusion+protein-mediating+selection+of+vaccinia+virus+recombinants+by+fluorescence+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">BiZyme: a novel fusion protein-mediating selection of vaccinia virus recombinants by fluorescence and antibiotic resistance.</a> BioTechniques. 32 (5), 1182-1187 (2002).</li>
<li>Popov, S., Mirshahidi, S., Essono, S., Song, R., Wang, X., Ruprecht, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+recombinant+vaccinia+viruses+via+green+fluorescent+protein+selection%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of recombinant vaccinia viruses via green fluorescent protein selection.</a> DNA and Cell Biology. 28 (3), 103-108 (2009).</li>
<li>Bartee, E., Mohamed, M. R., Lopez, M. C., Baker, H. V., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+addition+of+tumor+necrosis+factor+plus+beta+interferon+induces+a+novel+synergistic+antiviral+state+against+poxviruses+in+primary+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The addition of tumor necrosis factor plus beta interferon induces a novel synergistic antiviral state against poxviruses in primary human fibroblasts.</a> Journal of Virology. 83 (2), 498-511 (2009).</li>
<li>Ward, B. M., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+intracellular+movement+of+vaccinia+virus+virions+containing+a+green+fluorescent+protein-B5R+membrane+protein+chimera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera.</a> Journal of Virology. 75 (10), 4802-4813 (2001).</li>
<li>Johnson, M. C., Damon, I. K., Karem, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+high-throughput+vaccinia+virus+neutralization+assay+for+testing+smallpox+vaccine+efficacy+based+on+detection+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid, high-throughput vaccinia virus neutralization assay for testing smallpox vaccine efficacy based on detection of green fluorescent protein.</a> Journal of Virological Methods. 150 (1-2), 14-20 (2008).</li>
<li>Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Vaccinia+reporter+viruses+for+rapid%2C+high+content+analysis+of+viral+function+at+all+stages+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression.</a> Antiviral Research. 91 (1), 72-80 (2011).</li>
<li>Dower, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+pyridopyrimidinone+inhibitor+of+orthopoxviruses+from+a+diversity-oriented+synthesis+library%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of a pyridopyrimidinone inhibitor of orthopoxviruses from a diversity-oriented synthesis library.</a> Journal of Virology. 86 (5), 2632-2640 (2012).</li>
<li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Potential+of+the+Acyclic+Nucleoside+Phosphonates+Cidofovir%2C+Adefovir%2C+and+Tenofovir+in+Treatment+of+DNA+Virus+and+Retrovirus+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Clinical Potential of the Acyclic Nucleoside Phosphonates Cidofovir, Adefovir, and Tenofovir in Treatment of DNA Virus and Retrovirus Infections.</a> Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 569-596 (2003).</li>
<li>Prichard, M. N., Kern, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthopoxvirus+Targets+for+the+Development+of+New+Antiviral+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Orthopoxvirus Targets for the Development of New Antiviral Agents.</a> Antiviral Research. 10, (2012).</li>
<li>Fenner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+successful+eradication+campaign.+Global+eradication+of+smallpox%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A successful eradication campaign. Global eradication of smallpox.</a> Reviews of Infectious Diseases. 4 (5), 916-930 (1982).</li>
<li>Breman, J. G., Henderson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+dilemmas--monkeypox%2C+smallpox%2C+and+biologic+terrorism.+The+New+England%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Poxvirus dilemmas--monkeypox, smallpox, and biologic terrorism. The New England.</a> Journal of Medicine. 339 (8), 556-559 (1998).</li>
<li>Baker, R. O., Bray, M., Huggins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+antiviral+therapeutics+for+smallpox%2C+monkeypox+and+other+orthopoxvirus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections.</a> Antiviral Research. 57, 1-2 (2003).</li>
<li>Rimoin, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+increase+in+human+monkeypox+incidence+30+years+after+smallpox+vaccination+campaigns+cease+in+the+Democratic+Republic+of+Congo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Major increase in human monkeypox incidence 30 years after smallpox vaccination campaigns cease in the Democratic Republic of Congo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 107 (37), 16262-167 (2010).</li>
<li>Sodeik, B., Griffiths, G., Ericsson, M., Moss, B., Doms, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+vaccinia+virus%3A+effects+of+rifampin+on+the+intracellular+distribution+of+viral+protein+p65%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Assembly of vaccinia virus: effects of rifampin on the intracellular distribution of viral protein p65.</a> Journal of Virology. 68 (2), 1103-1114 (1994).</li>
<li>Grosenbach, D. W., Jordan, R., Hruby, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+small-molecule+antiviral+ST-246+as+a+smallpox+therapeutic%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Virology%22%5BJournal%5D)">Development of the small-molecule antiviral ST-246 as a smallpox therapeutic.</a> Future Virology. 6 (5), 653-671 (2011).</li>
<li>Broyles, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus transcription.</a> Journal of General Virology. 84 (9), 2293-2303 (2003).</li>
<li>Condit, R. C., Niles, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+viral+transcription+elongation+and+termination+during+vaccinia+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Gene+Structure+and+Expression%22%5BJournal%5D)">Regulation of viral transcription elongation and termination during vaccinia virus infection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1577 (2), 325-336 (2002).</li>
<li>Díaz-Guerra, M., Rivas, C., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+expression+of+the+2-5A+synthetase%2FRNase+L+system+results+in+inhibition+of+vaccinia+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Inducible expression of the 2-5A synthetase/RNase L system results in inhibition of vaccinia virus replication.</a> Virology. 227 (1), 220-228 (1997).</li>
<li>Cohrs, R. J., Condit, R. C., Pacha, R. F., Thompson, C. L., Sharma, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+ppp%28A2%E2%80%99p%29nA-dependent+RNase+by+a+temperature-sensitive+mutant+of+vaccinia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Modulation of ppp(A2’p)nA-dependent RNase by a temperature-sensitive mutant of vaccinia virus.</a> Journal of Virology. 63 (2), 948-951 (1989).</li>
<li>Sánchez-Puig, J. M., Sánchez, L., Roy, G., Blasco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+different+leukocyte+cell+types+to+Vaccinia+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of different leukocyte cell types to Vaccinia virus infection.</a> Virology Journal. 1 (1), (2004).</li>
<li>Bengali, Z., Satheshkumar, P. S., Yang, Z., Weisberg, A. S., Paran, N., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+S2+cells+are+non-permissive+for+vaccinia+virus+DNA+replication+following+entry+via+low+pH-dependent+endocytosis+and+early+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Drosophila S2 cells are non-permissive for vaccinia virus DNA replication following entry via low pH-dependent endocytosis and early transcription.</a> PLoS One. 6 (2), (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen en er geen patenten zijn aangevraagd voor virussen of screeningsmethoden.

Hier hebben we het praktisch gebruik van een multi-stage vaccinia reporter virus (TRPV), die reproduceerbaar, real-time feedback maatregelen virus replicatie biedt beschreven. Door het gebruik van goed gedefinieerde pokkenvirus remmers, waren we in staat aan te tonen dat TRPV reageert op een wijze die in overeenstemming met de begrepen werkingsmechanisme voor elke remmer. Terwijl de TRPV virus biedt de meest uitgebreide informatie over virus fase progressie tweetraps (iRev, LREV) en eentraps (ES, IV, LV) virussen kunnen...

Traditioneel wordt virusexpressievectoren bestudeerd met behulp van moleculair biologische technieken (bijvoorbeeld Northernblotting, western blotting, microarray hybridisatie, etc.) 1. Hoewel deze methoden kunnen gedetailleerde informatie betreffende categoriseren expressie veranderingen van afzonderlijke mRNA of eiwitten zijn, zijn ze meestal niet ontvankelijk voor real-time en high-throughput processen. Alternatieve benaderingen met behulp van fluorescentie gebaseerde reporters zijn eerder toegepast bij het werken met poxviruses; echter, is hun ontwikkeling en gebruik ingegeven door gevarieerde doelstellingen. Verschillende van dergelijke werkwijzen zijn ontwikkeld voor de selectie van recombinante virussen 2,3. Deze technieken uiten EGFP op een correcte integratie en expressie van exogeen DNA van recombinant vaccinia klonen. Ook verscheidene vaccinia stammen die stabiel EGFP oplosbaar of GFP-gemerkte eiwitten tot expressie gebracht onder een natieve vaccinia promoter zijn op grote schaal gebruikt. Deze zijn typtisch gebruikt om virus entry en replicatie tijdens antilichamen gebaseerde neutralisatiebepalingen, chemische remming, of vergelijking van antivirale effectiviteit 4-6 kwantificeren. Hoewel deze virussen nuttig zijn gebleken, zijn zij beperkt in hun vermogen om gedetailleerde informatie over de bijzondere inhibitie door het gebruik van een dubbelzinnige vroege / late virale promoter. Vorige werkwijzen hebben ook gebruik van EGFP eiwit met suboptimale signaal-ruis-eigenschappen. Vanwege de complexiteit van pokkenvirus replicatie en het ontbreken van bestaande hulpmiddelen beschikbaar om real-time veranderingen in virale genexpressie assay, hebben we een reeks van een of meerdere stage reporter 7,8 virussen ontwikkeld. Zoals beschreven in eerdere publicaties, deze virussen uiten een, twee, of drie spectraal verschillende fluorescerende eiwitten uit autochtone vaccinia initiatiefnemers tijdens de vroege, midden of late stadia in infectie. Deze virussen kunnen onsed als indicatoren van het virus replicatie vooruitgang met behulp van een fluorescentie microscoop en ze zijn even goed geschikt voor high-throughput plaat-en-reader gebaseerde testen. Deze virussen zijn makkelijk te gebruiken in plaats van wild type virus, groeit met vergelijkbare kinetiek gelijkwaardige titers 7 bereiken. Bij de planning en het creëren van deze virussen is veel zorg besteed aan het selecteren van fluoroforen die hoge signaal-achtergrond kenmerken met superieure vouwen efficiëntie betrouwbare kwantificatie met snelle feedback aan veranderingen in expressie (Venus, mCherry en TagBFP) vergemakkelijken. Bovendien, combinaties van virale promotors werden gekozen die high fidelity, eenduidige fase-specifieke expressie, het verstrekken van informatie over het volledige scala van vroege (C11R promotor), intermediair (G8R promotor) en late (F17R promotor) genexpressie te produceren, in tegenstelling tot dubbelzinnige vroege / late promoters. Deze virussen kunnen worden gebruikt als instrument voor INVEstigating de levenscyclus van de prototypische pokkenvirus, vaccinia virus. Veel is nog niet bekend over de host-virus interactie ondanks de lange geschiedenis van de studie. Vaccinia is complex, productie van meer dan 200 unieke eiwitten, waarvan vele zijn immunomodulerende en gastheer antagonistische. Na infectie begint vacciniavirus onmiddellijk vroege mRNA transcriptie. Dit wordt vergemakkelijkt door een RNA-polymerase en transcriptiefactoren die op het virale genoom werden geladen tijdens virion verpakking en vastgehouden in een onderbroken toestand tot daaropvolgende infectie. Deze vroege uitdrukking produceert eiwitten vereist voor het onderdrukken van de gastheer immuunsysteem (mRNA decapping, dsRNA opslag en decoy receptor eiwitten alsook remmers van apoptose, stressrespons en Toll, IL en NF-KB-signalering) en genoom replicatie. Vroege uitdrukking produceert ook transcriptiefactoren die nodig zijn voor intermediaire expressie. Intermediate meningsuiting de expressie van late stadium transcriptiefactoren. Dezeexpressie cascade leidt tot productie van structurele en enzymatische virus eiwitten tijdens de late stadia van de infectie, die noodzakelijk zijn voor volledige assemblage van het rijpe virion vaccinia. Onze reeks van fluorescerende reporter virussen zorgt voor een snelle vooruitgang wordt geboekt in het begrijpen van pokkenvirus biologie. Een van de meest voorkomende en tijdrovende methoden op het gebied van de virologie is de groei assay. Dit betekent meestal infecteren cellen vaststelling van een reeks behandelingen, oogsten virus door geïnfecteerde cellen lyseren en kwantificeren van de virale titer verkregen door plaque assay. De reporter virussen beschreven maakt real-time meting van de virusgroei die gemakkelijk kunnen worden getest en vergeleken tussen talrijke behandelingen parallel uitgevoerd. Wij voorzien deze set reagentia worden gebruikt in verschillende protocollen voor het identificeren van veranderingen in virale genexpressie in respons op behandeling met geneesmiddelen, RNAi knockdown, of host range beperking. Deze methode maakt het ook mogelijk hoge inhoudsanalyse op grotere schaal dan voorheen beschikbaar, waardoor voor high-throughput anti-virale medicijn schermen voor specifiek omschreven doel fasen van belang. Terwijl talrijke potentiële behandelingen pokkenvirus infectie bestrijden zijn geïdentificeerd, het enige door de FDA goedgekeurde therapie effectief voor de behandeling pokkenvirus infectie het acyclische nucleoside fosfonaat, cidofovir, en behandeling met vaccinia immunoglobuline 9,10. Ondanks de uitroeiing van pokken in 1977 11, poxviruses blijven een belangrijke bedreiging voor de gezondheid van de mens 12. Stopzetting van wijdverbreide vaccinatie tegen variolavirus heeft geleid tot een verhoogde gevoeligheid voor andere pokkenvirussen 13. Bijvoorbeeld, zijn de regio&#39;s van Centraal-Afrika eerder door vaccinatie beschermd ervaren van een stijging van de Apenpokken virusinfecties 14. Belangrijke zorg is ookgeuit over de latente gevoeligheid voor opzettelijke vrijlating van variolavirus. Vanwege de beperkte therapieën die momenteel beschikbaar zijn, is er een dringende behoefte aan ontwikkeling van nieuwe behandelingen. Deze verslaggever virussen toestaan ​​snelle en high-throughput klein molecuul-remmer screening op remming van een specifieke fase van virale replicatie. Identificatie van remmers die virale uitdrukking stadia richten momenteel niet het doelwit van remming zal de ontwikkeling van combinatietherapieën vergemakkelijken met een verhoogde potentie. Er kan veel worden afgeleid over vacciniavirussen celbiologie door het observeren van veranderingen in elke fase van de genexpressie. Verzwakking door chemische of genetische manipulatie van een geïnfecteerde gastheercel wordt typisch uitgedrukt als de virale titers. Echter, door veranderingen in elke fase van de virale expressie cascade vergelijken, kan een vollediger begrip van hoe virus fitness effect is te vindened door een bepaalde behandeling. Deze gegevens zijn getoond om goed correleren met de traditionele virustiter uitgang, maar meer gedetailleerde mechanistische informatie en high throughput mogelijkheden 7.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450H</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamine, (L-glut)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates</td><td>Corning</td><td>3712</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>TRLVMF</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO)</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB03091</td><td></td></tr><tr><td>1-&beta;-D-Arabinofuranosylcytosine&nbsp; (AraC), MW= 280 g/mol</td><td>SigmaAldrich Co</td><td>C6645</td><td></td></tr><tr><td>isatin &beta; -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9075202</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin, MW= 823 g/mol</td><td>SigmaAldrich Co</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>ST-246, MW= 376 g/mol</td><td>SIGA Labs, Corvallis, OR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>TempPlate RT optically clear film</td><td>USA Scientific</td><td>2978-2700</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Medium</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr></tbody></table>

vaccinia reporter virussen voor kwantificeren viral functie in alle stadia van genexpressie

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Poxviruses zijn een familie van dubbelstrengs DNA-virussen die actieve menselijke ziekteverwekkers zoals monkeypox, molluscum contagiousum en Contagalo virus bevatten. De familie omvat ook het pokkenvirus, Variola. Vanwege de complexiteit van pokkenvirus replicatie, veel vragen blijven over hun genexpressie strategie. In dit artikel beschrijven we de beeldvorming en het gebruik van recombinante vaccinia virussen die real-time meting van enkelvoudige en meervoudige stadia van virale genexpressie in een high-throughput laat toe. Dit wordt mogelijk gemaakt door het gebruik van spectraal verschillende fluorescente eiwitten reporters voor elk van de drie stadia van virale replicatie. Deze virussen zorgen voor een hoge signaal-ruisverhouding tijdens stadium specifieke expressiepatronen, zodat plaat gebaseerde testen en microscopische observaties van virusvermeerdering en replicatie behouden. Deze instrumenten hebben toepassingen voor antivirale ontdekking, studies van de interactie tussen virus en gastheer, en evolutionaire biologie.

Als voorbeeld van de typische gebruik van deze virussen, werd de drievoudige fluorescentie-reporter virus gebruikt voor het vergelijken van de plaats van remming van een aantal goed gedefinieerde pokkenvirus remmers. HeLa-cellen werden uitgeplaat in weefselkweek behandelde zwarte wanden duidelijke platte bodem 96-well platen en overnacht geïncubeerd. Confluente monolagen werden geïnfecteerd bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 10 met behulp van drievoudige reporter virus (TRPV, <str...

We beschrijven het gebruik van een fluorescerende reporter koepokkenvirus die real-time meting van de virale besmettelijkheid en genexpressie in staat stelt door middel van het podium-specifieke expressie van spectraal verschillende reporter fluoroforen. We detail een plaat gebaseerde methode voor het nauwkeurig vaststellen van de fase waarin het virus replicatie wordt beïnvloed in reactie op kleine molecule remming.

Vaccinia Reporter Virussen voor kwantificeren Viral Functie in alle stadia van genexpressie

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Het algemene doel van deze procedure is om de stadia te identificeren waarin de virale genexpressie wordt beïnvloed door chemische behandeling. Hiervoor worden weefselkweekcellen uitgeplaat en geïncubeerd tot ze confluent zijn. De cellen worden vervolgens geïnfecteerd met ofwel een triple reporter vaccinia virus of een controle virus zonder promoter.Vervolgens worden de behandelingsverbindingen toegepast en worden de cellen gedurende 18 uur geïncubeerd om de voltooiing van alle fasen van virale genexpressie mogelijk te maken. De resulterende fluorescentie wordt vervolgens bepaald met een platenlezer. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de relatieve veranderingen in expressie tonen die zijn veroorzaakt door de experimentele verbindingen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van infectie met een virus dat een enkel fluorescent fusie-eiwit tot expressie brengt, is dat deze set virussen meer informatie verschaft over waar in de virale levenscyclus een specifiek therapeutisch middel werkt, wat inzicht geeft in het werkingsmechanisme ervan. Hoewel deze methode kan worden gebruikt om inhibitoren van virale infectie te identificeren, kan deze ook worden

vaccinia-reporter-viruses-for-quantifying-viral-function-at-all

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Protocol voor Vaccinia infectie van HeLa cellen en analyse van de gastheer en virale gen-expressie. Deel 1 van 3.

Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 1

Protocol voor Vaccinia infectie van HeLa cellen en analyse van de gastheer en virale gen-expressie. Deel 2 van 3.

Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 2

Protocol voor Vaccinia infectie van HeLa cellen en analyse van de gastheer en virale gen-expressie. Deel 3 beschrijft het proces van fluorescent labelen van de versterkte RNA uit zowel de gastheer en virale monsters door amino-allyl koppeling van kleurstoffen. Deel 3 van 3.

Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 3

Nieuwe gastheer factoren die betrokken zijn bij virale infectie kan worden geïdentificeerd door middel van cel-gebaseerde genoom-brede verlies van functie RNAi screening.

RNAi Screening voor Host factoren die betrokken zijn in Vaccinia Virus infectie met behulp van Drosophila Cellen

This video demonstrates an in vitro technique to detect hepatitis B virus (HBV) infection via a recombinant HBV reporter system. Upon infecting host cells, the recombinant viral genome expresses the luciferase reporter enzyme, which produces bioluminescence upon oxidizing its substrate — helping detect viral infection.

An In Vitro Recombinant Virus Reporter System for the Detection of Viral Infection

This video demonstrates a method to track viral infections in mouse models using a recombinant luciferase and fluorescence protein-expressing bi-reporter Influenza A virus. This method enables both in vivo and ex vivo studies, enabling researchers to gain insights into viral dynamics and the effects of interventions.

A Luciferase-Fluorescent Reporter Influenza Virus to Track Viral Infections

This video demonstrates an assay to study the translation regulation in poxvirus-infected cells. Uninfected and virus-infected cells were co-transfected with mRNAs encoding for firefly luciferase (Fluc) and Renilla luciferase (Rluc), with the Fluc mRNA containing a 5' Poly(A) leader sequence. Upon adding bioluminescent substrates on lysed cells, measure the signal from both the luciferases to identify the translational advantage of the Fluc mRNA in virus-infected cells, conferred by the leader...

A Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-Infected Cells

Een snel en modulair protocol voor het genereren van recombinante vacciniavirussen die fluorescerend gelabelde eiwitten tegelijkertijd uitdrukken met behulp van de methode van voorbijgaande dominante selectie wordt hier beschreven.

Methodologie voor de efficiënte generatie van fluorescerend gelabeld Vaccinia Virus Eiwitten

We presenteren een protocol om mRNA vertaling verordening in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen met behulp van in vitro Getranscribeerd RNA-based Luciferase reporter assay studie. De analyse kan voor het bestuderen van Vertaal regelgeving door CIS-elementen van een mRNA worden gebruikt, met inbegrip van 5 '-onvertaalde regio (Utr) en 3 '-UTR. Verschillende Vertaal initiatie modi kunnen ook worden onderzocht met behulp van deze methode.

In vitro Getranscribeerd RNA-based Luciferase reporter assay om te studeren vertaling regelgeving in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen

Influenza A virussen (IAVs) zijn besmettelijke respiratoire pathogenen die jaarlijkse epidemieën en occasionele pandemie veroorzaken. Hier beschrijven we een protocol voor het opsporen van virale infecties in vivo met behulp van een roman recombinant plaats en fluorescentie-uitdrukken van bi-reporter iav (birflu). Deze aanpak biedt onderzoekers een uitstekend hulpmiddel om IAV in vivo te bestuderen.

Een Luciferase-fluorescerende reporter influenza virus voor Live beeldvorming en kwantificering van virale infectie

Dit protocol beschrijft de dynamiek van virale infecties met behulp van luciferase- en fluorescentie-expresserende recombinant (r)SARS-CoV-2 en een in vivo beeldvormingssysteem (IVIS) in K18 hACE2 transgene muizen om de behoefte aan secundaire benaderingen te overwinnen die nodig zijn om SARS-CoV-2-infecties in vivo te bestuderen.

Live beeldvorming en kwantificering van virale infectie bij K18 hACE2 transgene muizen met reporter-expressing recombinant SARS-CoV-2

Leer een methode voor real-time meting van virale infectiviteit en genexpressie met een fluorescerende reporter vaccinia virus. Deze aanpak identificeert specifieke stadia van virale replicatie die worden beïnvloed door kleine molecuul remmers.

Vaccinia Reporter Virussen voor kwantificeren Viral Functie in alle stadia van genexpressie

Meer video's verkennen