Vaccinia Reporter Virussen voor kwantificeren Viral Functie in alle stadia van genexpressie

Het algemene doel van deze procedure is om de stadia te identificeren waarin de virale genexpressie wordt beïnvloed door chemische behandeling. Hiervoor worden weefselkweekcellen uitgeplaat en geïncubeerd tot ze confluent zijn. De cellen worden vervolgens geïnfecteerd met ofwel een triple reporter vaccinia virus of een controle virus zonder promoter.

Vervolgens worden de behandelingsverbindingen toegepast en worden de cellen gedurende 18 uur geïncubeerd om de voltooiing van alle fasen van virale genexpressie mogelijk te maken. De resulterende fluorescentie wordt vervolgens bepaald met een platenlezer. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de relatieve veranderingen in expressie tonen die zijn veroorzaakt door de experimentele verbindingen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van infectie met een virus dat een enkel fluorescent fusie-eiwit tot expressie brengt, is dat deze set virussen meer informatie verschaft over waar in de virale levenscyclus een specifiek therapeutisch middel werkt, wat inzicht geeft in het werkingsmechanisme ervan. Hoewel deze methode kan worden gebruikt om inhibitoren van virale infectie te identificeren, kan deze ook worden ingezet om vast te stellen welke fase van de virale replicatie is voltooid in niet-permissieve cellijnen of in RNAi-screens, waardoor cellulaire factoren die noodzakelijk zijn voor infectie kunnen worden geïdentificeerd. Dit protocol maakt gebruik van het triple virus of TrpV multi-stage reportervirus, waarbij drie spectraal verschillende fluoroforen zijn ingebouwd in het dubbelstrengs genoom van een enkel vacciniavirus.

Elk van deze fluoroforen wordt aangestuurd door een goed gedefineerde, stadiumspecifieke promotor. De C 11 R-promotor voor vroege expressie van Venus, de G eight R-intermediaire promotor voor expressie van m-cherry en de F 17 R-promotor voor expressie van tag BFP in een laat stadium. Bijgevolg worden Venus, m-Cherry en tag BFP opeenvolgend tot expressie gebracht tijdens de infectie.

Als controle wordt een promoterloos virus gebruikt. PLV bevat een Venus-construct dat vergelijkbaar is met dat in het TrpV, maar het beschikt niet over een functionele transcriptiepromoter.

Begin dit protocol door Hela-cellen die op een schaal van 10 centimeter zijn gekweekt te dissociëren. Verdun de cellen in groeimedium tot ongeveer 2,0 × 10⁵ cellen per milliliter. Verdeel vervolgens 100 µL over elke put van een 96-wells plaat met zwarte wanden en een transparante, platte bodem. Incubeer de cellen gedurende 24 uur in een incubator op 37 °C met 5% CO₂ totdat ze confluent zijn. Om de virussen te verdunnen, ontdooi TrpV en PLV in een waterbad van 37 °C en sonicize deze vervolgens gedurende vijf minuten om aggregaten op te heffen. Verdun daarna de virusstock tot 1,0 × 10⁷ PFU per milliliter in infectiemedium dat is voorverwarmd tot 37 °C.

Om de cellen te infecteren, vervangt u het groeimedium in elke put door 50 µL van het verdunde virus. Infecteer voor elke behandeling drie replicate putten met TrpV en drie andere met PLV om rekening te houden met de achtergrondfluorescentie die specifiek is voor elke behandeling. Dit wordt gedefinieerd als tijd gelijk aan nul uur post-infectie. Maak bijvoorbeeld 350 µL voor 6 96-putten met elk 50 µL. Elke verbinding moet worden verdund tot twee keer de uiteindelijke concentratie, aangezien deze wordt toegevoegd aan het inoculumvolume dat al in de put aanwezig is. Maak vervolgens voor elke behandelconditie een 2x mastermix door de experimentele verbindingen of vehicle-controle-oplosmiddelen, zoals PBS of DMSO, te verdunnen in voldoende infectiemedium voor alle replicates, plus één. Let erop dat de concentratie van het oplosmiddel in zowel uw experimentele controles als uw vector-alleen-controles hetzelfde moet zijn. Als u bijvoorbeeld IBT gebruikt in een concentratie van 1 µL/mL in DMSO, moet u ook DMSO alleen in 1 µL/mL gebruiken als vectorcontrole. Voeg direct na het toevoegen van het virus 50 µL infectiemedium met de gewenste behandelings- en controleverbindingen toe aan elke put, zoals weergegeven in deze illustratie.

Let op dat elke verbinding in drievoud wordt getest met TrpV en PLV, en dat er voor elk virus een voertuigcontrole in drievoud wordt uitgevoerd.

Incubeer gedurende 18 uur in een incubator op 37 °C met 5% koolstofdioxide. Fixeer de volgende dag de cellen door 100 µL 8% paraformaldehyde toe te voegen aan het infectiemedium dat zich al in elke put bevindt. Incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.

Het direct toevoegen van 2x of 8% paraformaldehyde aan het infectiemedium voorkomt aerosolvorming van het virus, wat anders zou kunnen gebeuren als het niet gefixeerde virus direct in de afvalbak wordt omgegoten. Na 15 minuten wordt het fixatief verwijderd door de plaat in de afvalbak om te keren. Voeg vervolgens 100 µL PBS op kamertemperatuur toe en verzegel de plaat met optisch transparante plakfolie.

Als de plaat niet onmiddellijk wordt uitgelezen, bewaar deze dan bij vier graden Celsius. Zorg ervoor dat de verzegelde platen terugkeren naar kamertemperatuur voordat ze worden uitgelezen, om te voorkomen dat condensatie de spectrophotometer-metingen vervormt.

Om de virusgroei te kwantificeren, gebruikt u een spectrofotometer om de eindpuntfluorescentie te meten. Voer per put vier metingen uit met geoptimaliseerde gain-instellingen voor elk kanaal. De TECAN Infinite M 1000 Pro platenlezer die in deze video wordt gebruikt, exporteert de ruwe fluorescentiemetingen naar een Microsoft Excel-bestand. Nadat de metingen zijn verkregen, opent u de ruwe gegevens in Microsoft Excel.

Kopieer en plak dit vervolgens in een resultatenblad van GraphPad Prism. Bepaal in Prism het gemiddelde van de replica-putjes voor TrpV en PLV. Trek vervolgens voor elke behandeling de gemiddelde PLV-waarde af van de gemiddelde TrpV-waarde. Om vergelijking met replica-experimenten te vergemakkelijken, normaliseert u de gegevens door de achtergrondgecorrigeerde gegevens te delen door de TrpV-putjes met enkel vehicle. Wanneer een experiment meerdere keren is herhaald, voert u een eenweg-variantieanalyse of een one-way ANOVA-test en een post-hoc test voor meervoudige vergelijkingen uit om te bepalen of enige van de behandelingen significant verschilt van de DMSO-behandeling voor elk kanaal. Om kinetische assays uit te voeren, infecteert u de cellen en brengt u de testverbindingen aan zoals voorheen; het is met name belangrijk om een gebufferd medium te gebruiken om de juiste pH te handhaven zonder toevoeging van 5% koolstofdioxide.

Nadat de plaat met plakfolie is afgedicht, wordt deze in de kamer van de plaatlezer geplaatst die is geëquilibreerd op 37 °C. Er moet bijzondere zorg worden betracht om de platen consistent op 37 °C te houden. Dit voorkomt onnodige celstress en condensatie.

Stel de gain van de plaatlezer handmatig in om verzadiging bij latere tijdspunten te voorkomen. Verzamel elk uur metingen gedurende acht tot 24 uur na infectie en normaliseer deze op dezelfde wijze als bij de endpoint-assay. Individuele tijdspunten kunnen op statistische significantie worden geanalyseerd met methoden die vergelijkbaar zijn met die van de eerder beschreven endpoint-assay.

Om de inhibitiepunten te vergelijken, werden HeLa-cellen geïnfecteerd met TrpV- of PLV-vaccinia gekweekt in aanwezigheid van de pokkenvirusremmers AraC, IBT, Rifampicine en ST 246. Deze time-lapse movie toont de sequentiële expressie van groene, rode en blauwe fluoroforen tijdens de virusgroei in controlecellen. Bij infectie in aanwezigheid van het DNA-replicatieblokkerende middel AraC wordt de vroege groene fluorofoor geproduceerd zoals voorheen, maar vindt de intermediaire en late productie van rode en blauwe fluorescentie niet plaats.

Kwantitatieve analyse via spectrometrie toonde een toename van 210% in vroege genexpressie aan, maar een gebrek aan intermediaire en late expressie in cellen behandeld met araC. Cellen die geïnfecteerd waren in aanwezigheid van IBT, waarvan wordt gedacht dat het read-through transcriptie bevordert, vertoonden intermediaire en late expressieniveaus die 24,7% en 2,9% van de controleniveaus bedroegen. Cellen die geïnfecteerd waren in aanwezigheid van ST246 en rifampicine, die remmen na de late genexpressie tijdens de assemblage en rijping van virionen, verschilden niet significant van de controles. Deze resultaten zijn consistent met het bekende werkingsmechanisme van deze verbindingen en suggereren dat het TrpV-reportervirus kan worden gebruikt om de specifieke fase van virale inhibitie voor onbekende verbindingen te identificeren.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met适当 controls. Dit maakt niet alleen een correcte normalisatie van de resultaten mogelijk, maar helpt ook bij het bepalen van een potentieel mechanisme voor uw experimentele verbinding. Vergeet niet dat het werken met vacciniavirus uiterst gevaarlijk kan zijn; draag altijd de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en volg de aanbevolen BSL-2-insluitingstechnieken.