Name: Fosfopeptide Analyse van knaagdieren Epididymal Spermatozoa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Leer fosfopeptide-analyse van muizenepididymale spermatozoa met retrograde spoeltechnieken en titaniumdioxide-verrijking. Deze methode kwantificeert fosforyleringsveranderingen tijdens rijping.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de NHMRC bedanken voor de carrière-ontwikkelingsprijs en de subsidie-ondersteuning APP1066336 die dit werk ondersteunde.

1. Voorbereiding van Cultuur Media en Schotels <ol><li> Maak 200 ml Biggers Whitten en Whitten (BWW) 17 werkende oplossing door het toevoegen van 5,54 g NaCl, 0,356 g KCl, 0,25 g CaCl2, 0,162 g H 2 KO 4 P, en 0,294 g magnesiumsulfaat 4-1 L van Milli-Q water . Dit is de voorraadoplossing en kunnen bij 4 ° C worden bewaard tot een maand. </li><li> Uit de stockoplossing, voeg 420 mg NaHCO3 - 200 mg glucose, 6 mg natriumpyruvaat, 600 mg runderserumalbumine, 0,74 ml natrium lactaat, en 4,0 ml HEPES-buffer met 193 ml van de BWW voorraad. Dit is de werkoplossing en altijd vers op de dag gedaan en geëquilibreerd tot 37 ° C voor gebruik. </li><li> Om de canule te nemen polyethyleen (PE) buis met een inwendige diameter van 0,4 mm en een uitwendige diameter van 1,1 mm en bezit laag vuur (typisch methanolvlam) zodat de buis begint te smelten. Trek onmiddellijk de slang outward te rekken en maken de buitendiameter smaller. </li><li> Snijd een vernauwing van één einde waardoor gemakkelijker canulatie van de vas deferens produceren. </li><li> Snijd het andere uiteinde van de canule tot ongeveer 15 cm. Plaats een 30 G naald in de stomp uiteinde, en bevestig een 3 ml spuit om het (volledig ingetrokken). </li><li> Maak een zuig mondstuk door het snijden van een 20 cm lengte van de PE buis (4,2 mm inwendige diameter, 6,4 mm buitendiameter). Plaats een mondstuk in het ene uiteinde. </li><li> Plaats de micro-capillaire glazen buis houder en de glazen micro-capillaire zelf (gewoonlijk 3 ui van een muis, 40 ui voor een rat). </li></ol> 2. Verwijdering van epididymides van Mouse <ol><li> Euthanaseren muizen volgens IACUC-goedgekeurde aan elke instelling procedures. </li><li> Neem het dier en maak een kleine incisie in het scrotum naar de bijbal bloot. Trek de testis en epididymis uit de holte met behulp van een paar van horlogemaker&#39;s # 5 tang. </li><li> Snijd het vas deferens dat ten minste 1-2 cm blijven aan de cauda epididymis. Bovendien, snijd de proximale efferente leidingen en weefsel aansluiten van de bijbal naar de testis en verwijder de hele mannelijke reproductieve spoor. </li><li> Plaats het gehele mannelijke reproductieve spoor onder een dissectie microscoop met een vergroting bereik in de orde van 5-40X. </li></ol> 3. cannulating de bijbal <ol><li> Tape langs de canule om de microscoop, zodat 1-2 cm van de vernauwde (kegelvormige) uiteinde is vrij en zichtbaar door de lens. </li><li> Neem een ​​paar horlogemakersgereedschappen # 5 tang en voorzichtig gesp weerszijden van de vas deferens en trek de vas deferens op de canule, zodat de canule gaat in de vas deferens. </li><li> Neem een ​​lengte van niet-absorbeerbare zwart gevlochten behandeld zijde (maat 5-0) en legt een knoop rond de gecannuleerd zaadleider. Zorg ervoor dat de knoop is strak getrokken om de canule in de zaadleider te houden wanneer de luchtdruk frOM de injectiespuit wordt toegepast. </li></ol> 4. Retrograde of Backflushing van Caudale Epididymal Spermatozoa <ol><li> Met behulp van horlogemakers # 5 tang, pak het distale einde van de cauda epididymides en verwijder de tunicaalbuginea om één epididymis tubulus bloot. </li><li> Met behulp van de tang, trek de tubuli te belichten en plagen elkaar teneinde een opening te creëren voor sperma vrijkomen. </li><li> Druk voorzichtig op de 3 ml (muis) of 20 ml (rat) spuit zodat lucht uit de spuit in de zaadleider. Bij de juiste druk wordt spermatozoa beginnen uit de gebroken tubulus langzaam komen aan het distale uiteinde van de cauda epididymis. Op dit moment afzuigen op het mondstuk om spermatozoa te trekken in de glazen capillair. Opmerking: doorgaans in een muis, kan 2-3 gl spermatozoa verkregen worden afhankelijk van de leeftijd van het dier. Een rat wil, op de gemiddelde opbrengst 30-40 pi. </li></ol> 5. Wassenen lyseren van de spermatozoa in de voorbereiding voor Proteomics <ol><li> Verdrijf de spermatozoa van de glazen capillair in 1 ml oplossing van BWW-oplossing (37 ° C) door voorzichtig te blazen in het mondstuk of het aanbrengen van een spuit en uitlaatluchtgeleiding teneinde de spermatozoa terug duwen van de capillair. </li><li> Zodra de zaadcellen worden verspreid, wassen 3x (300 x g, 5 min) met 1 ml BWW om verontreinigende eiwitten te verwijderen. Na de laatste wasbeurt, verwijder het supernatant. Opmerking: Op dit punt kan de zaadcellen voor later gebruik worden ingevroren. </li><li> Oplosbaar eiwit met 4% CHAPS, 2 M thioureum en 50 mM Tris, pH 7,4 gedurende 1 uur met intermitterende vortexen. </li><li> Na lyseren van de cellen gecentrifugeerd (10000 xg, 20 minuten), en neemt supernatant naar een nieuwe buis. Opmerking: Op dit punt kunnen eiwit kwantificering worden uitgevoerd. </li></ol> 6. disulfideband Vermindering en Alkylatie <ol><li> Voeg 10 mM DTT als een uiteindelijke concentratie aan seerde eiwitten, vortaf en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. </li><li> Voeg 50 mM idodoacetamide een uiteindelijke concentratie lysaat, vortex en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min in het donker. </li></ol> 7. Neerslag <ol><li> Methanol chloroform precipiteren het monster door het toevoegen van 1 volume van lysaat (400 pl als voorbeeld), voeg een volume (400 pl) methanol en 0,5 volume (200 pl) chloroform. </li><li> Vortex het monster en draaien (10.000 xg, 2 min). </li><li> Merk op dat twee fasen worden verkregen na centrifugeren. Gooi alles maar 2 mm van de bovenste laag (zorg dat u de interface van niet te storen). </li><li> Voeg 1 volume (400 pl) methanol, invertsuiker buis voorzichtig 1-2x te mengen en opnieuw centrifugeren (10.000 x g, 15 min). Gooi supernatant te verspillen en de lucht drogen pellet voor 3-4 min. </li></ol> 8. trypsinedigestie <ol><li> Reconstitueren trypsine in 25 mM ammonium bicarbonaat bevattende 1 M ureum tot een verhouding van 50: 1 (W / W, eiwit: trypsine) en geïncubeerd overnight bij 37 ° C bij voorkeur bij 700 rpm op een thermomixer. </li><li> Spin (10.000 xg, 15 min) om onverteerde materiaal pellet. Transfer supernatans naar nieuwe buis. </li></ol> 9. fosfopeptide Verrijking <ol><li> Voer zuivering en verrijking van fosfopeptiden uit het tryptische digest zoals eerder beschreven 18. Verdun tryptische peptiden 10-voudig DHB buffer [DHB buffer bestaat uit: 350 mg / ml 2,5 dihydrobenzesulfonic acid (DHB), 80% (v / v) ACN (acetonitril), 2% (v / v) TFA (trifluorazijnzuur acid)] en toepassing drogen TiO2 kralen (200 ug). </li><li> Laat op een rotator bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Was het monster met DHB buffer, draaien en verwijder supernatant. Was daarna het monster driemaal met wasbuffer [80% ACN (v / v), 2% TFA (v / v)] om de DHB verwijderen. </li><li> Na het centrifugeren, direct elueren de fosfopeptiden via elutiebuffer door toevoeging van 25 pi 2,5% ammoniumhydroxide, pH ≥ 10.5 oplossing. Spin en verwijder het supernatant. Onmiddellijk neutraliseren ~ 0,3 pl mierenzuur. </li></ol>

<ol><li>Blandau, R., Rumery, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+of+swimming+movements+of+epididymal+spermatozoa+to+their+fertilizing+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">The relationship of swimming movements of epididymal spermatozoa to their fertilizing capacity.</a> Fertil. Steril. 15, 571-579 (1964).</li>
<li>Tournade, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diff%C3%A9rence+de+motilit%C3%A9+des+spermatozo%C3%AFdes+pr%C3%A9lev%C3%A9s+dans+les+divers+segments+de+l%E2%80%99%C3%A9pididyme%5BTitle%5D)+AND+%22C.+R.+Soc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Différence de motilité des spermatozoïdes prélevés dans les divers segments de l’épididyme.</a> C. R. Soc. Biol. 74, 738-739 (1913).</li>
<li>Wyker, R., Howards, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropuncture+studies+of+the+motility+of+rete+testis+and+epididymal+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Micropuncture studies of the motility of rete testis and epididymal spermatozoa.</a> Fertil. Steril. 28, 108-112 (1977).</li>
<li>Eddy, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+germ+cell+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+progress+in+hormone+research%22%5BJournal%5D)">Male germ cell gene expression.</a> Recent progress in hormone research. 57, 103-128 (2002).</li>
<li>Lin, M., Lee, Y. H., Xu, W., Baker, M. A., Aitken, R. J. Ontogeny of Tyrosine Phosphorylation-Signaling Pathways During Spermatogenesis and Epididymal Maturation in the Mouse. 75 (4), 588-597 (2006).</li>
<li>Jones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+structure+and+remodelling+during+sperm+maturation+in+the+epididymis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil.+Suppl%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane structure and remodelling during sperm maturation in the epididymis.</a> J. Reprod. Fertil. Suppl. 53, 73-84 (1998).</li>
<li>Robaire, B., Hinton, B. T., Orgebin-Crist, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRobaire%2C+B+%22The+Epididymis%22">The Epididymis</a>. Neill, J. D. 3, Elsevier. 1072-1120 (2006).</li>
<li>Lacham, O., Trounson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilizing+capacity+of+epididymal+and+testicular+spermatozoa+microinjected+under+the+zona+pellucida+of+the+mouse+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Fertilizing capacity of epididymal and testicular spermatozoa microinjected under the zona pellucida of the mouse oocyte.</a> Mol. Reprod. Dev. 29, 85-93 (1991).</li>
<li>Bedford, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+duct+ligation+on+the+fertilizing+ability+of+spermatozoa+from+different+regions+of+the+rabbit+epididymis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Effects of duct ligation on the fertilizing ability of spermatozoa from different regions of the rabbit epididymis.</a> J. Exp. Zool. 166, 271-281 (1967).</li>
<li>Orgebin-Crist, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+function+of+the+epididymis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol%2C+Reprod%22%5BJournal%5D)">Studies on the function of the epididymis.</a> Biol, Reprod. 1, 155-175 (1969).</li>
<li>Orgebin-Crist, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+spermatozoa+in+the+rabbit+epididymis%3A+effect+of+castration+and+testosterone+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Maturation of spermatozoa in the rabbit epididymis: effect of castration and testosterone replacement.</a> J. Exp. Zool. 185, 301-310 (1973).</li>
<li>Lin, M., Hess, R., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+sperm+maturation+in+vitro+in+epididymal+cell+cultures+of+the+tammar+wallaby+%28Macropus+eugenii%29%3A+disruption+of+motility+initiation+and+sperm+morphogenesis+by+inhibition+of+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Induction of sperm maturation in vitro in epididymal cell cultures of the tammar wallaby (Macropus eugenii): disruption of motility initiation and sperm morphogenesis by inhibition of actin polymerization.</a> Reproduction. 124, 107-117 (2002).</li>
<li>Baker, M. A., Hetherington, L., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+SRC+as+a+key+PKA-stimulated+tyrosine+kinase+involved+in+the+capacitation-associated+hyperactivation+of+murine+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of SRC as a key PKA-stimulated tyrosine kinase involved in the capacitation-associated hyperactivation of murine spermatozoa.</a> J. Cell. Sci. 119, 3182-3192 (2006).</li>
<li>Baker, M. A., Hetherington, L., Curry, B., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+and+consequent+stimulation+of+the+tyrosine+kinase+c-Abl+by+PKA+in+mouse+spermatozoa%3B+its+implications+during+capacitation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation and consequent stimulation of the tyrosine kinase c-Abl by PKA in mouse spermatozoa; its implications during capacitation.</a> Dev. Biol. 333, 57-66 (2009).</li>
<li>Baker, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Titanium+Dioxide+To+Find+Phosphopeptide+and+Total+Protein+Changes+During+Epididymal+Sperm+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Use of Titanium Dioxide To Find Phosphopeptide and Total Protein Changes During Epididymal Sperm Maturation.</a> J. Proteome. Res. 10 (3), 1004-1017 (2010).</li>
<li>Baker, M. A., Weinberg, A., Hetherington, L., Velkov, T., Aitken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-Ejaculatory+Changes+in+the+Metabolic+Status+of+Rat+Spermatozoa+as+Measured+by+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Post-Ejaculatory Changes in the Metabolic Status of Rat Spermatozoa as Measured by GC-MS.</a> Metabolomics. 11, 1-14 (2012).</li>
<li>Biggers, J. D., Whitten, W. K., Whittingham, D. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBiggers%2C+JD+%22The+culture+of+mouse+embryos+in+vitro%22">The culture of mouse embryos in vitro</a>. , Freeman. (1971).</li>
<li>Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+from+peptide+mixtures+using+titanium+dioxide+microcolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns.</a> Mol. Cell. Proteomics. 4, 873-886 (2005).</li>
<li>Wessel, D., Flugge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Anal. Biochem. 138, 141-143 (1984).</li>
<li>Thingholm, T. E., Jorgensen, T. J., Jensen, O. N., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+using+titanium+dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides using titanium dioxide.</a> Nat. Protoc. 1, 1929-1935 (2006).</li>
<li>Thingholm, T. E., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+titanium+dioxide+micro-columns+to+selectively+isolate+phosphopeptides+from+proteolytic+digests%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of titanium dioxide micro-columns to selectively isolate phosphopeptides from proteolytic digests.</a> Methods. Mol. Biol. 527, 57-66 (2009).</li>
<li>Ecroyd, H., Asquith, K. L., Jones, R. C., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+signal+transduction+pathways+during+epididymal+maturation+is+calcium+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The development of signal transduction pathways during epididymal maturation is calcium dependent.</a> Dev. Biol. 268, 53-63 (2004).</li>
<li>Ecroyd, H., Jones, R. C., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+Phosphorylation+of+HSP-90+During+Mammalian+Sperm+Capacitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Tyrosine Phosphorylation of HSP-90 During Mammalian Sperm Capacitation.</a> Biol. Reprod. 69 (6), 1801-1807 (2003).</li>
<li>Jones, R., Mann, T., Sherins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxidative+breakdown+of+phospholipids+in+human+spermatozoa%2C+spermicidal+properties+of+fatty+acid+peroxides%2C+and+protective+action+of+seminal+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa, spermicidal properties of fatty acid peroxides, and protective action of seminal plasma.</a> Fertil. Steril. 31, 531-537 (1979).</li>
<li>Wade, M. A., Jones, R. C., Murdoch, R. N., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+activation+and+second+messenger+signalling+in+spermatozoa+from+rat+cauda+epididymidis%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Motility activation and second messenger signalling in spermatozoa from rat cauda epididymidis.</a> Reproduction. 125, 175-183 (2003).</li>
<li>Nolan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm-specific+protein+kinase+A+catalytic+subunit+C%7Balpha%7D2+orchestrates+cAMP+signaling+for+male+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Sperm-specific protein kinase A catalytic subunit C{alpha}2 orchestrates cAMP signaling for male fertility.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13483-13488 (2004).</li>
<li>Mitchell, L. A., Nixon, B., Baker, M. A., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+role+of+SRC+in+capacitation-associated+tyrosine+phosphorylation+of+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Investigation of the role of SRC in capacitation-associated tyrosine phosphorylation of human spermatozoa.</a> Mol. Hum. Reprod. 14, 235-243 (2008).</li>
<li>Leclerc, P., Goupil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+human+sperm+tyrosine+kinase+c-yes.+Activation+by+cyclic+adenosine+3%27%2C5%27-monophosphate+and+inhibition+by+Ca%282%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Regulation of the human sperm tyrosine kinase c-yes. Activation by cyclic adenosine 3',5'-monophosphate and inhibition by Ca(2).</a> Biol. Reprod. 67, 301-307 (2002).</li>
<li>Krapf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Ser%2FThr+phosphatases+induces+capacitation-associated+signaling+in+the+presence+of+Src+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Ser/Thr phosphatases induces capacitation-associated signaling in the presence of Src kinase inhibitors.</a> J. Biol. Chem. 285, 7977-7985 (2010).</li>
<li>Lundgren, D. H., Hwang, S. I., Wu, L., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+spectral+counting+in+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Role of spectral counting in quantitative proteomics.</a> Expert. Rev. Proteomics. 7, 39-53 (2010).</li>
<li>Platt, M. D., Salicioni, A. M., Hunt, D. F., Visconti, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+differential+isotopic+labeling+and+mass+spectrometry+to+analyze+capacitation-associated+changes+in+the+phosphorylation+status+of+mouse+sperm+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Use of differential isotopic labeling and mass spectrometry to analyze capacitation-associated changes in the phosphorylation status of mouse sperm proteins.</a> J. Proteome. Res. 8, 1431-1440 (2009).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De kritische stappen voor een succesvolle en reproduceerbare proteoomanalyse van spermatozoa zijn: 1) de zuiverheid van het uitgangsmateriaal; 2) het verwijderen van ongewenste zouten en wasmiddelen; 3) denatureren eiwitten volle omvang zodat de trypsine om een ​​hoge opbrengst van eiwitten verteren en 4) het minimaliseren monsterbehandeling verlies van peptide verminderen. Om met succes Backflushing de cauda epididymis, is het essentieel om het gebied waar de spermatozoa verlaat vinden. Bij zowel ratten en muizen, dit is op de top van het concave gebied, in het midden van het caudale deel van de bijbal (zie figuur 2A). Als men gaat verder in de richting van de zaadleider, terugspoelen is makkelijker en het slagingspercentage is over het algemeen hoger. Echter, dit gaat ten verlies van het aantal zaadcellen. Alternatief, als men probeert meer proximaal naar het corpus, dan de hoeveelheid druk vereist om de spermatozoa terug duwen door de epididymAl kanalen is vaak zo groot, dat schade aan de bijbal onvermijdelijk optreedt. Backflushing van de bijbal wordt traditioneel uitgevoerd met behulp van water verzadigd minerale olie en een gebalanceerde zoutoplossing in de spuit zichzelf als een medium om de spermatozoa 22-25 verwijderen. Beide procedures zijn potentieel problematische van LC-MS. Ten eerste minerale wil de nano-C18 nano-kolommen die in principe wereldwijd gebruikt voor proteoomanalyse en zorg moet worden genomen, zodat er geen voorwaarts in de procedure plaatsvindt blokkeren. Wanneer dit gebeurt, is het onmogelijk worden en het monster in wezen verloren. Dit kan worden ondervangen door het gebruik van BWW of andere gebalanceerde zoutoplossingen in de spuit, maar hoewel dit succes, al snel onderkend dat veel van de spermatozoa worden beweeglijke zodra de BWW oplossing in contact kwam en gemengd met de caudale epididymis cellen. Om dit probleem te omzeilen we gewoon Backflush de spermatozoa met lucht. Niet alleen is de Qualheid van spermatozoa vergelijkbaar is met vloeistof gebaseerde methoden, maar de hoeveelheid is identiek. Phosphoproteomics is misschien wel een van de weinige manieren om vast te stellen welke signaalwegen die zich in spermatozoa na de ejaculatie. Eén van de belangrijkste wegen onderzoeken we het proces capacitation. Spermatozoa moet ondergaan &quot;capacitation&quot; voordat het kan binden aan een ei. In de praktijk wordt dit in principe bereikt door incubatie spermatozoa voor een tijdsduur (muizen 40 min; rat 1,5 uur; menselijk 3-24 uur) in BWW oplossing serumalbumine. Eerder wij en anderen hebben aangetoond een rol voor verschillende kinasen betrokken capacitation. Van belang, schrapping van de PKA μ II produceren muizen waarvan de spermatozoa zwemmen spontaan in vitro, maar kan hyperactivation 26 niet te ondergaan. De laatste is een kenmerk van capacitation waarbij spermatozoa veranderen zwemmen patroon van een hoge snelheid, lage amplitude, een lagesnelheid, hoge amplitude verslaan frequentie. We hebben laten zien stroomafwaarts kinases betrokken bij dit proces zijn onder pp60-CSRC (SRC) 13,27 c-ja 28 en c-ABL 14. Interessant remming van SRC stopt capacitation-afhankelijke tyrosine fosforylatie 13. Dit kan echter worden overwonnen met okadazuur, suggereert dat SRC is niet direct betrokken bij de algemene begin van tyrosinefosforylering 29 maar kan een fosfatase 29 reguleren. Het probleem met het gebruik BWW als een medium om spermatozoa te dwingen uit de bijbal is dat eenmaal geactiveerd, muis spermatozoa slechts ongeveer 40 min naar capacitate. Omdat isolatie van spermatozoa 5 min / muis en vaak meerdere muizen bij een proef kan nemen, dan spermatozoa wordt in verschillende stadia van rijpheid het begin van het experiment. Om dit te overwinnen, kan luchtdruk worden gebruikt om de spermatozoa uit de caudale bijbal duwen in een glas canule. Niet alleen zijn de zaadcellen Inactive voornamelijk als ze worden gevonden in de caudale milieu, het maakt het mogelijk om niet-beweeglijke en beweeglijke phosphoproteomics vergelijken. Steekproef hanteren voor phosphoproteomics moet worden tot een minimum beperkt bij het vergelijken van spermatozoa in twee verschillende functionele toestanden. Het gebruik van methanol chloroform boven andere traditionele methoden van eiwitprecipitatie 1) neemt de noodzaak van extra stappen wassen, 2) verwijdert nagenoeg alle sporen van zouten en vetten en 3) een bewezen vermogen lage abundantie proteïnen te precipiteren via TCA 19. Eiwitprecipitatie voor trypsine digestie wordt aanbevolen aangezien niet alleen werkt dit eiwit (dat trypsine digestie hulp) denatureren, maar verwijdert veel van de MS-incompatibele metabolieten in de cel aanwezig. De vergelijking van sperma fosfopeptiden kan op een aantal manieren. Op basisniveau Een vergelijking van de geïdentificeerde fosfopeptiden in een monster, dat in een anderemonster in het proces dat bekend staat als &quot;spectrale tellen&quot; kan worden gedaan. Maar de kritiek is geweest op deze aanpak voornamelijk omdat vroege proteomics studies werden met behulp van lage herhalingen (Voor een nadere bespreking zie Lundren et al. 30). Een meer verfijnde aanpak is te kijken naar de intensiteit van de peptide ouder massa en vergelijk dit met de andere monsters (label-free vergelijking). In het in figuur 4 kan bijvoorbeeld een peptide afwezig in de uit onbeweeglijk (figuur 4 boven), maar in de beweeglijke (figuur 4 onder) spermatozoa van m / z 650-670 zichtbaar. Dit proces, aangeduid als MS-gebaseerde label vrij kwantificering is een label vrij strategie. Een alternatieve strategie vaak gebruikt om de hoeveelheid runs nodig proteomische kwantificering verminderen is isotopen gebruiken. Aangezien de massa van een isotoop verschillend kan de massa spectrometer worden gebruikt om de intensiteit van de Elut vergelijkening peptiden. Anders dan de meeste andere celtypes, wat isotopische labeling kan niet worden toegepast op spermatozoa. Bijvoorbeeld, de toevoeging van stabiele isotopen (een zware isotoop wordt toegevoegd aan een monster, terwijl een lichtere versie wordt toegevoegd aan de andere) kan in weefselkweek. Wanneer de isotopen te opgenomen in het eiwit kan een proteomics analyse worden uitgevoerd door combineren van de twee monsters (multiplexing). Echter in het geval van spermatozoa, kan dit niet worden gedaan, louter op grond van het feit dat 1) isotopen vereist aantal passages (tot 8) in weefselkweek en 2) de zaadcellen geen nucleaire gentranscriptie en translatie en dus ze kunnen niet de isotopen in al hun eiwitten op te nemen toch. Een manier om dit is om radioactief gelabelde muizen te bestellen, maar deze zijn berucht duur. Een alternatieve benadering is om een ​​chemische tag. Dit werd gedaan wanneer niet capacitated muizen werden vergeleken met capacitated muizen. In dit geval, een D 0 en D <sub&gt; 3 -label werd gebruikt om onderscheid te maken tussen een monster en een andere in de massaspectrometer 31. Andere benaderingen omvatten het gebruik van iTRAQ (isobare tag voor relatieve en absolute kwantificatie), waarbij lysinen chemisch gelabeld met verschillende massa isotopen; iCAT (isotoop gecodeerd affiniteitsmerker) waarbij cysteinen zijn gelabeld met verschillende massa isotopen en zware en lichte water etikettering. In elk geval echter één ding moet in gedachten worden gehouden. De MS rapporteert alleen wat in een monster aanwezig is, en dit is een weerspiegeling van alles wat er is gebeurd met dat monster tot op dat punt. Minimaliseren monsterbehandeling terwijl maximale opbrengst bij elke stap is noodzakelijk om een ​​succesvolle proteoomanalyse.

Na voortgekomen uit de testis worden spermatozoa gedifferentieerde nog opmerkelijk, deze cellen onvolwassen 1,2. Als zodanig zijn ze missen complete functionaliteit, zoals de mogelijkheid om te zwemmen en binden aan een oöcyt 3. Hoewel verdere rijping van de zaadcel vereist, kan deze niet plaatsvinden via canonieke routes, aangezien in deze fase van hun mobiele differentiatieproces, ze niet in staat zijn gentranscriptie en andere eiwit biosynthese 4. Biologische bevoegdheid aan spermatozoa verleend zij de testis verlaten en een deel van het mannelijke voortplantingssysteem zogenaamde bijbal 5. De bijbal is een strak opgerolde, zeer gedifferentieerde buis die de efferente leidingen (van de testis) wordt aangesloten op de zaadleider en is aanwezig in alle mannelijke zoogdieren 6 is. Spermatozoa geleidelijk tijdens epididymaire afdaling hun bemesten potentieel te verwerven, met een beroep op de steeds veranderende luminale omgeving die crat &#39;s avonds door de lokale epididymaire epitheelcellen 7. De diverse secretoire en re-absorberende activiteiten aanwezig in de epididymis milieu handeling aan het sperma zelf te wijzigen, zijn eiwitten, koolhydraten en lipiden 6 veranderen. Het belang van de epididymis, meer bepaald de aanvankelijke &#39;caput&#39; gebied van deze structuur is geïllustreerd middels chirurgische ligatie technieken 8. Spermatozoa behouden binnen de testis door efferente duct ligatie worden volledig ontbreekt in welke hoedanigheid om de eicel te bevruchten 9-11. Naast de epididymis milieu, signaaltransductieroutes in de spermatozoa werk post-translationeel de bestaande zaadcel complement wijzigen. Bijvoorbeeld spermatozoa van de vroege regio van de bijbal tonen verschillende patronen eiwit fosforylering vergeleken met die laatste regio 5,12. Dit is niet verrassend aangezien er grote verschillen in de capability van het sperma van deze regio&#39;s. Bijvoorbeeld, spermatozoa uit het begin, caput bijbal zijn immotilite. Daarentegen zal zaadcellen de cauda regio vooruit vertonen progressieve beweeglijkheid eenmaal geplaatst in isotoon medium. Aangezien epididymale zaadcellen in staat de-novo proteïne biosynthese, moeten alle intrinsieke routes reguleren spermafunctie worden door post-translationele modificaties (PTM). Daarom ligt het voor dat proteomics redeneren, en in het bijzonder het onderzoek van PTMs zoals fosforylering een speerpunt moeten zijn als we zijn om sperma celrijping begrijpen. Een alternatieve methode om spermatozoa te verkrijgen van de epididymidies gebruik retro-terugspoelen 13-16. Hoewel deze techniek is zeker tijdrovend en draait grotere actie van de operator, de spermatozoa verkregen vaste tonen zuiverheid van meer dan 99,99%. In tegenstelling tot alle andere technieken, spermatozoa can afzonderlijk in een rusttoestand, waardoor het mogelijk om te bestuderen hoe spermamotiliteit geïnitieerd. Als monster voorbereiding is het belangrijkste aspect voor proteoomanalyses isolatie van spermatozoa is uitgegroeid tot één van de belangrijkste aspecten van het sperma-proteomics studies. Dit protocol geeft een uitleg over hoe spermatozoa worden geïsoleerd van de cauda epididymis. Hierna wordt de TiO 2 fosfopeptide verrijkingsprocedure geschetst, met een specifieke verwijzing over hoe peptiden te extraheren uit de zeer gedifferentieerde zaadcellen. De MS benadering kan worden aan veranderende fosfopeptiden onderscheiden wanneer men de caudale epididymis spermatozoa vergelijken op een toestand (immotile of niet capacitated) naar een andere (beweeglijke, capacitated, acrosome gereageerd, etc.) waardoor dit een krachtige aanpak om sperma te bestuderen functie.

<table><tbody><tr><td>2,5-Dihydroxy-1,4-benzoquinone</td><td>Aldrich</td><td>195464</td><td></td></tr><tr><td>2-D Quantitation Kit</td><td>VWR (GE Healthcare)</td><td>80-6483-56</td><td></td></tr><tr><td>Albumine uit bovijn serum</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniak oplossing 25%</td><td>Merck</td><td>1.05432</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonaat</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propaansulfonaat</td><td>Research Organics</td><td>1300C</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>BDH</td><td>10077.6B</td><td></td></tr><tr><td>Dinatriumwaterstoffosfaat</td><td>Merck</td><td>1.06580</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Mierenzuur</td><td>Sigma</td><td>O6440</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine-L</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (vrije zuur)</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Iodoazijnzuur vrije zuur</td><td>Sigma</td><td>I4386</td><td></td></tr><tr><td>Melkzuur</td><td>Sigma</td><td>L1750</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Res. Org.</td><td>0090M</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Merck</td><td>10158.6B</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (steriel)</td><td>VWR (GE Healthcare)</td><td>GEHE17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt</td><td>ThermoFisher Scientific (Pierce)</td><td>PIE78420</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumwaterstoffosfaat</td><td>Medical Store</td><td>CH 600</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Sigma</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdiwaterstoffosfaat</td><td>Merck</td><td>1.06346</td><td></td></tr><tr><td>Natriumwaterstoffosfaat</td><td>BDH</td><td>10247.4V</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Tris, ultra pure grade</td><td>Amresco (Astral)</td><td>AM0497</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine Gold, mass spec grade</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>Zinkchloride</td><td>Sigma</td><td>Z0173</td><td></td></tr><tr><td>0,4 mm Polyethyleen buis</td><td>Goodfellow</td><td>ET317100</td><td></td></tr><tr><td>30 G naald</td><td>Terumo</td><td>NN2038R</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Syringe</td><td>Terumo</td><td>SS035</td><td></td></tr><tr><td>4,2 mm Polyethyleen buis</td><td>Goodfellow</td><td>ET317640</td><td></td></tr><tr><td>Gevlochten zijde (5-0)</td><td>Dynek</td><td>CSS0100</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroazijnzuur</td><td>Sigma</td><td>299537</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 kralen (van gedemonteerde kolom)</td><td>Titansphere</td><td>6HT68003</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf buisje</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>C7B30</td><td>Sigma</td><td>C0856</td><td></td></tr></tbody></table>

fosfopeptide analyse van knaagdieren epididymal spermatozoa

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Spermatozoa zijn uniek onder celtypen. Hoewel geproduceerd in de testis, zowel nucleaire gen transcriptie en translatie worden uitgeschakeld zodra de pre-cursor ronde cel begint te verlengen en te differentiëren in wat morfologisch erkend als een zaadcel. Echter, de zaadcel zeer onrijp, zonder mogelijkheid voor motiliteit of eieren herkenning. Beide gebeurtenissen zich voordoen zodra de spermatozoa doorvoer een secundaire orgel bekend als de bijbal. Tijdens de ~ 12 dagen passage dat het duurt voor een zaadcel om door de bijbal passeren, post-translationele modificaties van bestaande eiwitten spelen een centrale rol in de rijping van de cel. Een belangrijk facet van dergelijke is eiwitfosforylatie. Om fosforylering gebeurtenissen tijdens spermarijping karakteriseren moeten zowel zuivere zaadcel populaties en pre-fractionering van fosfopeptiden worden vastgesteld. Met terugspoeling technieken, een methode voor het isoleren van zuivere spermatozoa of hoge kwaliteit en opbrengst van de distale of caudale epididymides wordt geschetst. De stappen voor solubilisatie, spijsvertering en pre-fractionering van sperma fosfopeptiden via TiO2 affiniteitschromatografie toegelicht. Eenmaal geïsoleerd, kan fosfopeptiden worden geïnjecteerd in MS zowel proteïne fosforylatie gebeurtenissen van specifieke aminozuurresiduen de niveaus van fosforylatie plaatsvindt tijdens de spermarijping processen te identificeren en te kwantificeren.

De kwaliteit van de resultaten van een proteomische analyse sterk afhankelijk van het uitgangsmateriaal. Met de moderne MS, zijn lichte verontreinigingen in monster voorbereidingen gemakkelijk opgepikt. Daarom is het kritisch, bij zaadcel proteomics, een methode zeer zuivere spermatozoa geeft kiezen. Zoals geïllustreerd in figuur 1, wordt retrograde backflushing gebruikt zaadcellen opvragen via het cauda epididymis. Dit houdt cannulating de zaadleider met PE buis waarmee men langzaam toe te passen luchtdruk uit de spuit bevestigd. Figuur 1A toont de cauda epididymis samen met de zaadleider. Figuur 1B is een close-up shot van hoe de zaadleider wordt vastgebonden, waar de canule wordt ingebracht. Hierbij w, spermatozoa worden vrijgegeven op het uitgesneden einde van een buisje uit de caudale epididymides. Zoals getoond in figuur 2A, worden de spermatozoa geëxtraheerd uit de top gebieden van de caudeen epididymis en opgezogen in een glazen capillair in een rusttoestand (figuur 2B). Dit heeft meerdere voordelen boven traditionele &quot;swim-up&quot; methode, niet de minste daarvan is het vermogen om een ​​phoshoproteomic analyse van spermatozoa uitgevoerd vóór en na de activering van motiliteit. De zaadcellen kunnen dan worden uitgestoten in de media van zijn keuze. Figuur 2C (linkerkant) laat zien hoe het sperma direct kijken na uitzetting naar BWW media. Veel van de cellen samen samengeklonterd. Echter, na 10 min de bevoegdheid van de cellen aangetoond omdat ze te zwemmen om de homogeniteit in de oplossing (figuur 2C, rechterzijde cellen). Aangezien het terugspoelen techniek heeft weinig invloed op de zaadcellen, verkrijgen wij bijna 100% motiliteit en de cellen dispergeren snel in de media zonder externe provocatie. In een typisch backflushing experiment, sperma hersteld van de Zwitsers-muis bevattussen 1-5 x 10 6 cellen. Dit is sterk afhankelijk van de leeftijd van het dier en kan variëren van verschillende muizenstammen. In een Noorse rat, we meestal 200 x 10 6 spermatozoa te verkrijgen ± 20%. Figuur 2D geeft de zuiverheid van spermatozoa verkregen door de rat cauda epididymis. Naast het monster zelf, een van de belangrijkste kwesties met betrekking tot monstervoorbereiding is het rendement van trypsine spijsvertering. Eiwit neerslag speelt een belangrijke rol, niet alleen in het verwijderen van ongewenste detergentia en zouten, die beide onverenigbaar met MS, maar ook eiwitten denatureren. We hebben de methanol-chloroform neerslag het beste te werken gevonden. Niet alleen is deze procedure gemeld lage overvloedige eiwitten beter dan anderen waaronder TCA precipitatie 19 neerslaan, maar heeft extra voordelen. Na TCA precipitatie, is het vaak noodzakelijk om de pH passen na schorsing van de TCA pellet die vrij kan blijvenzuur. Hoewel de neergeslagen pellet van TCA in hoge organische oplossingen kan worden gewassen om het zuur te verwijderen, dit draagt ​​bij aan proeven hanteren en irreproducibility van de resultaten. Als de zuur neutraliseren zal resulteren in slechte tryptische peptide opbrengsten. Methanol-chloroform neerslag is niet alleen snel, maar zal het monster niet verzuren. Figuur 3 illustreert het eiwit pellet meestal gezien van 100 ug van het monster tussen de onderste en bovenste interfase. De isolatie van fosfopeptiden kan voorkomen in een aantal opzichten; echter reproduceerbaarheid afhankelijk van het monster is behandeld tot en met deze fase. Een van de meest voorkomende, ontwikkelen methoden TiO 2, oorspronkelijk ontwikkeld door de groep Martin Larsen 18,20,21. Hoewel beschreven als een werkwijze voor gebruik in microkolommen, kunnen we reproduceerbare gegevens te verkrijgen via batch chromatografie. Het succes van het proces is sterk afhankelijk van de elutiebuffer, moet die gek<html> e de juiste samenstelling; anders fosfopeptiden geëlueerd niet helemaal. De reproduceerbaarheid van het protocol en representatieve gegevens van TiO 2 verrijkte fosfopeptiden van cauda epididymis sperma in een onbeweeglijk (figuur 4 boven) en beweeglijk (figuur 4 onder) toestand van m / z 650-670 zichtbaar. We hebben aangetoond dat dit een zeer reproduceerbaar techniek ook bij gebruik van biologische herhalingen 17. De blauwe strepen verschijnen tijd peptiden elueren uit C18 nano-kolom als de concentratie acetonitril toeneemt. Het spreekt voor zich beweeglijke populatie (n = 3 getoond, n = 8 loopt gewoonlijk), is een peptide cluster, met een mono-isotopische massa rond de 651,5 Da bereik dat volledig afwezig in de niet-beweeglijke range. Tandem massaspectrometrie wordt vervolgens gebruikt om het peptide te identificeren. 546 / 51546fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figuur 1:. Canulatie van de cauda epididymis (A) Foto van de cauda epididymis. De canule zelf is vastgeplakt ongeveer 1-2 cm van de pre-getrokken end bloot. Dit wordt in de zaadleider ingevoegd met behulp van fijne # 5watchmakers tang. (B) De canule wordt op zijn plaats gehouden door koppelverkoop fijne zijde rond een segment met zowel de zaadleider en de canule. Uit de muis, ongeveer 2-3 ul caudale epididymale cellen en vloeistof worden verzameld in een concentratie van 1 x 10 6 / ul. Uit de rat (getoond) ongeveer 30-40 pl vloeistof verkregen bij soortgelijke concentraties. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig2highres.jpg" /> Figuur 2: Glas capillaire gebruikt om competente epididymaire spermatozoa te verzamelen. (A) Een buisje van de top van de cauda e<html> pididymis is geïsoleerd en gebroken. De geschatte positie van waaruit dit gebeurt wordt getoond. (B) De bovenkant van het beeld toont een leeg glas capillair en de onderste toont één van een eerder teruggespoeld rat. Er is geen bloed besmetting en minimale verontreiniging epitheliale cellen. (C) Aangezien de spermatozoa nog onverdund in de epididymis fluïdum, zijn ze niet beginnen te activeren. Wanneer de spermatozoa in eerste instantie worden uitgestoten in een BWW oplossing, ze komen als een compacte &quot;string&quot; (Linkerkant). De bevoegdheid van de cel wordt eenvoudig ingesteld, want na 10 minuten het grootste deel van de zaadcellen zwemmen in oplossing zonder externe verstoring (aan de rechterkant). (D) Een foto van een monster van caudale epididymaal cellen onmiddellijk nadat ze zijn vertrokken om te zwemmen out toont de zuiverheid van de cellen. g3highres.jpg &quot;/&gt; Figuur 3:. Methanol-chloroform precipitatie eenmaal spermatozoa oplosbaar zijn, de oplosbare fractie methanol-chloroform geprecipiteerd denaturatie van de eiwitten en verwijdering van verontreinigende stoffen. De proteïne pellet wordt op het grensvlak tussen de methanol / water en chloroform fase. De bovenste laag wordt voorzichtig verwijderd om niet deze pellet te verstoren. Het is gebruikelijk ongeveer 2-3 mm van de bovenste fase verlaten zodat geen eiwit verloren. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig4highres.jpg" width="600" /> Figuur 4:. Typische TiO 2 verrijkte fosfopeptide profiel met de beschreven protocol werd caudaal epididymale spermatozoa geïsoleerd in beide immotile (top, N = 3) of beweeglijke toestanden (bottom, N = 3). Een peptide cluster met een mono-isotopische massa van ~ 651,5 Deen wordt aangetroffen in de beweeglijke populaties maar volledig afwezig in de onbeweeglijke die (pijl) zijn. Vergelijkingen van deze aard worden aangeduid als &quot;label-free (MS-gebaseerde)&quot;. Het peptide massa en retentietijd worden vervolgens gebruikt om de verbinding van tandem-massaspectrometrie richten en identificeren eiwit waaruit het peptide is afgeleid.

Proteomische analyse van elk celtype is sterk afhankelijk van zowel de zuiverheid als de pre-fractionering van het uitgangsmateriaal om het monster te de-complexificeren vóór vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (MS). Door gebruik te maken van back-flushingtechnieken kunnen pure spermatozoa worden verkregen van knaagdieren. Na vertering kunnen fosfopeptiden worden verrijkt met behulp van TiO2.

Fosfopeptide Analyse van knaagdieren Epididymal Spermatozoa

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het kwantificeren van veranderingen in fosfopeptiden die optreden in spermatozoa tijdens de rijping van de zaadcellen. Dit wordt bereikt door de caudale epididymis van de muis te verwijderen, een retrograde spoeling van de zaadcellen uit te voeren en de cellen op te vangen in een microcapillaire buis. Vervolgens krijgen de zaadcellen de gelegenheid om uit te zwemmen in een gebalanceerde zoutoplossing, wat de verwijdering van contaminerende eiwitten mogelijk maakt, waarna ze worden gewassen, gelyseerd en geprecipiteerd om contaminerende zouten en vetten te verwijderen.De gulaire eiwitten worden verteerd met trypsine en vervolgens verrijkt met titaandioxide om fosfopeptiden te concentreren. De resultaten tonen kwantitatieve veranderingen in de fosforyleringsstatus van eiwitten aan op basis van vloeistofchromatografie en massaspectrometrie-analyse. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de reproductieve biologie, zoals wat de fosfoproteomische veranderingen zijn terwijl sperma de EPI's passeert of tijdens de capacitatie.Hoewel deze methode inzicht heeft gegeven in de biologie van zaadcellen, kan ze ook worden toegepast op modelorganismen, ziektestudies zoals kanker, neurologische pathologieën en algemene signaaltransductiepaden. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, omdat het moeilijk is om de anatomie te bepalen van de gebieden waarin de EPI's worden gemanipuleerd. Begin met het maken van 200 milliliters Biggers, Whitten and Whitten of BWW werkoplossing voor de steel door het volgende toe te voegen aan één liter Milli Q water om een canule te maken.Gebruik polyetheenbuisjes met een binnendiameter van 0,4 millimeter en een buitendiameter van 1,1 millimeter. Houd het buisje boven een lage verhitting totdat het materiaal begint te smelten. Trek direct daarna de uiteinden van het buisje naar buiten om het uit te rekken, waardoor de buitendiameter afneemt.Snijd de slang zodanig dat één uiteinde versmalt, zodat de canulatie van de S deens eenvoudiger verloopt. Snijd het tegenovergestelde uiteinde af tot ongeveer 15 centimeter. Steek vervolgens een naald van 30 gauge in het stompe uiteinde en bevestig hieraan een volledig ingetrokken spuit van drie milliliter.Maak een zuigmondstuk door een stuk PE-slang van 20 centimeter af te snijden en dit in één uiteinde van de canule te plaatsen. Plaats de houder voor de glazen microcapillaire buis en de glazen microcapillair. Maak na het euthanaseren van een muis volgens het tekstprotocol een kleine incisie in het scrotum om de epi bloot te leggen.Gebruik vervolgens een set horlogemakerspincetten (nummer vijf) om de testis en de epididymis uit de holte te trekken. Snijd de vas deferens zo af dat er slechts ongeveer 1 tot 2 cm overblijft vanaf de cauda epididymis.Snijd vervolgens de proximale EENT-gangen en het weefsel dat de epididymis met de testis verbindt weg en verwijder het gehele mannelijke voortplantingsstelsel onder een dissectiemicroscoop met een vergroting tussen 5x en 40x. Plaats één tot twee centimeter van het versmallede uiteinde van de canule in het gezichtsveld en gebruik tape om deze te zekeren met een horlogemakerspincet nummer vijf. Pak elke zijde van de vas deferens voorzichtig vast en trek deze over het zichtbare gedeelte van de canule.Knoop vervolgens met niet-absorbeerbare, zwarte, gevlochten, behandelde zijde een stevige knoop rond het gecannuleerde weefsel met een pincet nr. 5 (horlogemakerspincet). Pak het distale uiteinde van de kata epi ides vast en verwijder de tunica Eugenia.Om een enkele epididymale tubulus bloot te leggen, legt u de tubulus voorzichtig bloot en scheidt u deze om een opening te creëren waardoor de spermatocayten kunnen vrijkomen. Druk vervolgens voorzichtig op de zuiger van de spuit om lucht in de vas deferens te spuiten. Door de druk zullen de spermatozoa uit de beschadigde tubulus treden.Pas vervolgens zuigkracht toe op het mondstuk om de spermatozoön in de glazen capillair te trekken. Blaas voorzichtig in het mondstuk of bevestig een spuit en stoot de spermatozoön uit de glazen capillair in één milliliter pre-war B WW-oplossing. Gebruik de oplossing om de cellen drie keer te wassen om eventuele contaminerende eiwitten te verwijderen.Verwijder de laatste wasstap en vries de spermacellen in voor later gebruik, of gebruik 4% chaps, 2 M thioureum en 50 mM tris pH 7,4 om de eiwitten te solubiliseren; incubeer dit gedurende één uur met tussentijdse vortexing. Centrifugeer de oplossing vervolgens 20 minuten bij 10.000 ×g en breng het supernatant over naar een nieuwe buis om de disulfidebruggen te reduceren en de eiwitten te alkyleren door DTT tot een eindconcentratie van 10 mM aan de eiwitoplossing toe te voegen. Vortex de oplossing en incubeer deze 30 minuten bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens 50 millimolar IO-acetamide toe aan het lysaat, vortex en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Combineer om de eiwitten te precipiteren één volume lysaat, één volume methanol en 0,5 volumes chloroform. Centrifugeer het monster na het vortexen bij 10 000 Gs gedurende twee minuten en verzamel de bovenste laag, waarbij ongeveer twee millimeter wordt overgelaten om aspiratie van de interface te voorkomen.Voeg één volume methanol toe, keer de buis voorzichtig om en centrifugeer opnieuw. Verwijder het supernatant en laat het pellet drie tot vier minuten aan de lucht drogen om over te gaan tot trypsinedigestie en fosfopeptide-verrijking. Begin met het gebruik van 25 millimolair ammoniumbicarbonaat met één molair ureum.Om het trypsine te reconstitueren, combineert u F 50 in een gewichtsverhouding van één deel proteïne tot trypsine en incubeert u dit gedurende de nacht op een thermomixer bij 37 °C en 700 RPM. Na centrifugatie om het onverteerde materiaal te pelletteren, draagt u het supernatant over naar een nieuwe buis. Gebruik DHB-buffer, bereid volgens het tekstprotocol, om de getrypsiniseerde peptiden tienvoudig te verdunnen en breng dit aan op 200 µg droge titaniumdioxide-beads; incubeer dit gedurende één uur bij kamertemperatuur op een rotator. Na de incubatie wast u het monster nogmaals met DHB-buffer voordat u het monster drie keer wast met wasbuffer bestaande uit 80% ACN en 2% TFA. Na de laatste centrifugatie elueert u de fosfopeptiden door 2,5% ammoniumhydroxide toe te voegen, waarna u direct centrifugeert en het supernatant opvangt.Gebruik 0,3 µL mierenzuur om het monster te verzuren, zoals hier getoond. Een voordeel van dit protocol is dat de spermatozoa geïsoleerd worden. In een rusttoestand klonteren veel cellen samen direct na uitstoting in B WW-medium.Na 10 minuten worden ze echter modaal en wordt de oplossing homogeen. De beschreven preparatie in deze video produceert doorgaans 200 × 10⁶ zoa. Deze figuur demonstreert de zuiverheid van spermatozoa uit de epididymis van de AR-rat.Een belangrijk aandachtspunt bij de monstervoorbereiding is de opbrengst na de extracties en digestie. In tegenstelling tot TCA-precipitatie, waarbij de pH van het monster vaak moet worden aangepast, is fenol-chloroformprecipitatie snel en verzuurt het het monster niet; hier wordt de eiwitpellet getoond die gewoonlijk wordt verkregen uit 100 µg monster tussen de getoonde onderste en bovenste interface. Hier is de reproduceerbaarheid van dit protocol.De blauwe strepen die in de loop van de tijd verschijnen, zijn peptiden die elueren uit een C 18 nano kolom. Naarmate de concentratie acetonitril in de modale populatie toeneemt, is er een peptidecluster bij ongeveer 651,5 Daltons die volledig afwezig is in het niet-bereik. Het fosfaatpeptide-verrijkingsprotocol is een efficiënte techniek.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat monsterpreparatie een essentieel aspect is voor het verkrijgen van reproduceerbare resultaten voor proteomica. Deze methode kan worden aangepast om glycoproteïnen te isoleren, wat gebruikt kan worden om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke eiwitten een verandering ondergaan in het sialinezuurgehalte van hun proteoom.

phosphopeptide-analysis-of-rodent-epididymal-spermatozoa

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In this video, we demonstrate antibody-based immunoprecipitation of phosphopeptides from a peptide mixture. The enriched phosphopeptides are vacuum concentrated and stored for downstream analysis.

Phosphopeptide Enrichment: An Antibody-based Immunoprecipitation Technique to Separate Specific Phosphorylated Peptides from Complex Peptide Mixtures

Het doel van deze zaadvormende squash techniek is te snel beoordelen cytologische kenmerken van ontwikkeling van muis spermatocyten cellulaire integriteit aan te tasten. Deze methode zorgt voor de studie van alle stadia van de spermatogenese, en kan gemakkelijk worden toegepast naast andere biochemische en moleculaire biologische benaderingen voor de studie van muis meiose.

Een Seminiferous zaadvormende Squash techniek voor de cytologische analyse van de spermatogenese met behulp van het muismodel

De huidige studie beschrijft een eenvoudige methode voor het opsporen van endogene niveaus van Rab10 fosforylering door leucine-rijke herhalen kinase 2.

Rab10 fosforylering detectie door LRRK2 activiteit met behulp van SDS-pagina met een fosfaat-bindende-Tag

Dit protocol beschrijft een procedure om uitpakken en verrijken van phosphopeptides van prostaatkanker cellijnen of weefsels voor een analyse van de phosphoproteome via massa spectrometrie gebaseerde proteomics.

Verrijking van de Phosphopeptide in combinatie met kwantitatieve Label-vrije Spectrometrie van de massa te onderzoeken van de Phosphoproteome in prostaatkanker

Wij rapporteren hier, de lokalisatie van de immunofluorescentietest voor dynamin ter illustratie van de protocollen voor de detectie van eiwitten in paraffine-ingebedde muis epididymaire secties en die van een vereeuwigd epididymaire cellijn (mECap18). Ook beschrijven we de protocollen voor de isolatie van proteïnen van de secretoire van zowel epididymaire vloeistof en geconditioneerde cel media.

Analyse van epididymaire eiwitsynthese en afscheiding

We beschrijven de toepassing van een extracellulaire flux-Analyzer om real-time veranderingen in de glycolyse en oxidatieve fosforylering tijdens het gebruik van muis sperma te bewaken.

Met behulp van een extracellulaire flux Analyzer om veranderingen in glycolyse en oxidatieve fosforylering te meten tijdens het gebruik van muis sperma

Dit protocol beschrijft hoe elektrische opnames van zaadcellen van zoogdieren in een configuratie van de hele cel kunnen worden uitgevoerd, met als doel de activiteit van het ionkanaal direct vast te leggen. De methode heeft een belangrijke rol gespeeld bij het beschrijven van de elektrofysiologische profielen van verschillende sperma-ionkanalen en heeft geholpen om hun moleculaire identiteit en regulatie te onthullen.

Registratie van elektrische stromen over het plasmamembraan van zaadcellen van zoogdieren

Hier presenteren we een protocol voor de verrijking van endogene fosfoproteïnefosfatasen en hun interagerende eiwitten uit cellen en weefsels en hun identificatie en kwantificering door op massaspectrometrie gebaseerde proteomica.

Een op massaspectrometrie gebaseerde benadering om fosfoproteïnefosfatasen en hun interactoren te identificeren

Het protocol presenteert een methode voor het isoleren van hele cel eiwitlysaten van ontleedde muis embryo gezichtsprocessen of gekweekte muis embryonale palatale mesenchym cellen en het uitvoeren van daaropvolgende western blotting om gefosforyleerde eiwitniveaus te beoordelen.

Isolatie van hele celproteïnelysaten uit gezichtsprocessen van muizen en gekweekte palatale mesenchymcellen voor fosfoproteïne-analyse

Dit protocol biedt gedetailleerde beschrijvingen voor de efficiënte isolatie van extracellulaire blaasjes in de urine met behulp van gefunctionaliseerde magnetische kralen. Bovendien omvat het latere analyses, waaronder western blotting, proteomics en phosphoproteomics.

Chemische affiniteit-gebaseerde isolatie van extracellulaire blaasjes uit biovloeistoffen voor proteomics en fosfoproteomics-analyse

Hier worden twee verschillende chirurgische injectiemodellen beschreven voor het induceren van ontstekingsprikkels in het eerste segment (interstitiële injectie) en cauda epididymidis (intravasale injectie) bij muizen. Deze methoden maken studies mogelijk van de regio-specifieke reacties in de verschillende regio's van de epididymis.

Muizenmodellen van epididymitis geïnduceerd door door pathogeen geassocieerde moleculaire patronen

Leer fosfopeptide-analyse van muizenepididymale spermatozoa met retrograde spoeltechnieken en titaniumdioxide-verrijking. Deze methode kwantificeert fosforyleringsveranderingen tijdens rijping.

Fosfopeptide Analyse van knaagdieren Epididymal Spermatozoa

Meer video's verkennen