Een muismodel voor pathogenen geïnduceerde Chronische ontsteking op lokale en systemische sites

Het algemene doel van het volgende protocol is om de effecten van microbiële infectie op chronische ontsteking in vivo te onderzoeken met behulp van een fysiologisch relevant diermodel. Dit wordt bereikt door muizen oraal te infecteren met porphyromonas gingivalis om lokale en systemische chronische ontsteking te induceren. MRI kan vervolgens worden gebruikt om de progressie van systemische ontsteking bij levende dieren te meten, terwijl lokale inflammatoire botverlies wordt beoordeeld door micro CT en atherosclerotische plaques kunnen worden gevisualiseerd door op het oppervlak lipidesten na de slachting.

Uiteindelijk kunnen verschillen in alveolair botvolume en de accumulatie van atherosclerotische plaques tussen P gingivalis geïnfecteerde muizen en niet-geïnfecteerde controles worden gemeten op basis van micro CT-analyse en op het oppervlak lipidesten respectievelijk. Het grote voordeel van ons diermodel is dat het u in staat stelt zowel gastheer- als pathogene mechanismen die betrokken zijn bij chronische ontsteking te onderzoeken en specifiek op plaatsen ver van de infectie. U kunt dus zowel systemische als lokale infectieplaatsen bekijken. Met behulp van transgene muizen en gedefinieerde bacteriële mutanten.

Dit model kan helpen bij het identificeren van belangrijke aspecten van pathogenese, zoals gastheer- en microbiële factoren die bijdragen aan de ziekte. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de specifieke gastheer- en pathogeenmechanismen die betrokken zijn bij inflammatoire botverlies en atherosclerose, kan deze ook worden aangepast voor andere muismodellen van ziekten, inclusief reumatoïde artritis, diabetes en kanker. Dit is de MRI-kernfaciliteit met hoog veld voor Boston University, en mijn postdoc-collega Ning gaat aspecten van muisbeeldvorming demonstreren. Begin door bevroren stengels van perzik gingivalis 3 81 op anaërobe bloedbouillonplaten te streken en bebroed de platen in een anaërobe kamer bij 37 graden Celsius.

Gebruik na drie tot vijf dagen de op de plaat gekweekte organismen om vijf milliliter vloeibare culturen van hersenhartinfusiebouillon of BHI te inoculeren. Na overnacht groei, breng de culturen over naar 45 milliliter BHI en bebroed de culturen anaeroob gedurende nog eens 18 tot 24 uur. In de mid log-fase, oogst de bacteriën door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 7.000 GS en kamertemperatuur, en sla de pellet vervolgens grondig op in vijf milliliter PBS met een serologische pipet na het wassen van de pellet driemaal in 50 milliliter PBS. Resus, de pellet in PBS zodanig dat een verdunning van 1 tot 10 van de cultuur een optische dichtheid van 1,0 heeft bij 660 nanometer.

Voeg vervolgens genoeg medium viscositeit carboxymethylcellulose toe om een 2% gewicht-volumeoplossing te bereiken en voeg langzaam de carboxethylcellulose toe aan de bacteriële suspensie terwijl gevormd wordt om klontering te voorkomen. Om de progressie van de ontsteking in C twee te meten. Plaats eerst een dierhouder met het hoofd van de muis in een rugligging in een verticaal probe en in de verticale boring van een 11,7 TMRI-scanner.

Gebruik na de wobble- en shimmingprocessen een zeldzame sequentie om scoutbeelden langs drie orthogonale oriëntaties te verkrijgen om axiale, coronale en sagittale beelden te maken. Gebruik vervolgens lage resolutie magnetische resonantie angiografie om te bevestigen dat de verkregen beelden zich binnen het doelgebied bevinden, voer een hoge resolutie magnetische resonantie angiografie van de innominaatarterie uit met een onbelemmerde 3D-gradiëntechosequentie met behulp van de volgende parameters. Een plakdikte van 1,5 centimeter, een fliphoek van 45 graden, een herhalingstijd van 20 milliseconden, een echotijd van 2,2 milliseconden, een veld van zicht van 1,5 bij 1,5 bij 1,5 centimeter, een matrix van 1 28 bij 1 28 bij 1 28 en een aantal van de gemiddelde van vier voor een totale scantijd van ongeveer 22 minuten.

Selecteer vervolgens een axiaal beeld van de denominaatarterie 0,3 tot 0,5 millimeter onder de subclaviculabifurcatie voor ROI-analyse. Om de aorta vast te pinnen, houdt het weefsel altijd bedekt met PBS. Begin door de aorta in de anatomische positie te leggen met de bulbi van de aorta aan de linkerkant. Plaats vervolgens tijdelijk mnuchin-pinnen achtereenvolgens op de volgende vijf locaties, de top van de aorta onder de derde tak van de boog, halverwege de dalende aorta dicht bij het onderste uiteinde van de dalende aorta en boven de tak van de femorale slagader.

Gebruik vervolgens extra fijne veerschaar om de linkerkant van de aorta te snijden, beginnend bij de linkertak van de femorale slagader tot onder de laagste tak van de opgaande aorta. Nadat u elke tak hebt gesneden en vastgezet om het binnenoppervlak bloot te leggen, blijft u het weefsel vastzetten. Het hele binnenoppervlak is blootgelegd en duidelijk zichtbaar van bovenaf en vrij van visuele interferentie van de pinnen.

Om de lipiden te kleuren en de laesies te kwantificeren, begint u door de vastgezette aorta te bedekken met vers bereide Sudan vier of olierodoplossing. Was het weefsel na 50 minuten gedurende één tot vijf minuten met 70% isopropanol en spoel de aorta vervolgens voorzichtig met dubbel gedistilleerd water tot het water dat van het weefsel komt niet meer rood is. Bedek de aorta vervolgens met PBS en plaats een liniaal naast het weefsel om te helpen bij de beeldkalibratie.

Vang vervolgens beelden van het weefsel met de hoge resolutiecamera die aan een dissectiesmicroscoop is bevestigd en sla de beelden op als TIFF-bestanden. Ten slotte traceert u in de beeldanalysesoftware handmatig elk intimaal oppervlak om het oppervlak ervan te bepalen. Vervolgens berekent u het laesieoppervlak met behulp van automatische kleurendrempelstelling door voor elk beeld een drempel in te stellen om een kleurintensiteit te definiëren die de laesies onderscheidt van de normale gebieden.

Het percentage van het intimale oppervlak dat bedekt is met atherosclerotische laesies kan vervolgens worden berekend in dit representatieve experiment met P gingivalis geïnfecteerde muizen. Volumetrische analyse toonde aan dat geïnfecteerde muizen significant botverlies vertonen in vergelijking met niet-geïnfecteerde controles. Visuele inspectie van de gereconstrueerde Hemi maxilla illustreert een