De Bovine Lung in het biomedisch onderzoek: visueel geleide Bronchoscopie, intrabronchiale Enten en

Het algemene doel van het volgende experiment is het bestuderen van interacties tussen gastheer en pathogeen in een bovien model van respiratoire infectie. Dit wordt bereikt door een respiratoire infectie bij kalveren op te wekken via intrabronchiale inoculatie met het betreffende pathogeen tijdens het verloop van de ziekte. Er worden herhaaldelijk monsters van het dier genomen via bronchoalveolaire lavage.

Vervolgens worden bronchiale borstelsamples en transbronchiale longbiopten verkregen om respectievelijk epitheelcellen en alveolaire of longweefselmonsters te verkrijgen. Uiteindelijk kan een pathogeen-specifieke respiratoire aandoening worden bevestigd, bijvoorbeeld door inflammatoire veranderingen in het spoelvocht, cytologie en door immunohistochemische detectie van het pathogeen. In transbronchiale longbiopten is het belangrijkste voordeel van dit model met grote dieren vergeleken met andere bestaande diermodellen en knaagdieren dat we in ons model in staat zijn om het ziekteverloop over een lange periode in hetzelfde individu te bestuderen door middel van herhaalde bemonstering.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de interacties tussen gastheer en pathogeen in vivo, kan zij ook worden toegepast op andere systemen, zoals alternatieve pathogenen of gastheersoorten. Het in stand houden van de anesthesie en de ondersteuning bij de bemonstering zullen worden uitgevoerd door een collega, zij is een dierenarts uit ons laboratorium. Vul voor aanvang van de procedure drie spuiten met respectievelijk één, twee en vijf milliliter van het inoculum.

Nadat de anesthesie is bevestigd, wordt de tong van het dier naar buiten getrokken en de nek gestrekt. Plaats vervolgens met lichte draaibewegingen een metalen speculum in de bek van het dier. Duw het speculum onder visuele controle naar voren, waarbij een zaklamp wordt gebruikt om vast te stellen wanneer de larynx zichtbaar is.

Plaats vervolgens een Teflon-buisje in het werkkanaal van een endoscoop. Het buisje mag niet uit de punt van de endoscoop steken. Voer de endoscoop door het speculum in.

Kleine aanpassingen aan het speculum kunnen noodzakelijk zijn om de endoscoop te positioneren. Om de larynx te passeren, gebruikt u de bronchus trache, die naar de rechterzijde van de long aftakt, om te helpen bij het uitlijnen van het beeld op de monitor. Bevestig vervolgens de spuit met vijf milliliter inoculum aan het uiteinde van de Teflon-buis.

Navigeer de tube naar de vertakkingen waar het inoculum zal worden afgezet en dien de juiste hoeveelheid inoculum toe. Bevestig vervolgens de spuit met één milliliter inoculum aan de tube. Navigeer naar de bronchus traches en breng het inoculum aan in de coddle-tak.

Verwijder de endoscoop en het speculum. Bevestig vervolgens de laatste spuit aan een actuator en spuit één milliliter van het inoculum in elk neusgat. Plaats het dier terug in zijn stal in buikligging om wakker te worden.

De herstelstal moet klimatiseerbaar zijn. Aangezien het vermogen van het dier tot thermoregulatie onder algemene anesthesie is verminderd, dient men voor het verzamelen van klepmonsters op het gewenste bemonsteringstijdstip vijf spuiten, elk gevuld met 20 milliliters steriele isotonische zoutoplossing, op te warmen in een waterbad van 38 graden Celsius. Plaats vervolgens een spoelkatheter in het werkkanaal van het endoscoop en voeg het endoscoop in het metalen speculum in.

Navigeer vervolgens verder naar de hoofdbronchus van de linkerlong totdat de wigpositie is bereikt en het endoscoop niet verder naar voren kan worden geduwd. Bevestig vervolgens achter elkaar de spuiten met de warme natriumchlorideoplossing aan de lavagekatheter voor het instilleren en direct aspireren van de vloeistof.

Bewaar het bronchoalveolaire spoelvloeistof direct na terugwinning in gesiliconiseerde glazen flesen op ijs om te voorkomen dat de alveolaire macrofagen zich aan het glasoppervlak hechten. Noteer zowel de hoeveelheid ingebrachte fysiologische zoutoplossing als de hoeveelheid teruggewonnen vloeistof. Verwijder vervolgens de spoelkatheter uit het werkkanaal om epitheelcellen te verzamelen.

Navigeer vervolgens met het endoscoop naar de gewenste bemonsteringslocatie. In dit experiment is dat bijvoorbeeld de bifurcatie van de trachea. Wanneer de endoscoop op positie is, bedek een bronchiale borstel met de tube en voer deze in het werkkanaal van de endoscoop in totdat de punt van de borstel op de monitor verschijnt. Duw de borstel en de plastic tube ongeveer vijf centimeter naar voren.

Duw vervolgens aan de handgreep van het borsteltje om het uit de plastic buis te halen. Wanneer het borsteltje in positie is, wordt het naar de locatie genavigeerd die geborsteld moet worden. Duw en trek vervolgens voorzichtig het borsteltje heen en weer terwijl u de endoscoop bestuurt.

Zorg voor contact tussen de borstel en de wand van de bronchus om de epitheelcellen af te schrapen. Stop met schrapen zodom er een bloeding optreedt. Dek de borstel vervolgens af met de koker en trek deze uit het werkkanaal.

Rol de borstels, die bedekt zijn met epitheelcellen, voorzichtig over maximaal vijf objectglazen en fixeer de uitstrijkjes 10 minuten in koude methanol. Laat de objectglazen vervolgens aan de lucht drogen en bewaar ze bij -20 °C om een transbronchiale longbiopsie uit te voeren. Navigeer daarna de endoscoop naar de gewenste bemonsteringslocatie.

Bijvoorbeeld, de pars Alis van de LOAs crans zoals in dit experiment; open en sluit de biopsietang een paar keer voordat u deze in het werkkanaal invoert om de juiste werking te controleren, en schuif de tang vervolgens in de collaterale tak van de bronchus trachealis tot er een lichte weerstand optreedt. Trek nu twee tot drie centimeter terug en open de tang. Schuif de tang opnieuw ongeveer twee centimeter naar voren en sluit deze vervolgens.

Trek de biopsietang terug en verwijder deze uit het werkkanaal. Gebruik een naald om het weefsel voorzichtig van de biopsietang te verwijderen en bewaar het in een geschikt fixatiemedium om autolytische processen te voorkomen. Laat het kalf vervolgens herstellen in zijn stal en monitor het dier gedurende de volgende 24 uur opnieuw op pneumothorax, terwijl u voer en vers water aanbiedt.

Wanneer het dier volledig bij bewustzijn is, kunnen bevroren coupes van transbronchiale longbiopten immunohistochemisch worden gekleurd. Om het geïnoculeerde pathogeen te visualiseren, let op de bruine chlamydiale inclusies in de long van dit dier dat vier dagen vóór de bemonstering is geïnoculeerd met chlamydia C. Immunohistochemische kleuring van de lavagecellen maakt de visualisatie van intracellulaire pathogenen mogelijk.

Bijvoorbeeld, op deze afbeelding zijn chlamydiale inclusies te zien in alveolaire macrofagen afgenomen van een kalf. Negen dagen na intrabronchiale inoculatie met chlamydia kan CTAC worden waargenomen. Bronchoalveolaire lavagecellen kunnen worden gedifferentieerd door middel van cytologische kleuring.

Alveolaire macrofagen zijn het overheersende celtype in het lavagevloeistof. Echter, het aantal neutrofiele granulocyten neemt toe wanneer er ontstekingsprocessen aanwezig zijn. Eenmaal beheerst, kan de inoculatie in 10 tot 15 minuten worden uitgevoerd en de bemonstering binnen 20 tot 30 minuten als dit correct wordt gedaan.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u intrabronchiale inoculatie bij kalveren uitvoert, en hoe u bronchoalveolaire lavagevloeistof, bronchiale borstelsamples en transbronchiale longbiopten afneemt bij het geanestheseerde dier.