Name: Demonstratie van Proteolytische Activering van de epitheliale natrium kanaal (ENaC) door het combineren Huidige Metingen met de Opsporing van splitsingsfragmenten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Leer hoe proteolytische activering van ENaC wordt onderzocht in Xenopus laevis oocyten door stroommetingen te combineren met biotinyleerdetectie van splitsingsfragmenten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De deskundige technische assistentie van Céline Grüniger, Christina Lang, Sonja Mayer en Ralf Rinke wordt dankbaar erkend. We danken Dr. Morag K. Mansley voor het zorgvuldig lezen van het manuscript. Dit project werd ondersteund door een subsidie van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (subsidie SFB 423: Nierschade: pathogenese en regeneratieve mechanismen, aan C. Korbmacher), subsidies van het Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung (aan S. Haerteis en M. Krappitz), het ELAN-programma (aan S. Haerteis) van de Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg en de Universiteitsbibliotheek van Erlangen-Nürnberg.

1. Isolatie van Xenopus Eicellen en micro-injectie van cRNA <ol><li> Bekomen eicellen van volwassen vrouwelijke Xenopus laevis. Verdoven dieren in 0,2% MS222 en resect ovariële lobben via een kleine incisie in de buik. </li><li> Isoleer oöcyten uit het ovariële lobben door enzymatische digestie op 19 ° C gedurende 3-4 uur bij 600-700 U / ml collagenase type 2 uit Clostridium histolyticum opgelost in calciumvrije OR2 oplossing (recept in tabel 1). </li><li> Voor de selectie, plaatst de defolliculated eicellen in een petrischaal onder een binoculair microscoop in een hoge natrium bevattende oplossing (ND96: recept in tabel 1). </li><li> Selecteer stadium V-VI eicellen en plaats ze in een andere petrischaal met een Pasteur pipet. OPMERKING: Blunt Pasteur pipet door vlammende om eicel letsel te voorkomen. </li><li> Injecteren eicellen met cRNA (bv. 0,2 ng per αβγENaC subeenheid). Ontbinden cRNA in RNase-vrij water. OPMERKING: Totalevolume geïnjecteerd in elke eicel is 46 nl. </li><li> WINKEL geïnjecteerde oöcyten bij 19 ° C in een laag natriumgehalte oplossing natrium laden van de oöcyten te voorkomen (ND9: recept in tabel 1). Supplement oplossing met 100 U / ml natrium-penicilline en 100 ug / ml streptomycine sulfaat om bacteriële groei te voorkomen. Zorgvuldig omgaan met de eicellen tot het bedrag van beschadigde of dode eicellen te beperken en ze te handhaven in individuele kleine groepen in een 12-well-plaat putten gevuld met bad oplossing tijdens de twee dagen na cRNA injectie. </li></ol> 2. Uitvoeren van twee-elektrode Voltage-clamp experimenten <ol><li> Meet de eicellen twee dagen na injectie. </li><li> Vul een spuit van een zwaartekracht gevoed perfusie-systeem met ND96 oplossing en een andere spuit met ND96 oplossing die amiloride (2 pm). Mount spuiten 50 cm boven de eicel bad kamer. Opmerking: De concentratie van de remmer ENaC amiloride werd gekozen om 20 keer hoger dan de IC50 te </sub&gt; (100 nM). </li><li> Zet op een koude lichtbron 150 W halogeen en aanpassen tot 10 cm boven de eicel bad kamer waarmee een goede visualisatie met de binoculair microscoop. Draai vervolgens aan de zuig-en stel de zuigbuis aan het einde van de eicel bad kamer. Zoek zuigbuis tegenover buizen superfusie &#39;adapter invoeren van de eicel bad. OPMERKING: Zuigkracht moet voldoende zijn om continue stroom van de oplossing superfusing de eicel te ondersteunen. </li><li> Pas superfusieapparaat snelheid van elke oplossing tot 3-5 ml / min door de zwaartekracht iv stromingsregelinrichting. Sluit de superfusie buizen met een adapter om de eicel bad kamer. </li><li> Trek glazen capillairen met een micropipet trekker om tip diameter van &lt;1 micrometer te verkrijgen. Vul dan haarvaten tot ~ 1/4 met 3 M KCl. OPMERKING: Zorg ervoor dat de gechloreerde deel van de zilveren draad van de houder elektrode wordt ondergedompeld in KCl oplossing. Controleer luchtbellen in het uiteinde van de capillair. Luchtbellen afbreuk doen aan de meetbare meting door toenemende resistentie strooicapaciteit. </li><li> Plaats de capillairen in de elektrode houders van de stroom en de spanning elektrode en plaats ze in ND96 met amiloride (2 uM) oplossing met de micro-manipulatoren. </li></ol> 3. Meting van amiloride-gevoelige Whole-cell Currents <ol><li> Nul de elektrode potentiaal van de elektrode spanning (Vm) en de huidige electrode (V e) door aanpassing van de V m V e offset toetsen. OPMERKING: De weerstand moet 1-2 MQ voor de elektrode Vm en 0,5 meten -1 MQ voor de huidige injectie elektrode. </li><li> Plaats de eicel in het bad kamer in de nabijheid van de spanningsdetectie-elektrode. OPMERKING: Sluit de eicel niet bij een van deze overdracht stappen beschadigen. Met een Pasteur pipet om de eicel overbrengen. Om beschadiging van de eicel de randen van de pipet te voorkomen dient te worden ondermijnd door vlammen. </li><li> Spietsen oocyten voorzichtig met beide micro-elektroden. </li><li> Stel het bedrijf potentieel op de versterker tot -60 mV en zet de grafiek recorder. Zet de amiloride (2 uM) bevattende oplossing. OPMERKING: De huidige moet ongeveer 0 ± 0.5 uA. Grotere lekstromen duiden op een lekkende impalement. Daarom dienen deze eicellen worden afgewezen. Bovendien moet de lekstroom gemeten in aanwezigheid van amiloride (2 uM) vergelijkbaar αβγ-WT expressie eicellen die gemeten αβγ-mutant ENaC expressie eicellen zijn. Dit betekent dat de mutaties geen invloed op de amiloride-gevoeligheid van het kanaal. </li><li> Start de opname. Indien nodig de versterking aanpassen. </li><li> Na de gemeten stroom een ​​stabiel plateau bereikt, veranderen in-amiloride oplossing. OPMERKING: Neerwaartse stroom doorbuiging van de huidige sporen corresponderen naar binnen stromen, namelijk beweging van positieve lading (Na +) van de extracellulaire kant in de cel. </li><li> After een huidige plateau is bereikt (na ~ 60 sec), schakelt de superfusie terug naar de amiloride bevattende oplossing. Nadat de stroom van de eicel de nulmeting huidige bereikt, schakelt de spanning klem en voorzichtig de elektroden trekken. </li><li> Om nieuwe sluiting van het plasmamembraan toestaan ​​op de sites van impalement, plaatst de eicel in een putje van een 96-wells plaat met 100-150 pi protease gratis ND96 oplossing. </li><li> Na 5 minuten, breng eicel een protease bevattende oplossing of een controleoplossing zonder protease gedurende 30 minuten incubatietijd. OPMERKING: De incubatietijd afhankelijk van de protease en de bestudeerde kanaal. </li><li> Na de incubatie stap herhaal de huidige meting (zie 3.2 en volgende). OPMERKING: Het is mogelijk om&gt; 90% van de eicellen te meten na incubatie in protease oplossing. </li></ol> 4. Biotinylatie Assay <ol><li> Selecteer en gooi defecte eicellen onder de binoculair microscoop. OPMERKING: Gebruik injected oöcyten uit dezelfde partij van de stroommetingen en de biotinylering experimenten. </li><li> Houd biotine bij kamertemperatuur gedurende ten minste 20 minuten voordat het bij het experiment. </li><li> Bereid de oplossingen: ND96 en ND96 die de geschikte protease. Bereid pasteurpipetten door ze te labelen en door kort vlammend hun tips om letsel van de eicellen te voorkomen. OPMERKING: Hier, het protease chymotrypsine 2 ug / ml in ND96 wordt gebruikt. Behandel elke groep met een aparte pipet om kruisbesmetting van oplossingen te vermijden. </li><li> Vul elke well van een 6-wells plaat met 2,5 ml controle ND96 of ND96 met een protease bij RT. Vervolgens stort 30 eicellen per putje en incubeer ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. OPMERKING: Voor de volgende procedures is het belangrijk om de monsters te houden op het ijs te allen tijde. Alle centrifugatie stappen op uitgevoerd bij 4 ° C. </li><li> Vul elke well van een nieuwe 6-wells plaat met 2,5 ml ND96 (elke groep heeft 3 putten voor de stappen wassen) en wegen van de biotine. OPMERKING: 2,5 mg biotine per goed (1 mg / ml) vereist. Los het biotine in de biotinylering buffer (bijvoorbeeld 25 mg biotine (10 groepen) in 25 ml biotinylering buffer (recept in tabel 1). </li><li> Breng elke groep van eicellen om een ​​goed gevuld met 2,5 ml ND96. Transfer eicellen achtereenvolgens in twee extra putten met ND96 te wassen resterende protease. Incubeer de eicellen gedurende 5 min in ND96. </li><li> Breng de eicellen in een putje met 2,5 ml biotine-oplossing en incubeer ze zacht schudden (schudder) gedurende 15 minuten. OPMERKING: Minimaliseer het overgedragen ND96 met de pipet om verdunning van de biotine-oplossing te voorkomen. </li><li> Overdracht elke groep eicellen in een putje met 2,5 ml buffer quench (recept in tabel 1) aan de biotinylering reactie te stoppen. Vervolgens breng elke groep van eicellen in een tweede put ook die 2,5 ml lessen buffer en incubeer gedurende 5 minuten onder zacht schudden. </li><li> Verwijder beschadigde of dode eicellen. OPMERKING:Kies hetzelfde aantal eicellen per groep de volgende procedure. </li><li> Breng elke groep van eicellen om een ​​1,5 ml plastic microcentrifugebuisje. OPMERKING: Minimaliseer de hoeveelheid afschrik buffer die wordt overgebracht. </li><li> Vervolgens lyseren de eicellen door ze door een 27 G naald in 1 ml lysis buffer (recept zie tabel 1), aangevuld met proteaseremmers. </li><li> Centrifugeer de lysaten gedurende 10 minuten bij 1500 x g. </li><li> Zuig supernatant en overgebracht naar een 1,5 ml microcentrifugebuis met 0,5% Triton-X-100 en 0,5% NP40. Gooi de resterende pellet. Opmerking: De bovenstaande vloeistof gebiotinyleerde plasmamembraan eiwitten en niet-gebiotinyleerde intracellulaire eiwitten. </li><li> Incubeer de microcentrifugebuizen gedurende 20 minuten op ijs. Herhaaldelijk vortex de buizen gedurende deze periode volledig de eiwitten in NP40 en Triton-X-100 lossen. </li><li> Centrifuge 100 pl agarose korrels per oöcyt groep gedurende 3 min bij 1500 x g. Nadat decentrifugeren verwijderd supernatant van de bolletjes oplossing en was driemaal met lysisbuffer om de kralen equilibreren met buffer. </li><li> Pipetteer 100 ul van de gewassen korrels in elke microcentrifugebuis met de eiwit-detergens-oplossing bereid in 4.13 om binding van de gebiotinyleerde eiwitten aan de korrels toe. </li><li> Incubeer microcentrifugebuizen met overhead rotatie O / N bij 4 ° C. </li><li> Centrifugeer de microcentrifugebuizen gedurende 3 min bij 1500 x g. Overdragen dan de supernatant naar een nieuwe buis. OPMERKING: Intracellulaire eiwitten niet gemerkt met biotine. Supernatans bij -20 ° C worden bewaard Niet aspireren de kralen. </li></ol> Detectie van ENaC splitsingsfragmenten op het celoppervlak door Western Blot analyse 5. <ol><li> Was de korrels drie maal met lysisbuffer en voeg 100 ul 2x SDS-PAGE monsterbuffer. OPMERKING: Monsters kunnen bij -20 ° C bewaard of onmiddellijk klaar voor western blot analyse. </li><li> Kook samples gedurende 5 min bij 95 ° C en daarna buizen plaats op ijs. </li><li> Centrifugeer de monsters gedurende 3 minuten bij 20.000 xg en de pipet supernatant naar een nieuwe microcentrifugebuis. OPMERKING: Dit supernatant bevat het gebiotinyleerde plasmamembraan eiwitten van het celoppervlak van de eicel. </li><li> Analyseer 30 ul van dit supernatant door western blot splitsing fragmenten onderzoeken op het celoppervlak. </li><li> Scheid de gebiotinyleerde eiwitten door SDS-PAGE (natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese) met een geschikt gel (8%, 10%, 12%, afhankelijk van het molecuulgewicht van de splitsing fragmenten onderzocht). </li><li> Breng de eiwitten polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan door halfdroge blotting. </li><li> Probe het membraan met een specifiek antilichaam tegen humaan γENaC gericht tegen een epitoop in de C-terminus (zie figuur 3 en 13). </li><li> Gebruik mierikswortel-peroxidase gemerkt geit-anti-konijn-antilichaam als secundaire antilichaam. </li><li> Detecteren chemoluminescerende signalen. </li></ol>

<ol><li>Kleyman, T. R., Carattino, M. D., Hughey, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ENaC+at+the+cutting+edge%3A+regulation+of+epithelial+sodium+channels+by+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">ENaC at the cutting edge: regulation of epithelial sodium channels by proteases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 20447-20451 (2009).</li>
<li>Rossier, B. C., Stutts, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+epithelial+sodium+channel+%28ENaC%29+by+serine+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Activation of the epithelial sodium channel (ENaC) by serine proteases.</a> Annu Rev Physiol. 71, 361-379 (2009).</li>
<li>Poirot, O., Vukicevic, M., Boesch, A., Kellenberger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+regulation+of+acid-sensing+ion+channel+1+by+serine+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Selective regulation of acid-sensing ion channel 1 by serine proteases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 38448-38457 (2004).</li>
<li>Vukicevic, M., Weder, G., Boillat, A., Boesch, A., Kellenberger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+cleaves+acid-sensing+ion+channel+1a+in+a+domain+that+is+critical+for+channel+gating%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Trypsin cleaves acid-sensing ion channel 1a in a domain that is critical for channel gating.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281, 714-722 (2006).</li>
<li>Clark, E. B., Jovov, B., Rooj, A. K., Fuller, C. M., Benos, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+cleavage+of+human+acid-sensing+ion+channel+1+by+the+serine+protease+matriptase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proteolytic cleavage of human acid-sensing ion channel 1 by the serine protease matriptase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 27130-27143 (2010).</li>
<li>Ossovskaya, V. S., Bunnett, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-activated+receptors%3A+contribution+to+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Protease-activated receptors: contribution to physiology and disease.</a> Physiological reviews. 84, 579-621 (2004).</li>
<li>Garcia-Caballero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+epithelial+sodium+channel+by+the+metalloprotease+meprin+%CE%B2-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%22%5BJournal%5D)">Activation of the epithelial sodium channel by the metalloprotease meprin β-subunit.</a> Channels (Austin. 5, 14-22 (2011).</li>
<li>Haerteis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+activation+of+the+epithelial+sodium+channel+%28ENaC%29+by+the+cysteine+protease+cathepsin-S%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Proteolytic activation of the epithelial sodium channel (ENaC) by the cysteine protease cathepsin-S.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 353-365 (2012).</li>
<li>Harris, M., Firsov, D., Vuagniaux, G., Stutts, M. J., Rossier, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+neutrophil+elastase+inhibitor+prevents+elastase+activation+and+surface+cleavage+of+the+epithelial+sodium+channel+expressed+in+Xenopus+laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A novel neutrophil elastase inhibitor prevents elastase activation and surface cleavage of the epithelial sodium channel expressed in Xenopus laevis oocytes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282, 58-64 (2007).</li>
<li>Passero, C. J., Mueller, G. M., Rondon-Berrios, H., Tofovic, S. P., Hughey, R. P., Kleyman, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmin+activates+epithelial+Na%2B+channels+by+cleaving+the+%CE%B3-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Plasmin activates epithelial Na+ channels by cleaving the γ-subunit.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 36586-36591 (2008).</li>
<li>Svenningsen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmin+in+nephrotic+urine+activates+the+epithelial+sodium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology+%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Plasmin in nephrotic urine activates the epithelial sodium channel.</a> Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 20, 299-310 (2009).</li>
<li>Patel, A. B., Chao, J., Palmer, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+kallikrein+activation+of+the+epithelial+Na+channel%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Tissue kallikrein activation of the epithelial Na channel.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 303, (2012).</li>
<li>Haerteis, S., Krappitz, M., Diakov, A., Krappitz, A., Rauh, R., Korbmacher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmin+and+chymotrypsin+have+distinct+preferences+for+channel+activating+cleavage+sites+in+the+%CE%B3-subunit+of+the+human+epithelial+sodium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Plasmin and chymotrypsin have distinct preferences for channel activating cleavage sites in the γ-subunit of the human epithelial sodium channel.</a> The Journal of General Physiology. 140, 375-389 (2012).</li>
<li>Chraibi, A., Vallet, V., Firsov, D., Hess, S. K., Horisberger, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease+modulation+of+the+activity+of+the+epithelial+sodium+channel+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Protease modulation of the activity of the epithelial sodium channel expressed in Xenopus oocytes.</a> The Journal of General Physiology. 111, 127-138 (1998).</li>
<li>Volk, T., Konstas, A. A., Bassalay, P., Ehmke, H., Korbmacher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Na%2B+removal+attenuates+rundown+of+the+epithelial+Na%2B-channel+%28ENaC%29+by+reducing+the+rate+of+channel+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular Na+ removal attenuates rundown of the epithelial Na+-channel (ENaC) by reducing the rate of channel retrieval.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 447, 884-894 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit manuscript een methodologische aanpak die met succes werd toegepast op de mechanismen die ten grondslag liggen aan de activering van ENaC door proteasen studie wordt beschreven 8,13. De gevestigde Xenopus laevis oöcyten expressie systeem werd gebruikt om functioneel uitdrukkelijke ENaC. ENaC functie werd beoordeeld met de conventionele twee-elektrode voltage-clamp techniek. Plaats-gerichte mutagenese werd gebruikt om functioneel relevante protease splitsingsplaatsen identificeren. Biotinylering experimenten uitgevoerd parallel met de elektrofysiologische metingen mogelijk correleert het uiterlijk van ENaC splitsingsproducten op het celoppervlak met proteolytische actuele activering. Een correlatie tussen het tijdsverloop van de huidige activering en de verschijning van proteolytische splitsing fragmenten aan het celoppervlak ondersteunt het concept van proteolytische activatie kanaal. Twee-elektrode voltage-clamp opnamen vereisen de impalement van een oocyte met twee micro-elektroden. Deze procedure wordt gewoonlijk slechts een keer uitgevoerd bij een individu eicel. Het was echter mogelijk om de micro-elektroden verwijderen na een eerste volledige-celstroom opname zonder zichtbare beschadiging van de eicel. Inderdaad, lijkt het plasmamembraan op de sites van impalements om opnieuw te verzegelen binnen een paar minuten. Aldus, na een eerste twee-elektrode voltage-clamp meting, is het mogelijk om de eicel overbrengen van de experimentele stroom kamer van de twee-elektroden-voltage clamp opstart een microcentrifugebuis of een putje van een plaat met 96 putjes vol een klein volume test of controleoplossing. Daarna kan dezelfde eicel overgedragen naar de stroomkamer en kan weer worden gespietst een tweede twee-elektrode voltage-clamp meting uit te voeren. Opmerkelijk was ENaC gemedieerde stromen niet veel verschillen tussen de eerste en tweede meting bij de eicel controle oplossing werd gehandhaafd. Daarentegen incubatie van de eicel in een protease bevattende solution na de eerste meting in verhoogde ENaC gemedieerde stroom in de tweede meting (figuur 2). Deze bevinding geeft aan proteolytische kanaalactivering. Performing twee stroommetingen in een eicel biedt het voordeel dat de eicel kan worden blootgesteld aan proteasen of andere farmacologische middelen tussen beide metingen van een variabele tijdsduur in een klein volume testoplossing. Dit is belangrijk bij het ​​gebruik van middelen die dure en / of niet beschikbaar in grote hoeveelheden, bijv. gezuiverde protease preparaten. De beperkte beschikbaarheid van middelen kan het onmogelijk (en onbetaalbaar) daarmee bij continue twee-elektrode voltage-clamp vanwege de grote hoeveelheden testoplossing die voor continu superfusing de eicellen met debieten van enkele milliliters per minuut. Bovendien worden continu twee-elektroden-voltage clamp metingen beperkt door de bekende fenomeenEnon van spontane kanaal vervallen ook beschreven voor ENaC 15. Daarentegen blootstellen eicellen oplossingen van twee afzonderlijke metingen testen tot een uur of meer in het algemeen niet een probleem (zie figuur 4A). Tenslotte twee opeenvolgende metingen uitgevoerd op dezelfde eicel mogelijk gepaarde waarnemingen effecten van geneesmiddelen. Dit heeft een voordeel boven ongepaarde metingen van twee groepen eicellen (protease behandelde en met hulpmiddel behandelde), omdat het probleem van de hoge variabiliteit tussen oöcyten, meestal waargenomen in ionkanaal expressie vermindert. Met gepaarde waarnemingen en de mogelijkheid om de gegevens te normaliseren om de eerste meting zijn er minder eicellen nodig per experimentele groep een significant effect van een farmacologisch middel aantonen. Normalisatie van de gegevens maakt het ook eenvoudig om gegevens van verschillende partijen van eicellen met verschillende ion kanaal expressie niveaus en dus andere basislijn stromen (Figuur 2D vatten). Uiteraard controle-experimenten nodig om deze benadering te tonen dat het ionkanaal van belang is stabiel in-vehicle behandelde controle eicellen van de eerste naar de tweede meting (zie figuur 2). Om aan te tonen dat proteolytische huidige activatie correleert met de verschijning van ENaC splitsingsproducten op het celoppervlak, een biotinylering benadering oorspronkelijk beschreven door Harris et al.. 9 worden gebruikt. Deze procedure (zoals beschreven in de paragraaf protocol en getoond in figuur 4) is aangepast om blootstelling van kanalen proteasen en daaropvolgende activatie van ENaC-gemedieerde wordt parallel met het tijdsafhankelijke verschijnen van splitsingsfragmenten tonen. De biotinylering werkwijze maakt ook de analyse van een algehele verhoging of verlaging van membraaneiwitten naar het celoppervlak. Aldus is deze methode geschikt om het effect van proteasen en andere farmaceutische onderzoekenmacological instantie bij kanaal inbrengen in het plasmamembraan of op kanaal ophalen. Bovendien western blot analyse van de gebiotinyleerde plasmamembraaneiwitten maakt detectie van eiwitfragmenten (bv. proteolytische fragmenten ENaC) of veranderingen in het glycosyleringspatroon die functioneel relevant kunnen zijn. Concluderend, de combinatie van methoden om het stimulerende effect van proteasen op ENaC gemedieerde hele cellen stromen onderzoeken en tonen een correlatie met het optreden van ENaC splitsingsproducten op het celoppervlak kan nuttig zijn voor een breed scala van toepassingen. In het bijzonder kan deze methoden geschikt zijn om soortgelijke vragen met betrekking tot de regulering van andere ionen kanalen, transporters of transmembraanreceptoren (bijv.-protease-geactiveerde receptoren PAR&#39;s) aan te pakken.

Proteasen zijn enzymen betrokken bij verschillende fysiologische reacties variërend van de bekende proteolytische afbraak van eiwitten in het kader van de spijsvertering, zeer geavanceerde protease cascades betrokken bij complexe regulerende signaalroutes. Proteasen worden onderverdeeld in zeven groepen volgens hun katalytische actieve plaats: aspartaat, asparagine, cysteïne, glutaminezuur, metallo, serine en threonine proteasen. Verschillende proteasen richten verschillende knipplaatsen die niet altijd gemakkelijk te voorspellen van de primaire structuur van een eiwit. De MEROPS databank ( <a href="http://merops.sanger.ac.uk/">http://merops.sanger.ac.uk/</a> ) geeft gedetailleerde informatie over een breed scala van proteasen en hun preferentiële klievingsplaatsen. Functioneel relevante knipplaatsen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van plaatsgerichte mutagenese. Het staat vast dat de proteolytische verwerking van ENaC is een belangrijk mechanisme van de activering van this bijzonder ionkanaal 1,2. Interessant is er bewijs dat de functie van de verwante zure sensing ionkanaal 1a (ASIC1a) ook door proteasen 3-5 kan worden gewijzigd. Momenteel blijft een open vraag of proteolytische splitsing kanaal speelt een relevante fysiologische rol in het reguleren van de activiteit van andere ionkanalen of transporteurs. Het is echter bekend dat proteolytische splitsing activeert een groep van G-proteïne gekoppelde receptoren, de protease-geactiveerde receptoren (PAR) 6. Verschillende serine proteasen (bijv. kanaal activerende proteasen (CAP1-3), chymotrypsine, trypsine, furine, plasmine, neutrofiel elastase en kallikreïne) is aangetoond dat proteolytisch activeren ENaC 2. Naast serineproteasen, kunnen andere groepen proteasen betrokken bij proteolytische ENaC activatie. Inderdaad, recente gegevens blijkt dat de metalloproteïnase meprin-β 7 en de cysteïne protease cathepsine-S 8 kan ook activate ENaC. De (patho-) fysiologisch relevante proteasen ENaC activering nog worden bepaald en kunnen van weefsel tot weefsel. Proteasen zijn bekend voorkeur splitsen op bepaalde plaatsen in de aminozuursequentie. Bijvoorbeeld, de serine protease chymotrypsine toont een specifieke splitsingsplaats patroon klieven na het aromatische aminozuur residuen fenylalanine en tyrosine. In tegenstelling, het serine protease trypsine voorkeur splitst na de basische resten lysine of arginine. Met mutante menselijke γENaC constructen gegenereerd door plaatsgerichte mutagenese kan functioneel relevant splitsingsplaatsen in ENaC heteroloog tot expressie in de eicel expressiesysteem worden geïdentificeerd 8-13. Door het injecteren van cRNA voor de drie ENaC subeenheden (αβγ) in geïsoleerde oöcyten kunnen ENaC functioneel tot expressie worden gebracht in deze cellen en de activiteit van de kanalen bij het plasmamembraan kan worden gemetenmet de twee-elektrode voltage-clamp techniek. Door het diureticum amiloride, een specifieke remmer ENaC, het amiloride-gevoelige ENaC gemedieerde gehele celstroom component (A I ami) kan worden gescheiden van onspecifieke lekstromen of stromen die door andere ionkanalen. Aldus Alf ami waarden weerspiegelen algemene ENaC activiteit kan worden bepaald door het aftrekken van hele cellen stromen gemeten in aanwezigheid van amiloride uit de overeenkomstige hele-cel stromen opgenomen in afwezigheid van amiloride. Nagaan protease heeft een stimulerend effect op ENaC wordt Alf ami tweemaal gemeten in dezelfde eicel, dus voor en na incubatie van de eicel in een protease bevattende oplossing. Een toename van A I ami van de eerste naar de tweede meting geeft ENaC proteolytische activatie. Chymotrypsine of trypsine bekend maximaal te stimuleren ENaC in de eicel expressiesysteem 2,14 en kan worden gebruikt om vertrouwerm dat proteolytische ENaC activering detecteerbaar is in een bepaalde batch van eicellen. Parallel aan hele cellen stroommetingen, een biotinylering benadering 9 werd gebruikt om te onderzoeken of de verhoging van Alf ami waargenomen bij blootstelling van de eicellen proteasen correleert met de verschijning van ENaC splitsingsfragmenten op het celoppervlak. Eiwitten aan het celoppervlak gelabeld met biotine en kan van intracellulaire eiwitten worden gescheiden door binding van het gebiotinyleerde eiwitten neutravidine-gemerkte agarose kralen. De gebiotinyleerde eiwitten kunnen worden geanalyseerd door western blot. γENaC splitsingsfragmenten op het celoppervlak kan worden gedetecteerd met een specifiek antilichaam gericht tegen een epitoop in de C-terminus van de γENaC. Functioneel relevante splitsingsplaats (en) te identificeren, voorspelde knipplaatsen kunnen worden gemuteerd met behulp van plaatsgerichte mutagenese. Wildtype en mutante kanalen worden vergeleken in parallel experimenten met oöcyten van de same batch. Met deze methodiek werd aangetoond voor de eerste keer dat proteolytische activering van ENaC gemedieerde hele cellen stromen correleert met het tijdsafhankelijke verschijnen van ENaC splitsingsfragmenten op het celoppervlak. Deze resultaten wijzen op een causaal verband tussen kanaal decollete en kanaalactivering. Bovendien Via plaatsgerichte mutagenese van potentiële splitsingsplaatsen in combinatie met de twee-elektroden-voltage clamp techniek, functioneel relevant splitsingsplaatsen voor plasmine, 13 chymotrypsine en cathepsine-S 8 werden geïdentificeerd.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bath clamp headstage for OC-725C-V</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cold light source - Schott KL 1500 LCD</td><td>Schott</td><td>#SCOC150200EU</td><td>brightness 4; mechanical aperture: D; color temperature: 3,000 K</td></tr><tr><td>E Series electrode holder (Str, Vent, Ag Wire, 1.2 mm)</td><td>ADinstruments</td><td>#ESW-F10v</td><td></td></tr><tr><td>Left micromanipulator; MM-33L</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>#64-0055</td><td></td></tr><tr><td>LIH 1600 - computer interface</td><td>HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetic valve system (ALA BPS-8) in combination with a TIB14 interface (HEKA)</td><td>ALA Scientific Instruments, HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OC-725C amplifier for two-electrode voltage-clamp recordings</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97 FLAMING/BROWN Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>heat = 550; velocity = 22; time = 200</td></tr><tr><td>Right micromanipulator; MM-33R</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>#64-0056</td><td></td></tr><tr><td>Series electrode holder (45&deg;, Vent, Handle, Ag Wire, 1.2 mm)</td><td>ADinstruments</td><td>#E45w-f10vh</td><td></td></tr><tr><td>STAT 2 IV gravity flow controller</td><td>Conmed</td><td>#P-S2V-60</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum generator ejector SEG - for suction to remove bath solution</td><td>Schmalz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>INFUJECT 60 ml pump syringes for solutions</td><td>Braun</td><td>#22050</td><td></td></tr><tr><td>Injekt-F for lysing the oocytes</td><td>Braun</td><td>#9166033V</td><td></td></tr><tr><td>Standard wall borosilicate tubing with filament</td><td>Sutter Instruments</td><td>#BF150-86-10</td><td>outside diameter: 1.5 mm; inside diameter: 0.86 mm; length: 10 cm</td></tr><tr><td>Complete, Mini, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets</td><td>Roche Applied Science</td><td>#11836170001</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>#21217</td><td></td></tr><tr><td>Horseradish peroxidase-labeled secondary goat anti-rabbit antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin Agarose</td><td>Thermo Scientific</td><td>#29200</td><td>Neutravidin-labeled agarose beads</td></tr><tr><td>NP40 (Nonidet P-40)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#I8896</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Load 1 (2x SDS-PAGE sample buffer)</td><td>Carl Roth</td><td>#K929.2</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate for detection of chemiluminescent signals</td><td>Thermo Scientific</td><td>#34095</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

demonstratie van proteolytische activering van de epitheliale natrium kanaal (enac) door het combineren huidige metingen met de opsporing van splitsingsfragmenten

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

De beschreven methoden kunnen worden gebruikt om het effect van proteasen op ionenkanalen, receptoren en andere plasmamembraaneiwitten die heteroloog worden tot expressie gebracht in Xenopus laevis eicellen, te onderzoeken. In combinatie met plaatsgerichte mutagenese biedt deze aanpak een krachtig hulpmiddel om functioneel relevante splitsingsplaatsen te identificeren. Proteolytische activering is een karakteristieke eigenschap van het amilorid-gevoelige epitheliale natriumkanaal (ENaC). De laatste activerende stap omvat de splitsing van de α-subeenheid van het kanaal in een kritische regio die mogelijk door verschillende proteasen wordt aangevallen, waaronder chymotrypsine en plasmine. Om het stimulerende effect van deze serineproteasen op ENaC te bepalen, werd de amilorid-gevoelige volledige-celstroom (Iami) twee keer gemeten in dezelfde eicel vóór en na blootstelling aan de protease, met behulp van de techniek van spanningsklem met twee elektroden. Parallel aan de elektrofysiologische experimenten werd een biotinyleringsaanpak gebruikt om de verschijning van αENaC-splitsingsfragmenten op het celoppervlak te monitoren. Met behulp van de beschreven methoden werd aangetoond dat de tijdsverloop van proteolytische activering van ENaC-gemedieerde volledige-celstromen correleert met de verschijning van een αENaC-splitsingsproduct op het celoppervlak. Deze resultaten suggereren een oorzakelijk verband tussen kanaalsplitsing en kanaalactivering. Bovendien bevestigen ze het concept dat een splitsingsgebeurtenis in αENaC vereist is als laatste stap in de proteolytische kanaalactivering. De hier beschreven methoden kunnen zeer goed toepasbaar zijn om vergelijkbare vragen te beantwoorden voor andere typen ionenkanalen of membraaneiwitten.

Om te onderzoeken of het serineprotease plasmine ENaC-gemedieerde activeren, Alf ami individuele ENaC-oöcyten tot expressie werd bepaald voor en na 30 minuten incubatie van de oöcyten in protease-free (controle) (Figuur 2A) of plasmine bevattende oplossing (figuur 2B) met de twee-elektrode voltage-clamp techniek (zie figuur 1). Blootstelling aan plasmine toegenomen Alf ami in elke eicel gemeten. Daarentegen, in controle-experimenten, 30 min incubatie van ENaC-expressie eicellen in protease-free oplossing had een verwaarloosbaar effect (figuur 2 C, D). Dus met deze methode een stimulatiekanaal van ENaC gemedieerde stroom door plasmine kunnen worden gedetecteerd. Om de effecten van het muteren vermeende splitsingsplaatsen op de activatie van ENaC gemedieerde stromen, evenals bestuderen op kanaal splitsing, het effect van chymotrypsine voor WT-ENaC werd vergeleken met die vaneen mutant ENaC met gemuteerde prostasin en plasminesplitsing sites (γ RKRK178AAAA; K189A). Het tijdsverloop van kanaal activering door chymotrypsine en het uiterlijk van ENaC splitsingsproducten op het celoppervlak werd onderzocht door verschillende protease incubatietijden (Figuur 4A). Er werd aangetoond dat mutant kanaal vertragingen en vermindert de activering van ENaC gemedieerde stroom door chymotrypsine. Dit wordt gepaard met een vertraagd optreden van een lager molecuulgewicht γENaC splitsing fragment van 67 kDa die overeenkomt met de volledig gesplitste subeenheid. Splitsing fragmenten werden gedetecteerd met een γENaC antilichaam gericht tegen een epitoop in de C-terminus (figuur 3). Deze methodische benadering demonstreert dat het tijdsverloop van proteolytische activatie van ENaC gemedieerde stromen correleert met de verschijning van een 67 kDa γENaC splitsingsproduct op het celoppervlak (fig. 4 B, C). Dit ondersteunt het idee van eenoorzakelijk verband tussen proteolytische kanaal splitsing en kanaalactivering 13. Bovendien, door het combineren stroommetingen en detectie van fragmenten γENaC op het celoppervlak werd aangetoond dat de gemuteerde knipplaatsen zijn functioneel belang voor proteolytische kanaalactivering. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig1highres.jpg" width="500" /> Figuur 1. Procedure bepalen het stimulerende effect van een protease op ENaC heteroloog tot expressie gebracht in Xenopus laevis oocyten. ENaC activiteit wordt bepaald door meting van het amiloride-gevoelige gehele celstroom component Alf ami. <img alt="Figuur 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig2highres.jpg" width="400" /> Figuur 2. Plasmine stimuleert ENaC-gemedieerde valutats in oöcyten uiten ENaC. (AD) oöcyten die menselijke ENaC werden gedurende 30 min in-protease-free oplossing (controle) of in oplossing met plasmine (10 ug / ml). Voor Alf ami bepalen voor (-) en na (+) incubatie werden de oöcyten vastgeklemd met een potentiaal van -60 mV (A, B) Vier representatieve gehele celstroom sporen afgeleverde partij eicellen.. Amiloride (ami) was aanwezig in de badoplossing specifiek remmen ENaC aangegeven door zwarte balken. (C) Gegevenspunten verkregen uit een individuele oöcyt zijn verbonden door een lijn. (D) Samenvatting van soortgelijke experimenten zie C. Kolommen vertegenwoordigen relatieve stimulerend effect op Alf ami berekend als de verhouding van Alf ami gemeten na 30 minuten incubatie (Alf ami 30 min) om de eerste Alf ami (Alf ami initiële) gemeten voor de incubatie. Getallen in de kolommen geven deaantal individuele eicellen gemeten. N geeft het aantal verschillende partijen van eicellen. (Dit cijfer is gewijzigd van [Haerteis et al. 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:. 10.1085/jgp.201110763]) <img alt="Figuur 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig3highres.jpg" width="400" /> Figuur 3. Model van de γENaC subeenheid geeft splitsingsplaatsen voor proteolytische activering en de bindingsplaats van het antilichaam gebruikt. Proteolytische splitsing door het Golgi-geassocieerde convertase furine is belangrijk voor ENaC rijping in de biosynthetische route voor het kanaal de plasmamembraan bereikt. Na splitsing door furine een 76 kDa fragment worden gedetecteerd op het celoppervlak met een biotinylering benadering en een antilichaam tegen een epitoop in de C-terminus van de γ-subeenheid. De cruciale laatste stap in proteolytische NLaC activering vindt waarschijnlijk plaats op het plasmamembraan waar γENaC wordt gesplitst door extracellulaire proteasen (bijv. plasmine en chymotrypsine) in een gebied distaal van de furineplaats resulteert in een 67 kDa fragment decollete. (Dit cijfer is gewijzigd van [Haerteis et al. 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:. 10.1085/jgp.201110763]) <img alt="Figuur 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig4highres.jpg" width="300" /> Figuur 4:. Muterende beide plasmine (K189) en prostasin splitsingsplaats (RKRK178) vertraagt ​​de activatie van ENaC gemedieerde stromen en de verschijning van een 67 kDa splitsingsproduct van γ-subeenheid van het kanaal oöcyten tot expressie WT (open symbolen) en γ RKRK178AAAA; K189A ENaC mutant kanaal (gesloten symbolen) werden gedurende 30 min in-protease-free oplossing (controle) of 5, 30 of 60 min in een oplossing die chymotrypsine (2 ug / ml). (A) Alf ami bepalen voor en na incubatie werden de oöcyten vastgeklemd met een potentiaal van -60 mV. Cirkels geven de verhouding van Alf ami gemeten na 5, 30 of 60 minuten incubatie (Alf ami min) om de eerste Alf ami (Alf ami initiële) gemeten voor de incubatie. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt het gemiddelde Alf ami gemeten 22-24 afzonderlijke eicellen vier verschillende batches. (BD) Terwijl de detectie van Alf ami expressie van gebiotinyleerde γENaC op het celoppervlak werd geanalyseerd door SDS-PAGE. γENaC werd gedetecteerd met een antilichaam tegen een epitoop in de C-terminus van humaan γENaC. Representatieve Western blots ve lading oöcyten weergegeven. (CE) Densitometrische analyse van drie western blots vergelijkbaar met die getoond in B of D. elke baan, de signals gedetecteerd in de regio van 76 kD (open kolommen) en 67 kD (grijze kolommen) werden bepaald en genormaliseerd tot de som van de totale gedetecteerde signaal. N geeft het aantal verschillende partijen van eicellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51582/51582fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding.</a>

Proteolytische activering van het epitheliale natriumkanaal (ENaC) heteroloog tot expressie gebracht in Xenopus laevis oöcyten kan worden aangetoond door het combineren stroommetingen met een biotinylering benadering om het uiterlijk van ionkanaal splitsingsproducten op het celoppervlak te onderzoeken. Functioneel belangrijke knipplaatsen kunnen worden geïdentificeerd door plaatsgerichte mutagenese.

Demonstratie van Proteolytische Activering van de epitheliale natrium kanaal (ENaC) door het combineren Huidige Metingen met de Opsporing van splitsingsfragmenten

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om het effect van proteasen op het epitheliale natriumkanaal of ENaC te onderzoeken, heteroloog tot expressie gebracht in Xenopus laevis oocyten. Dit wordt bereikt door eerst de amiloride-gevoelige hele-celstroom in een oocyt te meten. Nadat de oocyt zich heeft kunnen herstellen, wordt deze blootgesteld aan protease en wordt de stroom opnieuw gemeten.Vervolgens worden oocyten parallel biotinylering ondergaan en blootgesteld aan western blotting om het verschijnen van gamma ENaC-splitsingsfragmenten aan het celoppervlak te monitoren; de resultaten tonen een causaal verband aan tussen kanaalsplitsing en kanaalactivatie op basis van een combinatie van de two electrode voltage clamp-techniek en de biotinyleringsmethode. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals ongeplande metingen, is dat de oocyt tussen de twee metingen gedurende verschillende tijdsintervallen kan worden blootgesteld aan protease of andere farmacologische middelen in een klein volume testoplossing. Twee dagen na het isoleren van Xenopus laevis oocyten en het injecteren met cRNA volgens het testprotocol, wordt ND 96 gebruikt om één spuit van een zwaartekrachtgestuurd perfusiesysteem te vullen en ND 96 bevatten amide om een tweede spuit te vullen.Nadat de spuiten 50 centimeter boven de badkamer zijn gemonteerd, schakelt u een halogeen koude lichtbron van 150 watt in en plaatst u deze op 10 centimeter boven de eicelbadkamer om een goede visualisatie met de binoculaire microscoop mogelijk te maken. Schakel de zuiging in en plaats de zuigbuis tegenover de adapter van de superfusiebuis in de eicelbadkamer. Pas vervolgens met het IV-zwaartekrachtstroomregelapparaat de superfusiesnelheid van elke oplossing aan naar drie tot vijf milliliters per minuut. Verbind daarna met een adapter de superfusiebuizen met de eicelbadkamer met behulp van micropipet-gepolariseerde glazen capillairen om tipdiameters van minder dan één micrometer te verkrijgen.Vul deze vervolgens voor ongeveer een kwart met drie molair kaliumchloride. Plaats de capillairen in de elektrodehouders van de stroom- en spanningselektrode en positioneer deze met behulp van de micromanipulatoren in ND 96 met een twee micromolaire Amide-oplossing. Om amide-gevoelige whole-cell stromen te meten, begint u met het aanpassen van de VM-offsetknop om het elektrodepotentiaal van de spanningselektrode op nul te stellen en de VE-offsetknop om de stromelektrode op nul te stellen.Plaats een UO-site in de badkamer en in directe nabijheid van de spanningsmeetelektrode. Penetreer vervolgens de UO-site voorzichtig met beide micro-elektroden, stel het klempotentiaal van de versterker in op -60 mV en schakel de chartrecorder in. Zet daarna de amide-bevattende oplossing aan.Begin vervolgens met de opname en pas indien nodig de gain aan. Wanneer de gemeten stroom een stabiel plateau heeft bereikt, wordt overgeschakeld naar een amidevrije oplossing. Zodra er een stroomplateau is bereikt, wordt de perfusie teruggeschakeld naar de amidehoudende oplossing. Wanneer de stroom van de UO-plaats de initiële basislijnstroom heeft bereikt, wordt de voltage clamp uitgeschakeld en worden de elektroden voorzichtig teruggetrokken om het herstel van het plasmamembraan op de plekken van impalement mogelijk te maken.Plaats de Uoc-site gedurende vijf minuten in één putje van een 96-wells plaat met 100 tot 150 µL proteasevrije ND 96-oplossing voordat de UOC-site wordt overgebracht naar een proteasehoudende oplossing of naar een controleoplossing zonder protease. Herhaal gedurende 30 minuten na de incubatie de huidige meting, verwijder defecte oocyten onder de stereomicroscoop en bereid anti 96 voor met en zonder het juiste protease. Bereid past-pipetten voor door ze te labelen en de tips kort te vlammen om beschadiging van de oocyten te voorkomen.Vul elke put van een zes-puts plaat met 2,5 milliliters kamertemperatuur ND 96 of ND 96 met een protease. Voeg vervolgens 30 oocyten per put toe en incubeer deze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Nadat 2,5 milliliters ND 96 is toegevoegd aan de putten van een nieuwe zes-puts plaat, wordt elke groep oocyten overgebracht naar een put gevuld met ND 96.Verplaats de oocyten opeenvolgend naar twee aanvullende wells met ND 96 om resterende protease weg te wassen en incubeer ze in de laatste well gedurende vijf minuten; bereid biotine in biotine-elutiebuffer voor volgens het tekstprotocol. Nadat elke groep oocyten in een well met 2,5 milliliters biotine-elutiebuffer is geplaatst, worden ze 15 minuten geïncubeerd onder zachte agitatie. Nadat elke groep oocyten vervolgens in een well met 2,5 milliliters quenchbuffer is geplaatst om de biotinereactie te stoppen, worden ze overgebracht naar een tweede well met quenchbuffer en vijf minuten geïncubeerd.Breng elke groep oocyten met zachte agitatie over naar een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter en lyseer de cellen door ze met behulp van een naald van 27 gauge door 1 milliliter lysisbuffer, aangevuld met protease-remmers, te persen. Centrifugeer de lysaten 10 minuten bij 1500 ×g. Breng de supernatant over naar een nieuw buisje van 1,5 milliliter met TRITTON X 100 en MP 40, en incubeer de buisjes 20 minuten op ijs. Vortex de buisjes herhaaldelijk om de eiwitten op te lossen. Voeg na het equilibreren van 100 µL vagaro-beads per oocytgroep deze toe aan de eiwit-detergentoplossingen en incubeer de monsters overnight bij 4 °C onder overhead-rotatie.Centrifuge de monsters de volgende dag gedurende drie minuten bij 1500 ×g. Breng vervolgens het supernatant over naar een nieuwe buis om act-splitsingsfragmenten aan het celoppervlak aan te tonen. Bereid de gelmonsters voor door de beads drie keer te wassen met lysisbuffer voordat twee XSDS-PAGE monsterbuffer wordt toegevoegd. Na het centrifugeren van de monsters gedurende drie minuten bij 20.000 ×g, wordt het supernatant gepipetteerd in nieuwe microcentrifugebuisjes.Analyseer de monsters via western blot volgens het tekstprotocol om te onderzoeken of het serineprotease plasmine de ENaC-gemedieerde stromen kan activeren. De delta IE van individuele ENaC-expresserende cytes werd bepaald vóór en na een incubatie van 30 minuten van de cytes in een proteasevrije of plasminebevattende oplossing. Met gebruik van de twee-elektrode voltageclamp-techniek, zoals hier getoond, leidde blootstelling aan plasmine tot een toename van delta IE in elke gemeten cyte.In tegenstelling hiermee had incubatie in een proteasevrije oplossing een verwaarloosbaar effect. Deze figuur vergelijkt het effect van chiyotripsine op wild-type ENaC en op ENaC met gemuteerde prostasin- en plasmine-splitsingsplaatsen. Zoals hier te zien is, vertraagt en vermindert het gemuteerde kanaal de activatie van de ENaC-gemedieerde stroom door chiyotripsine.Daarnaast genereert het een splitsingsfragment met een lagere snelheid in vergelijking met het wild-type ENaC. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe een combinatie van de beschreven methoden kan worden gebruikt om het stimulerende effect van proteasen op de interne aanwezigheid te correleren met het voorkomen van splitsingsproducten aan het celoppervlak. Dit kan nuttig zijn voor een breed scala aan toepassingen, bijvoorbeeld om soortgelijke vragen te beantwoorden over de regulatie van andere ionkanalen, transporters of transmembraanreceptoren.

demonstration-proteolytic-activation-epithelial-sodium-channel-enac

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We zullen zien hoe het effect van een enkele puntmutatie op de functie van een ionkanaal studie.

Mutagenese en Functionele analyse van ionenkanalen heteroloog Uitgedrukt in zoogdiercellen

De opengesneden Vaseline gap benadering wordt gebruikt om lage ruis opnames van ionische en gating stromen van spanningsafhankelijke ionkanalen uitgedrukt in Xenopus oöcyten met een hoge resolutie van snelle kanaal kinetiek verkrijgen. Met kleine wijzigingen, kunnen spanningsklem fluorimetrie worden gekoppeld aan de opengesneden eicel protocol.

De<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicel opengesneden Vaseline Gap voltage-clamp techniek Met fluorometrie

Hier beschreven is een procedure voor het verkrijgen van lange stukken huidige opname van een ionkanaal met de cel-bijgevoegde patch-clamp techniek. Deze methode maakt het mogelijk voor het observeren, in real time, het patroon van open-close kanaal conformaties dat de biologische signaal ten grondslag liggen. Deze gegevens informeren over kanaal woningen in ongestoord biologische membranen.

Eenkanaals-Cell bevestigd Patch-clamp-opname

We beschrijven de combinatie van focale UV-geïnduceerde foto-activatie van neuro-actieve verbindingen met whole-cell patch-clamp en multi-foton beeldvorming van intracellulaire natrium transiënten in dendrieten en de stekels van de hippocampus neuronen in acute weefsel plakjes van de hersenen van muizen.

Multi-foton intracellulaire Natrium Imaging In combinatie met UV-gemedieerde Focal uncaging van glutamaat in CA1 pyramidale neuronen

Ionenkanalen tot expressie in renale tubulaire epitheel spelen een belangrijke rol in de pathologie van polycystische nierziekte. Hier beschrijven we de experimentele protocollen die worden gebruikt om patch-clamp-analyse en intracellulaire calciumgehalte metingen uit te voeren in cystic epitheel vers geïsoleerd van knaagdieren nieren.

Implementeren Patch Clamp en Live-fluorescentie microscopie om functionele eigenschappen van vers geïsoleerde PKD Epithelium Monitor

Bacteriële mechanosensitieve kanalen kunnen worden gebruikt als mechanoelectrical transducers in biomoleculaire inrichtingen. Droplet-interface dubbellagen (DIB), cel-geïnspireerde bouwstenen om dergelijke apparaten, vertegenwoordigen nieuwe platforms op te nemen en te stimuleren mechanosensitieve kanalen. Hier tonen we een nieuwe micropipet gebaseerde werkwijze voor het vormen van DIB, waardoor de studie van mechanosensitieve kanalen onder mechanische stimulatie.

Multifunctionele, Micropipet-gebaseerde methode voor opname en het stimuleren van bacteriële mechanosensitieve Ion Channels in Droplet Interface dubbellagen

Dit manuscript beschrijft de toepassingen van proton-Ionselectieve electroden en patch klemmen van methoden voor het meten van de activiteit van proton vervoerssystemen. Deze methoden zijn sommige beperkingen van technieken gebruikt bij het bestuderen van proton vervoersactiviteit, zoals matige gevoeligheid, resolutie van de tijd en onvoldoende intracellulaire milieu controle.

Toepassing van electrofysiologie meting op het bestuderen van de activiteit van Electro-neutrale Transporters

Het gecombineerde gebruik van micro-elektrode array-technologie en 4-aminopyridine-geïnduceerde chemische stimulatie voor het onderzoeken van nociceptieve activiteit op netwerkniveau in de dorsale hoorn van het ruggenmerg wordt geschetst.

Netwerkactiviteit opnemen in spinale nociceptieve circuits met behulp van micro-elektrodearrays

Dit protocol beschrijft een methode voor de studie van elektrogene membraaneiwitten door het meten van veranderingen in membraanpotentiaal. Deze test biedt een platform voor de functionele uitlezing van meerdere ionkanalen endogeen uitgedrukt in epitheelcellijnen.

Een op fluorescentie gebaseerde test van membraanpotentiaal voor functionele studie met hoge doorvoer van twee endogene ionkanalen in twee epitheelcellijnen

Hier worden methoden gepresenteerd die gedetailleerde instructies geven voor het ontleden, dissociëren, kweken en patch-clamp-opname van vestibulaire ganglion- en spiraalvormige ganglionneuronen van het binnenoor.

Isoleren en kweken van vestibulaire en spiraalvormige ganglion somata van neonatale knaagdieren voor patch-clamp opnames

Voor het bestuderen van reacties van exciteerbare cellen in vitro, beschrijft het protocol optische monitoring van veranderingen in het genereren van actiepotentiaal als gevolg van elektroporatie op een eenvoudig exciteerbaar celmodel van genetisch gemanipuleerde tet-on spiking HEK-cellen, evenals veranderingen in transmembraanspanning met geautomatiseerde extractie van relevante parameters.

Monitoring van door elektroporatie geïnduceerde veranderingen in het genereren van actiepotentieel in genetisch gemanipuleerde Tet-On Spiking HEK-cellen

Leer hoe proteolytische activering van ENaC wordt onderzocht in Xenopus laevis oocyten door stroommetingen te combineren met biotinyleerdetectie van splitsingsfragmenten.

Demonstratie van Proteolytische Activering van de epitheliale natrium kanaal (ENaC) door het combineren Huidige Metingen met de Opsporing van splitsingsfragmenten (Video) | JoVE Journal

Demonstratie van Proteolytische Activering van de epitheliale natrium kanaal (ENaC) door het combineren Huidige Metingen met de Opsporing van splitsingsfragmenten

Meer video's verkennen