Demonstratie van Proteolytische Activering van de epitheliale natrium kanaal (ENaC) door het combineren Huidige Metingen met de Opsporing van splitsingsfragmenten

Het algemene doel van het volgende experiment is om het effect van proteasen op het epitheliale natriumkanaal of ENaC te onderzoeken, heteroloog tot expressie gebracht in Xenopus laevis oocyten. Dit wordt bereikt door eerst de amiloride-gevoelige hele-celstroom in een oocyt te meten. Nadat de oocyt zich heeft kunnen herstellen, wordt deze blootgesteld aan protease en wordt de stroom opnieuw gemeten.

Vervolgens worden oocyten parallel biotinylering ondergaan en blootgesteld aan western blotting om het verschijnen van gamma ENaC-splitsingsfragmenten aan het celoppervlak te monitoren; de resultaten tonen een causaal verband aan tussen kanaalsplitsing en kanaalactivatie op basis van een combinatie van de two electrode voltage clamp-techniek en de biotinyleringsmethode. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals ongeplande metingen, is dat de oocyt tussen de twee metingen gedurende verschillende tijdsintervallen kan worden blootgesteld aan protease of andere farmacologische middelen in een klein volume testoplossing. Twee dagen na het isoleren van Xenopus laevis oocyten en het injecteren met cRNA volgens het testprotocol, wordt ND 96 gebruikt om één spuit van een zwaartekrachtgestuurd perfusiesysteem te vullen en ND 96 bevatten amide om een tweede spuit te vullen.

Nadat de spuiten 50 centimeter boven de badkamer zijn gemonteerd, schakelt u een halogeen koude lichtbron van 150 watt in en plaatst u deze op 10 centimeter boven de eicelbadkamer om een goede visualisatie met de binoculaire microscoop mogelijk te maken. Schakel de zuiging in en plaats de zuigbuis tegenover de adapter van de superfusiebuis in de eicelbadkamer. Pas vervolgens met het IV-zwaartekrachtstroomregelapparaat de superfusiesnelheid van elke oplossing aan naar drie tot vijf milliliters per minuut. Verbind daarna met een adapter de superfusiebuizen met de eicelbadkamer met behulp van micropipet-gepolariseerde glazen capillairen om tipdiameters van minder dan één micrometer te verkrijgen.

Vul deze vervolgens voor ongeveer een kwart met drie molair kaliumchloride. Plaats de capillairen in de elektrodehouders van de stroom- en spanningselektrode en positioneer deze met behulp van de micromanipulatoren in ND 96 met een twee micromolaire Amide-oplossing. Om amide-gevoelige whole-cell stromen te meten, begint u met het aanpassen van de VM-offsetknop om het elektrodepotentiaal van de spanningselektrode op nul te stellen en de VE-offsetknop om de stromelektrode op nul te stellen.

Plaats een UO-site in de badkamer en in directe nabijheid van de spanningsmeetelektrode. Penetreer vervolgens de UO-site voorzichtig met beide micro-elektroden, stel het klempotentiaal van de versterker in op -60 mV en schakel de chartrecorder in. Zet daarna de amide-bevattende oplossing aan.

Begin vervolgens met de opname en pas indien nodig de gain aan. Wanneer de gemeten stroom een stabiel plateau heeft bereikt, wordt overgeschakeld naar een amidevrije oplossing. Zodra er een stroomplateau is bereikt, wordt de perfusie teruggeschakeld naar de amidehoudende oplossing. Wanneer de stroom van de UO-plaats de initiële basislijnstroom heeft bereikt, wordt de voltage clamp uitgeschakeld en worden de elektroden voorzichtig teruggetrokken om het herstel van het plasmamembraan op de plekken van impalement mogelijk te maken.

Plaats de Uoc-site gedurende vijf minuten in één putje van een 96-wells plaat met 100 tot 150 µL proteasevrije ND 96-oplossing voordat de UOC-site wordt overgebracht naar een proteasehoudende oplossing of naar een controleoplossing zonder protease. Herhaal gedurende 30 minuten na de incubatie de huidige meting, verwijder defecte oocyten onder de stereomicroscoop en bereid anti 96 voor met en zonder het juiste protease. Bereid past-pipetten voor door ze te labelen en de tips kort te vlammen om beschadiging van de oocyten te voorkomen.

Vul elke put van een zes-puts plaat met 2,5 milliliters kamertemperatuur ND 96 of ND 96 met een protease. Voeg vervolgens 30 oocyten per put toe en incubeer deze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Nadat 2,5 milliliters ND 96 is toegevoegd aan de putten van een nieuwe zes-puts plaat, wordt elke groep oocyten overgebracht naar een put gevuld met ND 96.

Verplaats de oocyten opeenvolgend naar twee aanvullende wells met ND 96 om resterende protease weg te wassen en incubeer ze in de laatste well gedurende vijf minuten; bereid biotine in biotine-elutiebuffer voor volgens het tekstprotocol. Nadat elke groep oocyten in een well met 2,5 milliliters biotine-elutiebuffer is geplaatst, worden ze 15 minuten geïncubeerd onder zachte agitatie. Nadat elke groep oocyten vervolgens in een well met 2,5 milliliters quenchbuffer is geplaatst om de biotinereactie te stoppen, worden ze overgebracht naar een tweede well met quenchbuffer en vijf minuten geïncubeerd.

Breng elke groep oocyten met zachte agitatie over naar een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter en lyseer de cellen door ze met behulp van een naald van 27 gauge door 1 milliliter lysisbuffer, aangevuld met protease-remmers, te persen. Centrifugeer de lysaten 10 minuten bij 1500 ×g. Breng de supernatant over naar een nieuw buisje van 1,5 milliliter met TRITTON X 100 en MP 40, en incubeer de buisjes 20 minuten op ijs. Vortex de buisjes herhaaldelijk om de eiwitten op te lossen. Voeg na het equilibreren van 100 µL vagaro-beads per oocytgroep deze toe aan de eiwit-detergentoplossingen en incubeer de monsters overnight bij 4 °C onder overhead-rotatie.

Centrifuge de monsters de volgende dag gedurende drie minuten bij 1500 ×g. Breng vervolgens het supernatant over naar een nieuwe buis om act-splitsingsfragmenten aan het celoppervlak aan te tonen. Bereid de gelmonsters voor door de beads drie keer te wassen met lysisbuffer voordat twee XSDS-PAGE monsterbuffer wordt toegevoegd. Na het centrifugeren van de monsters gedurende drie minuten bij 20.000 ×g, wordt het supernatant gepipetteerd in nieuwe microcentrifugebuisjes.

Analyseer de monsters via western blot volgens het tekstprotocol om te onderzoeken of het serineprotease plasmine de ENaC-gemedieerde stromen kan activeren. De delta IE van individuele ENaC-expresserende cytes werd bepaald vóór en na een incubatie van 30 minuten van de cytes in een proteasevrije of plasminebevattende oplossing. Met gebruik van de twee-elektrode voltageclamp-techniek, zoals hier getoond, leidde blootstelling aan plasmine tot een toename van delta IE in elke gemeten cyte.

In tegenstelling hiermee had incubatie in een proteasevrije oplossing een verwaarloosbaar effect. Deze figuur vergelijkt het effect van chiyotripsine op wild-type ENaC en op ENaC met gemuteerde prostasin- en plasmine-splitsingsplaatsen. Zoals hier te zien is, vertraagt en vermindert het gemuteerde kanaal de activatie van de ENaC-gemedieerde stroom door chiyotripsine.

Daarnaast genereert het een splitsingsfragment met een lagere snelheid in vergelijking met het wild-type ENaC. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe een combinatie van de beschreven methoden kan worden gebruikt om het stimulerende effect van proteasen op de interne aanwezigheid te correleren met het voorkomen van splitsingsproducten aan het celoppervlak. Dit kan nuttig zijn voor een breed scala aan toepassingen, bijvoorbeeld om soortgelijke vragen te beantwoorden over de regulatie van andere ionkanalen, transporters of transmembraanreceptoren.