Name: Bouw en karakterisatie van een nieuw Vocal Fold Bioreactor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Leer hoe vibratiestimulatie mesenchymale stamcellen beïnvloedt in een bioreactor die fonatie nabootst met poly(ε-caprolactone) schaffolds. Deze methode onthult cellulaire reacties op eiwitniveau voor laryngologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken dr. Jeffrey Caplan voor zijn opleiding en advies op confocale beeldvorming. We danken ook de Keck Electron Microscopy Lab en Dr Chaoying Ni voor SEM hulp. Dit werk wordt gefinancierd door de National Institutes of Health (NIDCD, R01DC008965 en R01DC011377). ABZ erkent NSF Integrative Graduate Education &amp; Research Traineeship programma voor financiering (IGERT).

Bioreactor Montage 1. (Video 1) <ol><li> Maak een aluminium mal (circulaire sterven + spacer pin) met vooraf bepaalde innerlijke en uiterlijke dimensies (figuur 1). </li><li> Met behulp van de mal uit stap 1.1, fabriceren een siliconen membraan (diameter: 42 mm, dikte: 1,5 mm, figuur 1) met een stevig verankerde huls (diameter: 12 mm, dikte ~ 0.25 mm, gevormd door de spacer pin in figuur 1) in het midden met behulp van een commercieel verkrijgbare siliconen elastomeer kit. </li><li> Maak een paar acrylblokken (Figuur 2 (4, 5)) met een ronde opening (diameter: 24 mm) in het midden, graveren de top (1,8 cm dik) en bodem (0,9 cm dik) blokken met bijpassende ribbels en groeven . 10 </li><li> Sandwich de siliconen membraan tussen de gepaarde acrylblokken. Zeker de montage met vier schroeven op de hoeken met behulp van een micro koppel schroevendraaier ingesteld op een constante kracht (35 cN · m). Als resultaat werd een waterdichte, 24 mm breed en 18 mm diep trillingen kamer wordt gemaakt (figuur 2C). </li><li> Monteer een 3 &quot;extended range mini-woofer (figuur 2D, 8 Ω/20 W) onder de trillingen kamer door een andere set van schroeven op de hoeken aan de onderkant acryl blok. Op dit punt wordt een individuele vibratiemodule geassembleerd. </li><li> Repliceren zeven extra trillingen modules. Bevestig vier van hen aan een van twee vaste aluminium staven (40 cm x 10 cm x 2,5 cm) door het plaatsen van de spreker basen gelijkmatig ronde gaten (diameter 7 cm, dikte: 2 cm) gesneden in de staven. Stabiliseren elke luidspreker door het invoegen van een schroef door de zijkant van de aluminium staaf in elk rond gat. </li><li> Afzonderlijk regelen de luidsprekers door een spreker selector. Verbinding afzonderlijke luidsprekers aan de selector door het aanbrengen van draden aan de positieve en negatieve ingangen van de luidspreker lichaam dan de overeenkomstige uitgangen van de selector. De luidspreker selector laat het signaal van tHij functie generator, na het passeren van een eindversterker, om alle acht luidsprekers te bereiken in een keer (figuur 2E). </li><li> Plaats de twee kamers arrays kerkeuze en bijbehorende elektronica in een anti-vochtigheid behuizing. Huis het gehele samenstel in een commerciële celkweek incubator. </li><li> Voed de belangrijkste kabels (door middel van een medische kwaliteit PVC-buis) de eindversterker en luidspreker selector verbinding via het filter aan de achterkant van de incubator. </li></ol> 2. Steiger fabricage en karakterisering <ol><li> Los PCL pellets in chloroform bij een concentratie van 15 gew%. Laad de oplossing in een 10 ml spuit afgedekt met een 21 G stompe naald. </li><li> Vergrendelen de spuit op een programmeerbare spuit pomp aan en zet het debiet bij 1 ml / uur. </li><li> Plaats de aluminium-folie bedekt collector tegenover de naald horizontaal, met een naald-naar-verzamelaar afstand van ~ 18 cm. </li><li> Klem de positieve alligator clip naar het midden van de naald, en de grond krokodillenklem aan de aluminium collector en stel de spanning op de hoogspanningsvoeding bij 15 kV. LET OP: hoogspanning, houd afstand van de naald. </li><li> Opeenvolgend zet de spuit pomp en voeding; snel te reinigen / verwijderen van de resterende polymeer oplossing rond de punt van de naald met een droge papieren handdoek voordat stabiele vezels jets en Taylor kegel 19 worden gevormd. </li><li> De vezels ophopen op de Al collector tot een dikte van ~ 250-300 micrometer (~ 7 uur onder de huidige spinomstandigheden). Bewaar de verkregen steigers in een vacuüm exsiccator gedurende 1-2 dagen om resten oplosmiddel te verwijderen. </li><li> Beeld de steigers, sputteren met goud bekleed, met behulp van een Scanning Electron Microscope vaste vezel morfologie vertonen. 10 </li></ol> Bioreactor Montage en karakterisering 3. <ol><li> Punch een cilindrische schijf (diameter: 8 mm) met vier armen (lengte: 2mm) van de as-spun PCL mat (Figuur 2A) door eerst een 12 mm biopsie punch aan de buitendiameter van de schijf afgesneden. Maak dan gebruik van een tweede, 8 mm biopsie punch tot vier 2 mm lang inkepingen gelijkmatig verdeeld, over de ronde mes te scoren waar de armen te snijden te maken. Na het maken van de 8 mm punch, gebruik een scalpel om de randen van de armen naar buiten snijden. Plaats de steiger in de groef van de siliconen membraan via de verlengde armen (Video 1). Vlak de ingevoegde steiger door zachtjes te drukken op het oppervlak met behulp van platte pincet. </li><li> Bevestig een klein stukje van de dunne Al folie (8 mm x 2 mm, orthogonale vorm, Figuur 2B) aan de PCL schavot te laserreflectie helpen. </li><li> Bevestig de geassembleerde siliconen membraan / PCL steiger (zoals beschreven in stap 1.4) in de vibratie kamer. Voeg 1,5 ml water in de kamer om de PCL schavot hydrateren voor trillingen. </li><li> Met behulp van de functie generator, introduceren trillingen tekenALS (bijv. 200 Hz sinusgolven met een piek-piekspanning, Vpp, 0,1 V) aan de gesandwiched acryl kamer. Gebruik een voltmeter om de spanning op elke luidspreker ingang nauwkeurig te meten. Let op: de Vpp van de functie generator zal verschillen van de uiteindelijke spanning geleverd aan de luidspreker. </li><li> Monteer de single-point LDV en bevestig de sensor fiber-optische laser om een ​​pan-tilt hoofd statief. Richt de sensorkop zodat deze wijst loodrecht op het tafelblad. Sluit de LDV sensor hoofd naar de data-acquisitie module via coax-kabel vervolgens de module aan de laptop via USB. </li><li> De laserbundel loodrecht op verschillende vooraf bepaalde punten op de siliconen membraan (Figuur 2B en figuur 3). </li><li> Met behulp van de data-acquisitie software, neem dan de mid-membraan verplaatsing. Klik op &quot;Verwerving Instellingen&quot; in het menu &quot;Opties&quot;; verander dan de meting modus &quot;FFT221;. Klik vervolgens op de &quot;continue meting&quot; in de hoofdwerkbalk en klik vervolgens op de piek die zich vormt bij de gekozen frequentie (Figuur 6D) om verplaatsing te nemen. </li><li> Plot de normale mid-membraan verplaatsing (w0) als functie van de relatieve positie op het substraat. De bouw van een 3D kleurenkaart van het oppervlak trillingen profiel met behulp van Origin 8.5 data-analyse software. </li></ol> 4. Vibrerende Cell Culture <ol><li> Subcultuur humaan beenmerg afgeleide MSC&#39;s in T150 weefselkweekflessen bij een initiële seeding dichtheid van 4000-5000 cellen / cm 2 in MSC onderhoud media. </li><li> Na 7-8 dagen van celkweek (tot ~ 85% confluentie), trypsinize de cellen met een cel dissociatie reagens zoals Accutase, tellen met behulp van een hemocytometer, centrifuge (440 g gedurende 5 min), en resuspendeer de cel pellet in verse MSC onderhoud medium bij een concentratie van 4,5 x 10 6 cellen / ml. </li><li> Dompel de PCL scaffold in 70% ethanol O / N. Nadat het oplosmiddel is verdampt, bloot beide zijden van de steiger aan UV-licht (254 nm) kiemdodende gedurende 5-8 minuten. </li><li> Week de PCL steiger in een 20 ug / ml fibronectine-oplossing bij 37 ° C gedurende 1 uur. Plaats de met fibronectine gecoate steiger in de siliconen membraan. Monteer de bioreactor zoals beschreven in stap 1. </li><li> Verdeel 40 pi van de celsuspensie gelijkmatig over de beveiligde PCL schavot. Laat de cellen hechten gedurende 1-1,5 uur voor toevoegen van een extra 1,5 ml vers medium om de trilling kamer. </li><li> Cultuur het MSC-beladen PCL steiger statisch voor 3 dagen en vernieuw de media na afloop van de statische cultuur. </li><li> Opleggen geselecteerde trillingen regimes om de cellulaire constructen. Opmerking: Als voorbeeld worden cellen onderworpen aan een 1-uur-on-1-hr-off (OF) trillingen op 200 Hz met aw van 0 ~ 40 urn voor 12 uur per dag gedurende 7 dagen. Constructen onderworpen aan trillingen stimulaties zijn aangewezen als Vib monsters en die culturode statisch in identieke trillingen kamers dienen als statische controles (Stat). </li></ol> 5. Biologische Evaluaties <ol><li> Verzamel 200 pi celkweekmedium van elke kamer om de dag (dag 1, 3, 5 en 7) en bundelen de aliquots van hetzelfde monster samen (800 pi elk). </li><li> Kwantificeer de cellulaire matrix metalloproteinase-1 (MMP1) en HA met een MMP1 ELISA Development kit en een hyaluronan competitieve ELISA kit, respectievelijk volgens procedure van de fabrikant. Ondertussen assay de productie van oplosbare elastine precursor volgens de eerder beschreven ELISA-procedure. 8 </li><li> Na voltooiing van de laatste trilling cyclus op dag 7, snel te verwijderen van de cellulaire constructen van de trillingen kamers met behulp van scherpe pincet en kort spoel ze met koud fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, 4 ° C). </li><li> Voor de live / dead kleuring, incubeer de constructen met propidiumjodide (1:2000 in PBS) enSyto-13 (1:1000 in PBS) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Afbeelding de gekleurde constructies met een multifoton confocale microscoop. </li><li> Afzonderlijk, snap-vries de PBS-gespoeld mobiele constructies op droog ijs en pak de totale cellulaire RNA na een eerder gemelde protocol voor gen-analyse. 9 </li><li> Controleer de hoeveelheid en de kwaliteit van het gewonnen RNA met behulp van een UV-Vis spectrofotometer. RNA monsters met A260/A280 en A260/A230 verhoudingen van 1,8-2,2 wordt gebruikt voor daaropvolgende qPCR analyse. </li><li> Reverse transcriptie van het RNA (500 ng / monster) in cDNA met behulp van een commercieel verkrijgbare reverse transcriptie kit. </li><li> Voer de PCR reactie op een real-time sequence detectiesysteem met een algemeen verkrijgbare PCR master mix volgens de eerder beschreven procedure. 8 </li><li> Analyseer de qPCR resultaten met behulp van commerciële qPCR data-analyse software. Om de betrouwbaarheid van de gegevensanalyse waarborgen, worden meerdere referentie genen (YWHAZ, TBP, PPIA) toegepast als interne controles, en de variantie van specifieke primer efficiëntieverbeteringen in aanmerking wordt genomen. 8 </li></ol>

<ol><li>Titze, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical-Stress+in+Phonation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Mechanical-Stress in Phonation.</a> J. Voice. 8, 99-105 (1994).</li>
<li>Titze, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Relation+Between+Subglottal+Pressure+and+Fundamental-Frequency+in+Phonation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Acoust.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">On the Relation Between Subglottal Pressure and Fundamental-Frequency in Phonation.</a> J. Acoust. Soc. Am. 85, 901-906 (1989).</li>
<li>Gray, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+physiology+of+the+vocal+folds%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol.+Clin.+N.+Am%22%5BJournal%5D)">Cellular physiology of the vocal folds.</a> Otolaryngol. Clin. N. Am. 33, 679-698 (2000).</li>
<li>Thibeault, S. L., Gray, S. D., Bless, D. M., Chan, R. W., Ford, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+and+rheologic+characterization+of+vocal+fold+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Histologic and rheologic characterization of vocal fold scarring.</a> J. Voice. 16, 96-104 (2002).</li>
<li>Hansen, J. K., Thibeault, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+and+review+of+the+literature%3A+Vocal+fold+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Current understanding and review of the literature: Vocal fold scarring.</a> J. Voice. 20, 110-120 (2006).</li>
<li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284, 143-147 (1999).</li>
<li>Hanson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Mesenchymal+Stem+Cells+From+Human+Vocal+Fold+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Vocal Fold Fibroblasts.</a> Laryngoscope. 120, 546-551 (2010).</li>
<li>Tong, Z., Duncan, R. L., Jia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+the+behaviors+of+mesenchymal+stem+cells+via+the+combination+of+high-frequency+vibratory+stimulations+and+fibrous+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Modulating the behaviors of mesenchymal stem cells via the combination of high-frequency vibratory stimulations and fibrous scaffolds.</a> Tissue Eng. Part A. 19, 1862-1878 (2013).</li>
<li>Tong, Z., Sant, S., Khademhosseini, A., Jia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+Fibroblastic+Differentiation+of+Mesenchymal+Stem+Cells+Via+the+Combination+of+Fibrous+Scaffolds+and+Connective+Tissue+Growth+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Controlling the Fibroblastic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Via the Combination of Fibrous Scaffolds and Connective Tissue Growth Factor.</a> Tissue Eng. Part A. 17, 2773-2785 (2011).</li>
<li>Jones, D. L., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+place+like+home%3A+anatomy+and+function+of+the+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">No place like home: anatomy and function of the stem cell niche.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, DOI. 11-21 (1038).</li>
<li>Wang, J. H., Thampatty, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+Adult+and+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+of+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of Adult and Stem Cells.</a> Int. Rev. of Cell Mol. Biol. 271, 301-346 (2008).</li>
<li>Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+tensile+culture+promotes+fibroblastic+differentiation+of+marrow+stromal+cells+encapsulated+in+poly+%28ethylene+glycol%29-based+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly (ethylene glycol)-based hydrogels.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 3457-3466 (2010).</li>
<li>Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+mechanical+strain+regulates+the+development+of+engineered+smooth+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cyclic mechanical strain regulates the development of engineered smooth muscle tissue.</a> Nat. Biotechnol. 17, 979-983 (1999).</li>
<li>Webb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+strain+increases+fibroblast+proliferation%2C+matrix+accumulation%2C+and+elastic+modulus+of+fibroblast-seeded+polyurethane+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs.</a> J. Biomech. 39, 1136-1144 (2006).</li>
<li>Kim, Y. J., Sah, R. L. Y., Grodzinsky, A. J., Plaas, A. H. K., Sandy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Regulation+of+Cartilage+Biosynthetic+Behavior+-+Physical+Stimuli.%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Mechanical Regulation of Cartilage Biosynthetic Behavior - Physical Stimuli.</a> Arch. Biochem. Biophys. 311, 1-12 (1994).</li>
<li>Titze, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+bioreactor+for+engineering+vocal+fold+tissues+under+combined+tensile+and+vibrational+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses.</a> J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).</li>
<li>Kutty, J. K., Webb, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibration+stimulates+vocal+mucosa-like+matrix+expression+by+hydrogel-encapsulated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Vibration stimulates vocal mucosa-like matrix expression by hydrogel-encapsulated fibroblasts.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 62-72 (2010).</li>
<li>Farran, A. J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Characterization+of+a+Dynamic+Vibrational+Culture+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Design and Characterization of a Dynamic Vibrational Culture System.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2011).</li>
<li>Reneker, D. H., Yarin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+jets+and+polymer+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Electrospinning jets and polymer nanofibers.</a> Polymer. 49, 2387-2425 (2008).</li>
<li>Wang, Y., Theobald, P., Tyrer, J., Lepper, P. The application of scanning vibrometer in mapping ultrasound fields. J. Phys.: Conf. Ser. 1, 167-173 (2004).</li>
<li>Brown, W. S., Morris, R. J., Hollien, H., Howell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speaking+Fundamental-Frequency+Characteristics+as+a+Function+of+Age+and+Professional%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Speaking Fundamental-Frequency Characteristics as a Function of Age and Professional.</a> J. Voice. 5, 310-315 (1991).</li>
<li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanotransduction%3A+putting+all+the+pieces+together+again%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again.</a> Faseb J. 20, 811-827 (2006).</li>
<li>Titze, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+bioreactor+for+engineering+vocal+fold+tissues+under+combined+tensile+and+vibrational+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses.</a> J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).</li>
<li>Moore, J., Thibeault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+Into+the+Role+of+Elastin+in+Vocal+Fold+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Insights Into the Role of Elastin in Vocal Fold Health and Disease.</a> J. Voice. 26, 269-275 (2012).</li>
<li>Thibeault, S. L., Bless, D. M., Gray, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+protein+alterations+in+rabbit+vocal+fold+with+scar%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Interstitial protein alterations in rabbit vocal fold with scar.</a> J. Voice. 17, 377-383 (2003).</li>
<li>Branski, R. C., Verdolini, K., Sandulache, V., Rosen, C. A., Hebda, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vocal+fold+wound+healing%3A+A+review+for+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Vocal fold wound healing: A review for clinicians.</a> J. Voice. 20, 432-442 (2006).</li>
<li>Clark, I. A., Swingler, T. E., Sampieri, C. L., Edwards, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+B%22%5BJournal%5D)">The regulation of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> Int. J. Biochem. Cell B. 40, 1362-1378 (2008).</li>
<li>Silver, F. H., Horvath, I., Foran, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelasticity+of+the+vessel+wall%3A+The+role+of+collagen+and+elastic+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Viscoelasticity of the vessel wall: The role of collagen and elastic fibers.</a> Crit. Rev. Biomed. Eng. 29, 279-301 (2001).</li>
<li>Kutty, J. K., Webb, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Engineering+Therapies+for+the+Vocal+Fold+Lamina+Propria%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B%3A+Rev%22%5BJournal%5D)">Tissue Engineering Therapies for the Vocal Fold Lamina Propria.</a> Tissue Eng. Part B: Rev. 15, 249-262 (2009).</li>
</ol>

Geen concurrerende financiële belangen bestaan.

Succesvolle engineering van functionele stemplooi weefsels in vitro vereist de recreatie van een stemplooi-achtige micro-omgeving om het gedrag van multipotente cellen bemiddelen. Het is algemeen aanvaard dat weefsel of orgaan weerspiegelen de functies die zij moeten uitvoeren. 22 Voor stemplooien weefsels, de hoogfrequente trillingen die tijdens fonatie voorgesteld belangrijk weefsel rijping zijn. In onze studie worden PCL scaffolds gebruikt om een ​​ligament-achtige structurele ondersteuning terwij...

De menselijke stembanden, samengesteld uit een epitheellaag, de lamina propria (LP) en de vocalis spier, is een gespecialiseerde zacht weefsel dat de luchtstroom uit de longen in akoestische golven voor verantwoorde productie zet. 1 stemplooien regelmatig oscilleren tijdens normaal phonation, vertonen stammen tot 30% op fundamentele frequenties variërend 100-300 Hz. 2 Volwassen stemplooien LP is een gradiënt structuur bestaande uit een oppervlakkige (SLP), tussenproduct (ILP) en diep (DLP) laag. Verdere indeling groepen het epitheel en de SLP als het slijmvlies laag, en combineert de ILP en DLP in de vocale ligament. 3 De SLP laag bevat voornamelijk een amorfe matrix met spaarzaam verspreid collagene vezels, terwijl het ligament is verrijkt met volwassen collageen en elastine vezels om voldoende stevigheid te bieden. 4 De structuur en de mechanica van pasgeboren stemplooien aanzienlijk afwijkt van de volwassen tegenhangers. Hoewel mechanismes reguleren stemplooi ontwikkeling en rijping zijn nog niet volledig begrepen, experimenteel bewijs heeft gewezen op de bepalende rol van-vocalization afgeleide mechanische belasting. Verschillende medische aandoeningen, waaronder spraak-misbruik, infecties, irriterende stoffen en chirurgische ingrepen, kan de stemplooien beschadigen. Stemplooi aandoeningen invloed schatting 3-9% van de Amerikaanse bevolking. Huidige behandelmethoden voor de stemplooien aandoeningen zijn beperkt 5 en een op basis van stamcellen tissue engineering aanpak heeft ontpopt als een veelbelovende strategie voor het herstel van de stemplooien functie. Mesenchymale stamcellen (MSC&#39;s) zijn een geschikt alternatief voor de primaire stemplooien fibroblasten voor stemplooien tissue engineering. 6-9 Stamcel lot specificatie en daaropvolgende weefselontwikkeling worden gemedieerd door specifieke niche zij verblijven, waarvan de mechanische staat is een cruciale factor. 10 Mechanische krachten zijn essentieel regulatoren van weefsel morfogenese eennd homeostase, in het bijzonder voor weefsels die routinematig worden onderworpen aan belasting. 11 Vanuit tissue engineering perspectief is aangetoond dat blootstelling aan fysiologisch relevante mechanische stimulatie bevordert stamcel differentiatie en weefsel-specifieke matrix remodeling. 12-15 Weefselkweek bioreactoren zijn ontworpen om simuleren de gewenste fysiologische omgeving voor cel of weefselgroei in vitro. Voor stemplooien weefselengineering is het vooral van belang om de mechanische omgeving van de phonating stemplooien opnieuw. Een ideale stemplooi bioreactor moet daadwerkelijk te leveren vibrerende signalen tot cultuur cellen, waardoor facile controle over de frequentie, amplitude en de duur van de trillingen. Titze en collega&#39;s bedachten een stemplooi bioreactor (T1 bioreactor) 16 dat statisch rekken combineert met een hoge frequentie (20-200 Hz) oscillaties aan de cellulaire productie van matrix eiwitten stimuleren. UsinG Dit bioreactor, Webb en collega 17 onderzocht de effecten van 10 dagen, 100 Hz trillingen aan dermale fibroblasten gekweekt in een hyaluronzuur (HA)-gebaseerde hydrogel. Constructen blootgesteld aan trillingen vertoonde een verhoogde expressie van HA-synthase 2 (HAS2), decorine, fibromodulin en matrix metalloproteinase-1 (MMP1), ten opzichte van de statische controles. De stimulerende effecten bleken tijdsafhankelijk zijn. Meer recent, onze groep 18 verzamelde een stemplooi bioreactor (J1 bioreactor) met behulp van een eindversterker, een functie generator, een gesloten luidspreker en een omtrek verankerd siliconen membraan dat de oscillerende lucht overdraagt ​​aan de bijgevoegde cellen. Neonatale voorhuid fibroblasten gekweekt in de bioreactor J1 werden onderworpen aan 1 uur van trillingen op 60, 110 of 300 Hz, met een in-plane stam tot 0,05%. De qPCR resultaten suggereerden dat de expressie van bepaalde genen ECM matig werd veranderd in reactie op de verschillende trillingsfrequentiesen amplitudes. Deze bioreactor ontwerpen, terwijl intrigerende, hebben een aantal beperkingen. Bijvoorbeeld, de T1 systeem vereist een groot aantal aansluitingen en bars mechanische koppeling, waardoor het maximale haalbare frequenties. Bovendien kunnen cellen worden blootgesteld aan ongewenste mechanische agitatie en vocht verstoring die de interpretatie van gegevens bemoeilijken. De J1 bioreactor, daarentegen, vertoont relatief weinig energie conversie-efficiëntie en is niet gebruiksvriendelijk. Bovendien trillingen los vaak het cel-beladen constructen van de onderliggende silicone membraan. De J2 stemplooien bioreactor hier vermeld, ontworpen op basis van hetzelfde principe als J1 uitvoering is geoptimaliseerd voor consistentie en reproduceerbaarheid. De-phonation nabootsen trillingen worden aerodynamisch opgewekt in individueel ingerichte kamers trillingen waar MSC-bevolkte vezelachtige poly (ε-caprolacton) (PCL) steigers zijn effectively beveiligd. Laser Doppler vibratiemeting (LDV) kan de gebruiker de vibratie profiel van het membraan / steiger montage verifiëren. In onze demonstratie worden MSCs blootgesteld aan 200 Hz sinusvormige trillingen met 1-h-1-on-HR-uit (OF) patroon voor een totaal van 12 uur per dag gedurende 7 dagen. Cellulaire reacties op de opgelegde trillingen signalen worden systematisch onderzocht. Over het algemeen, de J2 stemplooi biedt de meest gebruiksvriendelijke functies, waardoor dynamische celkweek studies te worden uitgevoerd in een high throughput en reproduceerbare manier.

<table><tbody><tr><td>Silicone elastomer kit</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Genees de membraan bij 100 &#176;C gedurende 2 uur</td></tr><tr><td>PCL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440744-500G</td><td>Mn ~80 kDa, oplossen O/N</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>Human bone marrow-derived MSCs</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>Ontvangen met passage 2</td></tr><tr><td>MSC onderhoudsmedia</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>10% FBS in basaal media gesupplementeerd met L-glutamine, gentamicine en amfotericine</td></tr><tr><td>Accutase celdissociatiereagens</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2006-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MMP1 DuoSet ELISA kit</td><td>R&amp;D systems</td><td>DY901</td><td></td></tr><tr><td>HA ELISA kit</td><td>Echelon Biosciences</td><td>&nbsp;K-1200&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Propidium jodide&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Syto-13&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>S7575</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect reverse transcriptiekit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR master mix</td><td>Life Technologies</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>Vervangende luidspreker</td><td>DAYTON audio (via Parts Express)</td><td>DS90-8</td><td>Papieren kegel, volledig bereik (80-13.000 Hz), 85 dB</td></tr><tr><td>Ergo Micro torque schroevendraaier</td><td>Mountz</td><td># 020377</td><td>Draaimomentbereik: 20-120 cN&#183;m</td></tr><tr><td>Stereo luidspreker selector</td><td>RadioShack</td><td>40-244</td><td>Maximale vermogensaanvoer 50 W</td></tr><tr><td>Functiegenerator&nbsp;</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>33220A</td><td>Frequentiebereik 1 &micro;Hz-20 MHz</td></tr><tr><td>Versterker&nbsp;</td><td>PYLE audio</td><td>PylePro PT2400</td><td>Frequentierespons: 10 Hz-50 kHz, twee luidspreker kanalen</td></tr><tr><td>Celcultuurincubator&nbsp;</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>Steri-Cult 3307</td><td></td></tr><tr><td>Spuitpomp&nbsp;</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>Hoogspanningsvoeding</td><td>Spellman</td><td>CZE 1000R</td><td>Uitgangsspanning: 0-30 kV</td></tr><tr><td>Scanning elektronenmicroscoop&nbsp;</td><td>JEOL-USA</td><td>JSM-7400F</td><td></td></tr><tr><td>Desk gold sputter coater</td><td>Denton Vacuum</td><td>DSK00V-0013</td><td></td></tr><tr><td>Doppler laser vibrometer&nbsp;</td><td>Polytec</td><td>PDV-100</td><td>Contactloze snelheidsmeting (0-22 kHz)</td></tr><tr><td>PCR sequentie detectiesysteem&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI7300</td><td></td></tr><tr><td>Multifoton confocale microscoop</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 510Meta NLO</td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS Spectrofotometer&nbsp;</td><td>NanoDrop Products via Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>VibSoft Data Acquisition Software</td><td>Polytec</td><td></td><td>Verwervingsbandbreedte tot 40 MHz</td></tr><tr><td>Origin 8.5 data-analysesoftware&nbsp;</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qbasePlus qPCR data-analysesoftware&nbsp;</td><td>Biogazelle</td><td>V2.3</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumlegering&nbsp;</td><td>McMaster-Carr</td><td>Alloy 6061</td><td></td></tr><tr><td>Acrylblokjes</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonaat anti-vochtigheidskamer</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td>Impact-Resistant&nbsp;Polycarbonaat</td></tr><tr><td>schroeven&nbsp;</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektrisch kabel/draad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medisch geclassificeerde PVC-buis</td><td>US Plastic Corp.</td><td>Tygon S-50-HL</td><td>Helder, biocompatibel</td></tr><tr><td>10 ml spuit&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>21 G Botende naald</td><td>Small Parts</td><td>NE-213PL-25</td><td>1-1/2" lengte</td></tr><tr><td>Alligator clip adapters&nbsp;</td><td>RadioShack</td><td>270-354</td><td>Volledig geïsoleerd</td></tr><tr><td>8 mm Biopsie punch</td><td><a href="http://www.sklarcorp.com/ProductListUS.aspx?DepartmentID=10&amp;CategoryID=96">Sklar&nbsp;Surgical Instruments</a></td><td>96-1152</td><td>Steriele, wegwerp</td></tr><tr><td>12 mm Biopsie punch</td><td>Acuderm (via Fisher Scientific)</td><td>NC9998681</td><td></td></tr><tr><td>Weefselkweekkolven</td><td>Corning</td><td></td><td>Behandeld voor celkweek</td></tr></tbody></table>

bouw en karakterisatie van een nieuw vocal fold bioreactor

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

In vitro engineering van mechanisch actieve weefsels vereist het presenteren van fysiologisch relevante mechanische omstandigheden aan gekweekte cellen. Om de dynamische omgeving van stembanden na te bootsen, wordt een nieuwe stembandenbioreactor gebouwd en gekarakteriseerd die in staat is om trillingsstimulaties bij fundamentele fonatiefrequenties te produceren. Het apparaat bestaat uit een functiegenerator, een vermogensversterker, een luidsprekerkeuzer en parallelle vibratiekamers. Individuele vibratiekamers worden gecreëerd door een op maat gemaakte siliconenmembraan tussen een paar acrylblokken te plaatsen. De siliconenmembraan dient niet alleen als de bodem van de kamer, maar biedt ook een mechanisme om het celbevattende scaffold te bevestigen. Trillingsignalen, gegenereerd door een luidspreker gemonteerd onder de onderste acrylblok, worden aerodynamisch naar de membraan overgebracht door de oscillerende lucht. Acht identieke vibratiemodules, bevestigd aan twee stationaire metalen staven, zijn ondergebracht in een anti-vochtigheidskamer voor langdurige werking in een cellencultuurincubator. De vibratiekarakteristieken van de stembandenbioreactor worden niet-destructief geanalyseerd met behulp van een Laser Doppler Vibrometer (LDV). Het nut van het dynamische kweekapparaat wordt gedemonstreerd door cellulaire constructen te kweken in aanwezigheid van 200-Hz sinusvormige trillingen met een middenmembraanverplaatsing van 40 µm. Mesenchymale stamcellen gekweekt in de bioreactor reageren op de trillingssignalen door de synthese en afbraak van stemband-relevante, extracellulaire matrixcomponenten te veranderen. Het nieuwe bioreactorsysteem dat hier wordt gepresenteerd, biedt een uitstekend in vitro platform voor het bestuderen van trilling-geïnduceerde mechanotransductie en voor de engineering van functionele stembandweefsels.

De PCL steigers vervaardigd door electrospinning bevatten micron poriën en interstitiële willekeurig verknoopte vezels met een gemiddelde diameter van 4,7 urn (figuur 4A). Bij een hogere vergroting, nanoschaal groeven en poriën zijn zichtbaar op individuele vezels (Figuur 4B). Coating van de steigers met fibronectine verbetert hydrofilie en vergemakkelijkt de initiële cel adhesie / verspreiding op het PCL steiger (ongepubliceerd observatie). Sinusvormige gol...

Een nieuwe bioreactor voor vocale vouwen, die in staat is om fysiologisch relevante, trillende stimulatie te leveren aan gekweekte cellen, is geconstrueerd en gekarakteriseerd. Dit dynamische kweekapparaat, in combinatie met een vezelachtig poly(ε-caprolacton) scaffold, creëert een vocalevouwen-mimeticum dat het gedrag van mesenchymale stamcellen moduleert.

Bouw en karakterisatie van een nieuw Vocal Fold Bioreactor

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om het effect van vibrationele stimulatie op mesenchymale stamcellen te onderzoeken met behulp van een bioreactor die is ontworpen om fonatie na te bootsen. Dit wordt bereikt door het creëren van poly-epsilon-caprolacton-scaffolds om een driedimensionaal substraat te bieden voor celculturen die vergelijkbaar zijn met het stembandligament. In een tweede stap worden de scaffolds geïntegreerd in siliconen membranen, die de overdracht van de oscillatie naar de celconstructen faciliteren.Vervolgens wordt laserdoppler-vibratie gebruikt om de vibrationele kenmerken van elke membraan-scaffoldcombinatie te bepalen. Ten slotte kunnen EISA- en kwantitatieve R-T-P-C-R-analyses worden uitgevoerd om de cellulaire reacties op proteïne- en translationeel niveau te beoordelen. Deze methode kan kernvragen in het veld van de laryngologie beantwoorden, zoals de wijze waarop de stemband rijpt en de gevolgen van stemmisbruik.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de behandeling van stembandaandoeningen vanwege de mate van cellulaire controle die nu mogelijk is met deze methode om het steigerwerk te vervaardigen; anomiseer eerst PCL-pellets

construction-and-characterization-of-a-novel-vocal-fold-bioreactor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

De methodologie voor het vervaardigen van synthetische stemplooi modellen is beschreven. De modellen zijn levensgroot en na te bootsen van de multi-layer structuur van de menselijke stemplooien. De resultaten tonen de modellen om zelf oscilleren bij een druk die vergelijkbaar zijn met long-druk-en flow-geïnduceerde vibrerende antwoorden die vergelijkbaar zijn met die van de menselijke stemplooien aan te tonen.

Synthetische, Multi-Layer, Self-Oscillerende Vocal Fold Model Fabrication

Een roterende celcultuur die het mogelijk maakt epitheliale cellen om te groeien onder fysiologische omstandigheden resulteert in 3-D cellulaire totale formatie wordt beschreven. De aggregaten gegenereerde...

Kweken en Toepassingen van Rotating muur Schip Bioreactor Afgeleid 3D epitheelcellen modellen

Vocal fold poliepen kunnen de vocale plooidynamiek verstoren en kunnen dus verwoestende gevolgen hebben voor het vermogen van een patiënt om te communiceren. Driedimensionale stromingsscheiding veroorzaakt door een aan de muur gemonteerde modelpoliep en de impact ervan op de belasting van de wanddruk worden onderzocht met behulp van deeltjesbeeld velocimetry, visualisatie van de huidwrijvingslijn en wanddrukmetingen.

Onderzoek naar de driedimensionale stroomscheiding geïnduceerd door een model vocal fold poliep

De functionele gedrag van cellen in kweek kan worden verbeterd door het kweken meer in vivo-achtige 3-dimensionale kweek omgevingen 16-21. Dit manuscript beschrijft de opzet en exploitatie van een holle vezel bioreactor systeem voor in vivo-achtige zoogdieren weefselkweek.

Holle vezel voor Bioreactoren<em&gt; In Vivo</em&gt; -achtige Mammalian Tissue Culture

Het doel van dit protocol is om een dynamische co-cultuur van menselijke macrofagen en myofibroblasten in buisvormige elektrospunsteigers uit te voeren om materiaalgestuurde weefselregeneratie te onderzoeken, met behulp van een bioreactor die het ontkoppelen van schuifspanning en cyclische rek mogelijk maakt.

Een multi-cue bioreactor om de inflammatoire en regeneratieve capaciteit van biomaterialen onder flow en stretch te evalueren

Het protocol beschrijft een beeldvormingsgerichte bioreactor die de selectieve verwijdering van het endogene epitheel uit de rattenluchtpijp en homogene verdeling van exogene cellen op het lumenoppervlak mogelijk maakt, gevolgd door langdurige in vitro kweek van het celweefselconstruct.

Imaging-guided bioreactor voor het genereren van bio-technisch luchtwegweefsel

Deze studie demonstreert de productie van niet-kleverige en superzachte stemplooimodellen door een specifieke manier te introduceren om de stemplooilagen te creëren, een gedetailleerde beschrijving van de productieprocedure te geven en de eigenschappen van de modellen te karakteriseren.

Productieproces voor niet-klevende superzachte stemplooimodellen

We ontwierpen een nieuwe mechanische belasting bioreactor die eenassige of bi-axiale mechanische spanning voorafgaand aan de transplantatie kan toepassen op een kraakbeen biocomposite in een gewrichtskraakbeendefect.

Ontwerp van een tweeassige Mechanische belasting Bioreactor voor Tissue Engineering

Fermentoren worden gebruikt voor cultuur opbrengst en productiviteit van bioengineered cellen te verhogen. Na het screenen van meerdere microbiële en dierlijke celkweek kandidaten in schudflessen, de volgende logische stap is om biomassa de geselecteerde cultuur met de vergister te verhogen. Deze video toont de installatie en bediening van een typisch benchtop bioreactor systeem.

Exploitatie van een tafelmodel Bioreactor

Decellularisatie van hele organen produceert natuurlijke biologische scaffolds die kunnen worden gebruikt voor regeneratieve geneeskunde. Er wordt een beschrijving gepresenteerd van een niet-menselijke primaatmodel van longregeneratie waarbij hele longen worden gedecellulariseerd en vervolgens worden gezaaid met volwassen stamcellen en endotheelcellen in een bioreactor die vasculaire circulatie en vloeibare media-ventilatie vergemakkelijkt.

Niet-menselijke primaat longdecellurisatie en recellerisatie met behulp van een gespecialiseerde bioreactor voor grote organen

Leer hoe vibratiestimulatie mesenchymale stamcellen beïnvloedt in een bioreactor die fonatie nabootst met poly(ε-caprolactone) schaffolds. Deze methode onthult cellulaire reacties op eiwitniveau voor laryngologie.

Bouw en karakterisatie van een nieuw Vocal Fold Bioreactor

Meer video's verkennen