Name: Voedingsvrije Afleiding van neurale stamcellen uit humane pluripotente stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Leer een voedingsvrije methode voor het afleiden van neurale stamcellen uit humane pluripotente stamcellen. Dit protocol maakt reproduceerbare differentiatie mogelijk voor onderzoek naar neurale lijnziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door een beurs voor gevorderde onderzoekers van de Zwitserse National Science Foundation en door subsidies van NYSTEM (C026446, C026447) en de Tri-institutionele stamcel initiatief (Starr Foundation).

1. Voorbereiding van Cultuur Media, Coated Schotels en onderhoud van hPSCs 1.1 Media voorbereiding Opmerking: Filter alle media voor sterilisatie en opslag bij 4 ° C in het donker tot 2 weken. Reagens, bedrijfsnamen en catalogus staan ​​vermeld in de tabel Materials. <ol><li> DMEM/10% FBS: Combineer 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen / Strep en 5 ml L-glutamine. </li><li> HES-medium: Combineer 800 ml DMEM/F12, 200 ml KSR, 5 ml L-glutamine, 5 ml Pen / Strep, 10 ml MEM minimum essentiële aminozuren oplossing, 1 ml β-mercapto-ethanol. Voeg 10 ng / ml FGF-2 na verfijning het medium. LET OP: β-Mercaptoethanol is giftig, vermijd inademing, inslikken en huidcontact. </li><li> KSR-differentiatiemedium: Combineer 820 ml Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml L-glutamine, 10 ml Pen / Strep, 10 ml MEM minimum essentiële aminozuren oplossing en 1 ml β-mercapto-ethanol. </li><li> N2-differentiatiop medium: Los 12 g DMEM/F12 poeder in 980 ml ​​dH 2 O, voeg 1,55 g glucose, 2 g natriumbicarbonaat en 100 mg APO humaan transferrine. Meng 2 ml dH 2 O 25 mg humane insuline en 40 ui 1 N NaOH, voeg de opgeloste oplossing aan het medium. Voeg 100 ul putrescine dihydrochloride, 60 pi seleniet, 100 ul progesteron en breng het volume tot 1 L met dH 2 O. </li></ol> 1.2 Coating van kweekschalen <ol><li> Matrigel coating: Dooi 1 ml bevroren matrigel aliquot door pipetteren 19 ml DMEM/F12 over de hoeveelheid totdat het is opgelost. Verwijder de bosjes door het door een 40 um cel zeef en plaat 8 ml/10 cm schotel. Incubeer de gerechten voor 1 uur bij kamertemperatuur. Zuig het Matrigel onmiddellijk vóór het uitplaten van de cellen. Opmerking: Werk snel met matrigel omdat het kan klonteren bij temperaturen boven 4 ° C. </li><li> PO / Lam / FN coating: Voeg 10 ml 1x PBS met 15 pg / ml Poly-L Ornithin hydrobromide een 10 cm schotel. Incubeer de schotel een nacht bij 37 ° C. Was platen met 1x PBS eens en voeg 10 ml per 10 cm schotel van 1x PBS met 2 ug / ml muis Laminin-I en 2 ug / ml fibronectine. Incubeer de schotels een nacht bij 37 ° C. Voordat plating de cellen, de oplossing volledig te verwijderen en laat de platen drogen bij kamertemperatuur gedurende 15-20 minuten door op te staan ​​ze op de weefselkweek kap muur zonder het deksel op. Opmerking: De gerechten zijn volledig droog en klaar voor mobiele plating wanneer men kristalstructuren kan zien op het oppervlak (zichtbaar met het blote oog). De platen kunnen bij kamertemperatuur worden bewaard gedurende een paar uur in de droge toestand. PO / Lam / FN gerechten hebben 2 dagen van tevoren worden voorbereid. In noodgevallen kan Lam / FN worden gedurende slechts 2-4 uur. Dit kan echter het risico suboptimale differentiatie / survival resultaten. </li></ol> 1.3 Onderhoud van hPSCs Opmerking: hPSCs worden gehandhaafd op 0,1% gelatine en mitotisch geïnactiveerd muis embryonale fibroblasten (MEF) HES-medium aangevuld met 10 ng / ml FGF-2 zoals eerder beschreven 10,12. De cellen moeten worden gesplitst om de 6-8 dagen. <ol><li> Bekleed een 10 cm schaal met 8 ml 0,1% gelatine (in 1x PBS zonder calcium of magnesium) bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Ontdooi bevroren MEF snel in een 37 ° C waterbad. Voeg 1.000.000 MEF tot 10 ml DMEM/10% FBS. </li><li> Zuig de gelatine en de plaat van de cellen. Incubeer bij 37 ° C gedurende ten minste 6 uur. </li><li> Zuig het DMEM/10% FBS uit de voorbereide MEF plaat, wassen plaat met 1x PBS eens en voeg 10 ml HES-medium aangevuld met 10 uM Y-27632 dihydrochloride. Het medium laten warmen bij 37 ° C gedurende 20 minuten. Opmerking: Voor handmatige splitsing van hPSCs een laminaire stroming kap met een ingebouwde microscoop wordt gebruikt. Echter, kunnen de cellen worden gepasseerd behulp van geschikte alternatieve methoden. </li><li> Onder een laminaire stroming kap met een ingebouwde microscoop, los aparte kolonies behulp van een mobiele tillift en laat ze zweven. </li><li> Gebruik een1 ml spuit met de drijvende kolonies te zuigen en dezelve op de verse, warme MEF plaat. Breng ongeveer een kwart van de cellen om de nieuwe schotel. Incubeer bij 37 ° C. </li><li> Feed cellen dagelijks met verse HES medium. </li></ol> 2. Plating van hPSCs voor differentiatie Opmerking: hPSCs te splitsen of bedekt differentiatie bij de kolonies groot, maar nog scherpe randen met zo weinig mogelijk differentiëren cellen bij hun grenzen (zie figuur 1B). Wanneer de cellen worden gehandhaafd met handmatige passage de kolonies groot genoeg om gemakkelijk zichtbaar oog. Om het juiste gevoel voor dit tijdstip te krijgen kan men een aparte HPSC gerecht voor twee weken te handhaven zonder passage van en kijken naar de cellen te bereiken en passeren het ideale tijdstip voor passage / differentiëren hen. <ol><li> Bereid 10 cm schalen met matrigel 1 uur voor aanvang van de differentiatie. Succesvolle Matrigel coating kan wordengeverifieerd 4x vergroting. </li><li> Wanneer de hPSCs klaar te verdelen, zuig het medium en voeg 4 ml van 0,05% trypsine-EDTA op de cellen. </li><li> Schud de schotel horizontaal gedurende 2 minuten krachtig totdat men de MEF zien als enkele cellen tillen de plaat onder de microscoop. De HPSC kolonies bevestigd blijven als kolonies. </li><li> Onmiddellijk en grondig, zuig het trypsine en laat de plaat staan ​​bij kamertemperatuur gedurende 2-4 minuten. </li><li> Voeg 2 ml van HES-medium op de plaat en het gebruik van een P1000 pipet, los van de cellen. Opmerking: Als de cellen niet gemakkelijk kan worden gelicht, kan de plaat leeg worden geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende nog 2-3 min. </li><li> Breng de cellen 8 ml HES-medium aangevuld met 10 pM Y-27632 dihydrochloride. </li><li> Zuig het matrigel van een eerder bereide 10 cm schotel. Plaat de cellen bij een 1:1 of 1:2 (bijvoorbeeld: De cellen ve 10 cm schotel zijn verdeeld in twee schalen van 10 cm) op de Matrigel plaat. Incubeer bij 37 °C &#39;s nachts. Opmerking: Deze laag dient daarbij op ongeveer 100.000 cellen / cm 2. </li></ol> 3. Inductie van neurale differentiatie Opmerking: Het onderscheid kan worden gestart (dag 0) als de cellen 90-100% confluent (zie figuur 1C), meestal de volgende dag. Als de nauwkeurige confluentie nog niet is bereikt, kunnen de cellen dagelijks worden gevoed met HES-medium tot ze klaar zijn voor differentiatie. Als alternatief kan het oorspronkelijke aantal cellen uitgeplaat verhoogd. <ol><li> Op dag 0-3, voeden de cellen dagelijks met 10 ml per 10 cm schotel KSR-differentiatie medium dat 0,1 uM LDN193189 en 10 uM SB431542. </li><li> Op dag 4 en 5-feed van de cellen met 75% KSR-differentiatie medium en 25% N2-differentiatiemedium zowel met LDN193189 en SB431542. </li><li> Op dag 6 en 7-feed van de cellen met 50% KSR-differentiatie medium en 50% N2-differentiatiemedium zowel met LDN193189 en SB431.542. </li><li> Op dag 8 en 9 voeden de cellen met 25% KSR-differentiatie medium en 75% N2-differentiatiemedium zowel met LDN193189 en SB431542. </li><li> Op dag 9 en 10 te bereiden PO / Lam / FN gerechten zoals aangegeven in 1.2.2 replating van de cellen op dag 11. </li><li> Op dag 10-feed cellen met N2-differentiatie medium dat LDN193189 en SB431542. </li></ol> 4. Replating in Druppels voor NC Specificatie <ol><li> Op dag 11 verzamelbak Lam / FN uit de eerder bereide platen en laat ze drogen bij kamertemperatuur gedurende 20-30 minuten, zoals beschreven in 1.2.2. </li><li> Verwijder medium uit de differentiërende cellen, was de cellen eenmaal met 1x PBS en voeg 8 ml accutase/10 cm schotel. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C. </li><li> Gebruik van een mobiele tillift, los van de cellen en resuspendeer ze in Accutase met een pipet 5 ml. Breng de suspensie naar een 15 ml buis. </li><li> Voeg 5 ml 1x PBS en spin de cellen gedurende 5 minuten bij 114 x g. </li><li> Resuspendeer de cellen in 10 ml 1x PBS. Om een ​​enkele celsuspensie te waarborgen, te filteren door een 40 um cel zeef en tel de cellen met een hemocytometer of gelijkwaardige techniek. </li><li> Draai de cellen af ​​en resuspendeer ze in N2-differentiatie medium dat 200 uM ascorbinezuur (AA), 20 ng / ml BDNF, 100 ng / ml FGF8, 20 ng / ml SHH, 10 pM Y-27632 dihydrochloride in een concentratie van 100.000 -150.000 cellen/10 pi. </li><li> Met behulp van een repeat-pipet, plaat 10 pl druppels dicht bij elkaar, zonder ze aan te raken op de gedroogde PO / Lam / FN 15 cm schalen. Opmerking: Een 10 cm schotel van gedifferentieerde cellen leidt normaal tot ongeveer 2-3 keer 15 cm schalen of ongeveer 100 x 10 pl droplets/15 cm schotel. </li><li> Laat de druppels staan ​​bij kamertemperatuur gedurende 20-30 minuten, daarna voorzichtig (de druppeltjes niet te verstoren) 30 ml N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y en incubeer bij 37 ° C. </li><li> Op dag 12, zorgvuldig voeden de cellen met 20 ml/15 cm schotel N2/AA/BDNF/FGF8/SHH. </li><li> Van day 14-17 voeden de cellen elke tweede of derde dag met N2/AA/BDNF/FGF8. </li><li> Op dag 16 en 17 voor te bereiden PO / Lam / FN platen om NC cellen replate na FACS sortering. </li></ol> 5. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) van NC cellen Opmerking: De voorbereiding van de cellen voor FACS vereist ongeveer 2 uur. <ol><li> Op dag 18 verwijderen medium, was de cellen eenmaal met 1x PBS in de schaal en voeg 12 ml Accutase. Incubeer de cellen gedurende 20 minuten bij 37 ° C. </li><li> Gebruik van een mobiele tillift, los van de cellen van het oppervlak en laat ze zweven. Pipetteer de cellen in suspensie met een pipet 5 ml, overbrengen naar een 50 ml buis en voeg 30 ml 1x PBS. Draai de cellen gedurende 5 minuten bij 114 x g. </li><li> Met een pipet P1000, resuspendeer de cellen in 1 ml 2% FBS / HBSS (de HBSS bevat 15 mM HEPES). Voeg 19 ml 2% FBS / HBSS en filtreer de cellen door een 40 urn zeef cel een enkele celsuspensie te waarborgen. Incubeer de cellen op ijs gedurende 15 min voor antilichamen blokkeren en vervolgens tel ze met behulp van een hemocytometer. </li><li> Draai de cellen af ​​en resuspendeer ze bij een concentratie van 10 miljoen cellen / ml in 2% FBS / HBSS. </li><li> Zet opzij 1.000.000 cellen elk voor de ongekleurde, single-gekleurd (HNK-1 en alleen p75) en secundair antilichaam gekleurd alleen (APC alleen en 488 alleen) FACS controleert. </li><li> Voeg 5 ul van HNK-1 en 5 pl p75 primair antilichaam per 10 miljoen cellen in 1 ml suspensie op de juiste monsters en incubeer gedurende 20 minuten op ijs. </li><li> Was de cellen in 10 ml 1x PBS (centrifugeer 5 min bij 114 xg) en resuspendeer de cellen in 1 ml 2% FBS / HBSS. Voeg 2 pi van APC en 1 pi 488 secundair antilichaam per 10 miljoen cellen in 1 ml suspensie op de juiste monsters en incubeer gedurende 20 minuten op ijs in het donker. Opmerking: APC en 488 zijn de secundaire antilichamen hier voor de HNK-1 en p75 kleuring respectievelijk. </li><li> Was de cellen in 10 ml 1x PBS tweemaal resuspendeer 10 miljoen cellen in 500 ui2% FBS / HBSS met DAPI (bij 0,5 ng / ul) of alternatieve geschikte levende cellen vlek om dode cellen te sluiten van de FACS-analyse. </li><li> Breng de monsters naar FACS buizen eigenen. </li><li> Bereid FACS buizen met 0,5 ml 2% FBS / HBSS voor mobiele collectie. Opmerking: De cellen en de collectie buizen worden op ijs in het donker gehouden tijdens het sorteren van de tijd. </li><li> Gebruik van een mobiele sorteermachine met lasers die kan detecteren DAPI, APC en 488 sorteer DAPI-/HNK-1 + / P75 + dubbele positieve cellen. Opmerking: Bereiding tijd en behandeling van de cellen leidt tot een klein percentage celdood, DAPI dode cellen kleurt alleen toestaat en daarmee voor deze cellen uit de gesorteerde populatie worden uitgesloten. Elke alternatieve live / dead vlek werkt net zo goed voor dit doel. DAPI zelf niet cytotoxiciteit veroorzaken in de levende cellen bevolking. </li></ol> 6. Replating van gesorteerde cellen, NC onderhoud en uitbreiding Opmerking: FACS gesorteerde cellen moeten met de handleidde met speciale zorg voor een optimale overleving te verzekeren. Houd ze op ijs tot opnieuw platen hen. Niet vortex of pipet ze hard. De cellen kunnen worden gesuspendeerd in door de buis. <ol><li> Na FACS sortering, tellen de NC cellen, dan draaien ze op en resuspendeer in N2-differentiatie medium aangevuld met 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml EGF en 10 uM Y-27632 dihydrochloride in het juiste volume te replate bij 30.000 cellen / 10 ul druppels. </li><li> Goed droog eerder bereide PO / Lam / FN platen en plaat ongeveer 50-70 druppels per 10 cm schotel. Laat de gerechten staan ​​bij kamertemperatuur gedurende 20-30 minuten. </li><li> 20 ml/10 cm schotel van N2/FGF2/EGF/Y-27632 zeer zorgvuldig toe te voegen zonder de druppels. Incubeer de cellen bij 37 ° C. </li><li> Voeden de cellen om de 2-3 dagen met N2/FGF2/EGF. Opmerking: NC cellen worden uitgebreid of gepasseerd ongeveer om de 4-5 dagen of wanneer ze beginnen opstapelen binnen de druppels. </li><li> Om de passage van de NC cellen, verwijder het medium, wash de cellen eenmaal met 1x PBS en voeg 8 ml accutase/10 cm schotel. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C. </li><li> Pipetteer de cellen van de plaat met behulp van een pipet 5 ml en overbrengen naar een 15 ml buis. Voeg 6 ml 1x PBS. </li><li> Draai de cellen gedurende 5 minuten bij 114 x g. </li><li> Resuspendeer de cellen in N2-differentiatie medium aangevuld met 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml EGF en 10 uM Y-27632 dihydrochloride om 20.000 cellen/10 ul druppel hebben. </li><li> Replate de cellen in 10 pl druppels op gedroogde PO / Lam / FN platen. Laat de gerechten staan ​​bij kamertemperatuur gedurende 20-30 minuten. </li><li> Voeg 20 ml/10 cm schotel van N2/FGF2/EGF/Y-27632 zorgvuldig. Incubeer bij 37 ° C. Opmerking: NC cellen kunnen worden gehandhaafd of uitgebreid tot 2 weken als een relatief homogene populatie voorlopercellen. Langere cultuur kan ertoe leiden dat ze differentiëren in verschillende celtypes nageslacht. </li></ol>

<ol><li>Lee, G., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+technology+for+the+study+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease.</a> Nat Methods. 7, 25-27 (2010).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461, 402-406 (2009).</li>
<li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457, 277-280 (2009).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screening+using+familial+dysautonomia+induced+pluripotent+stem+cells+identifies+compounds+that+rescue+IKBKAP+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression.</a> Nat Biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).</li>
<li>Zimmer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+developmental+toxicants+and+signaling+pathways+in+a+functional+test+based+on+the+migration+of+human+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells.</a> Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).</li>
<li>Dupin, E., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+progenitors+and+stem+cells%3A+from+early+development+to+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood.</a> Dev Biol. 366, 83-95 (2012).</li>
<li>McKeown, S. J., Stamp, L., Hao, M. M., Young, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirschsprung+disease%3A+a+developmental+disorder+of+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hirschsprung disease: a developmental disorder of the enteric nervous system.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 113-129 (2013).</li>
<li>Slaugenhaupt, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+expression+of+a+splicing+mutation+in+the+IKBKAP+gene+causes+familial+dysautonomia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia.</a> Am J Hum Genet. 68, 598-605 (2001).</li>
<li>Cheung, N. K., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblastoma%3A+developmental+biology%2C+cancer+genomics+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 13, 397-411 (2013).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+directed+differentiation+of+neural+crest+stem+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).</li>
<li>Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+neural+crest+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li>
<li>Itoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+establishment+of+hemopoietic+supportive+stromal+cell+lines+from+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Reproducible establishment of hemopoietic supportive stromal cell lines from murine bone marrow.</a> Exp Hematol. 17, 145-153 (1989).</li>
<li>Barberi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+subtype+specification+of+fertilization+and+nuclear+transfer+embryonic+stem+cells+and+application+in+parkinsonian+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice.</a> Nat Biotechnol. 21, 1200-1207 (2003).</li>
<li>Elkabetz, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ES+cell-derived+neural+rosettes+reveal+a+functionally+distinct+early+neural+stem+cell+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage.</a> Genes Dev. 22, 152-165 (2008).</li>
<li>Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+neural+crest+induction%2C+melanocyte+specification%2C+and+disease-related+pigmentation+defects+in+hESCs+and+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs.</a> Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).</li>
<li>Molofsky, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi-1+dependence+distinguishes+neural+stem+cell+self-renewal+from+progenitor+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation.</a> Nature. 425, 962-967 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen conflicterende belangen te onthullen.

Voor de succesvolle differentiatie van R-NC cellen van hESC / hiPSCs de volgende overwegingen worden gemaakt. Het is cruciaal om te werken onder steriele kweek omstandigheden bewaard. In het bijzonder is het belangrijk HPSC culturen mycoplasmabesmetting testen geregeld, aangezien deze verontreiniging Succesvolle differentiatie belemmert, maar niet gemakkelijk visueel in HPSC kweken gedetecteerd. De R-NC differentiatie moeten bij 90-100% celdichtheid worden gestart; lagere celdichtheid beïnvloedt overleving van de cel en...

Menselijke embryonale stamcellen (hESC) en humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) hebben laten zien een enorm potentieel, met name voor het onderzoek en de toekomstige behandeling van menselijke ziekten waarvoor geen goede diermodellen noch primaire weefsels beschikbaar zijn. Toepassingsvoorbeelden voor de hESC / hiPSC technologie zijn de volgende: Cellen van bijzonder belang kunnen worden gegenereerd uit hESC / hiPSCs voor regeneratieve geneeskunde aan onbeperkte hoeveelheid 1. Cellen kunnen worden verkregen uit patiënten die een bepaalde ziekte en dienen om ten in vitro ziektemodellen 2,3. Dergelijke ziekte modellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor grootschalige screening van geneesmiddelen in de zoektocht naar nieuwe geneesmiddelen verbindingen 4, alsmede het testen van bestaande geneesmiddelen voor de werkzaamheid en toxiciteit 5. In vitro modellen ziekte kan leiden tot de identificatie van nieuwe ziektemechanismen. Voor alle toepassingen van hESC / iPSC technologie is het belangrijk om met specifieke, goed definiërend celtypen betrokken bij de ziekte van belang. Aldus, de beschikbaarheid van vaste en reproduceerbare in vitro differentiatie protocollen is cruciaal voor alle toepassingen van de hESC / hiPSC technologie. Protocollen zijn gewenst die minimale variabiliteit tijd kosten, inspanning, moeite en kosten en maximale reproduceerbaarheid onder hESC / hiPSC lijnen en andere onderzoekers tonen. Neurale lijst (NC) cellen ontstaan ​​tijdens gewervelde neurulatie tussen de opperhuid en de neurale epitheel. Ze prolifereren en migreren veel door het ontwikkelende embryo en aanleiding geven tot een indrukwekkende verscheidenheid nakomelingen celtypen, waaronder bot / kraakbeen, het craniofaciale skelet, sensorische zenuwen, Schwann cellen, melanocyten, gladde spiercellen, enterische neuronen, autonome neuronen, chromaffinecellen , cardiale septum cellen, tanden en bijnier / schildklier kliercellen 6. Aldus NC cellen een aantrekkelijk celtype voor het veld stamcel en belangrijk voor demodellering van een verscheidenheid van ziekten, zoals de ziekte van Hirschsprung 7, familiale Dysautonomia 8 en kanker zoals neuroblastoma 9. Bovendien bieden zij de mogelijkheid aspecten van menselijke embryonale ontwikkeling in vitro bestuderen. De momenteel beschikbare en schaal toegepast in vitro differentiatie protocol voor de afleiding van NC cellen van hESCs 10,11 is maximaal 35 dagen van differentiatie en het gaat neurale inductie stromale feeder-cellen zoals MS5 cellen en derhalve uitgevoerd onder slecht gedefinieerde omstandigheden. Hoewel het kan worden opgeschaald tot grote hoeveelheden NC te genereren, zoals vereist voor hoge-doorvoer screening van geneesmiddelen 4, dit is arbeidsintensief en kostbaar. Bovendien vereist handmatige passage van neurale rozetten, die moeilijk te reproduceren zijn en is dus onderhevig aan totale variabiliteit, met name wanneer het wordt toegepast op een grote verscheidenheid van hESC of hiPSClijnen. Hier wordt de stapsgewijze afleiding van NC cellen per 18 dagen protocol dat zonder voedercellen weergegeven. Deze methode is korter en gedefinieerd dan de momenteel gebruikte protocol. Bovendien is zeer robuust genereren NC cellen tussen verschillende hiPSC lijnen. Belangrijk is, wordt aangetoond dat de NC-cellen leverde door beide protocollen ontstaan ​​op de grens van neurale rozetten (hierna genoemd rozet-NC of R-NC). De cellen afgeleid met behulp van een van de twee protocollen kijken morfologisch identiek, drukken zij dezelfde NC markers en cluster samen in microarray analyse. NC cellen afgeleid met behulp van het nieuwe protocol (R-NC) zijn functioneel, vergelijkbaar met NC cellen afgeleid met behulp van het oude protocol (MS5-R-NC), zodanig dat ze kunnen migreren en verder differentiëren tot neuronen. Derhalve kunnen de cellen gelijktijdig worden gebruikt met de MS5-R-NC cellen. De R-NC cel protocol voor de afleiding van NC cellen van hESC / IPSC nuttig zal zijn voor alle toepassingen van de hESC / IPSC technologie waarbij het NC geslacht zijn. &lt;/ P&gt;

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Lot moet worden getest</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Penicinlin/Streptomycin</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>MEM minimum essential amino acids solution</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>toxisch</td></tr><tr><td>Recombinant human FGF basic (FGF2)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>233-FB-001MG/CF</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 powder</td><td>Invitrogen</td><td>12500-096</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>APO human transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Human insulin</td><td>Sigma</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>Putriscine dihydrochloride</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Selenite</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L Ornithin hydrobromide</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Laminin-I</td><td>R&amp;D Systems</td><td>3400-010-01</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>BD Biosciences</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5 U/ml</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7013</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>Tocris-R&amp;D Systems</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris-R&amp;D Systems</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic Acid</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>248-BD</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>R&amp;D Systems</td><td>423-F8</td><td></td></tr><tr><td>Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>464SH</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>1563-080</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant EGF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>236EG</td><td></td></tr><tr><td>gelatin (PBS without Mg/Ca)</td><td>in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibodies:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM</td><td>Sigma</td><td>C6680-100TST</td><td>lot moet worden getest</td></tr><tr><td>Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor)</td><td>Advanced Targeting Systems</td><td>AB-N07</td><td>lot moet worden getest</td></tr><tr><td>APC rat anti-mIgM</td><td>BD Parmingen</td><td>550676</td><td>lot moet worden getest</td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1</td><td>Invitrogen</td><td>A21121</td><td>lot moet worden getest</td></tr><tr><td>Anti Oct4 mIgG2b (gebruikt bij 1:200 verdunning)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>lot moet worden getest</td></tr><tr><td>Material/Equipment:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse embryonic fibroblasts (7 miljoen cellen/fles)</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6105M</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dishes: 10 cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes, pipettes, pipette tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass hematocytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture laminar flow hood with embedded microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture biosafety hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell sorting machine, d.w.z. MoFlo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml TB syringe 27Gx1/2</td><td>BD Biosciences</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>Cell lifter Polyethylene</td><td>Corning Incorporated</td><td>3008</td><td></td></tr></tbody></table>

voedingsvrije afleiding van neurale stamcellen uit humane pluripotente stamcellen

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Humane pluripotente stamcellen (hPSCs) hebben een groot potentieel voor het bestuderen van humane embryonale ontwikkeling, voor het modelleren van menselijke ziekten in de schaal en als een bron van te transplanteren cellen voor regeneratieve toepassingen na ziekte of ongeval. Neurale (NC) cellen zijn de voorlopers van een grote verscheidenheid aan volwassen somatische cellen, zoals cellen van het perifere zenuwstelsel en glia, melanocyten en mesenchymale cellen. Ze zijn een waardevolle bron van cellen om aspecten van de menselijke embryonale ontwikkeling, met inbegrip van lot van de cel specificatie en migratie te bestuderen. Verdere differentiatie van NC progenitorcellen in terminaal gedifferentieerde celtypes biedt de mogelijkheid om menselijke ziekten te modelleren vitro onderzoeken ziektemechanismen en het genereren van cellen voor regeneratieve geneeskunde. Dit artikel presenteert de aanpassing van een op dit moment beschikbaar in vitro differentiatie protocol voor de afleiding van NC cellen uit hPSCs. Dit nieuwe protocol vereist 18 dagen van verschilrentiation, is-feeder gratis, eenvoudig schaalbaar en zeer reproduceerbaar onder menselijke embryonale stamcellen (hESC) lijnen alsook humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) lijnen. Zowel oude als nieuwe protocollen opleveren NC cellen van gelijke identiteit.

De twee belangrijkste verbeteringen van de R-NC-protocol over de MS5-R-NC-protocol 11 zijn de feeder-vrij, gedefinieerd differentiatie voorwaarden en de algemene verkorting van de eis. MS5 feeder cellen 13 zijn muriene beenmerg afgeleide stromale cellen is aangetoond dat neurale differentiatie steun van hESCs 14. HESCs gekweekt op MS5 feeder-cellen bij lage dichtheid vorm epitheel en neurale structuren rozetten 15, aan de omtrek waarvan NC cellen ontstaan ​​10, waar...

Neurale lijst (NC) cellen afkomstig van menselijke pluripotente stamcellen (HPSC) hebben een groot potentieel voor het modelleren van de menselijke ontwikkeling en ziekte en voor celvervangingstherapieën. Hier, een voedingsvrije aanpassing van de momenteel gebruikte<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiatie protocol voor de afleiding van NC cellen uit hPSCs wordt gepresenteerd.

Voedingsvrije Afleiding van neurale stamcellen uit humane pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Het algemene doel van deze procedure is om neurale kamprogenitorcellen te genereren uit menselijke pluripotente stamcellen via een kort, reproduceerbaar en gedefinieerd protocol. Deze cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor zowel de in vitro studie van ziekten die verband houden met de neurale kam als voor de verdere differentiatie van deze cellen tot nakomelingen. Dit wordt bereikt door eerst een hoge dichtheid aan menselijke pluripotente stamcellen in een monolaag op Matrigel uit te platen.De tweede stap is het differentiëren van de cellen tot neuro-epitheliale cellen met behulp van een gedefinieerde volgorde en combinatie van kleine moleculen die inwerken op cruciale signaalpaden. Vervolgens worden de neuro-epitheliale cellen opnieuw uitgeplaat en verder gedifferentieerd tot neurale kamprogenitorcellen. De laatste stap is het isoleren van de neurale kamcellen via fluorescentie-geactiveerde cel sortering.Uiteindelijk worden immunofluorescentie en functionele assays, zoals het migratievermogen van de cellen, gebruikt om aan te tonen dat de juiste neurale kamcellen zijn gegenereerd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande protocollen voor de af

feeder-free-derivation-neural-crest-progenitor-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Om neurale lijst stamcellen (NCSC) kweken in vitro, is een speciaal medium (NCSCM) vereist. Essentieel onderdeel van NCSCM is kippenembryo extract (CEE). We beschrijven hier accurate technieken om een ​​maximale hoeveelheid van pure en hoge kwaliteit CEE, inclusief details zoals de isolatie, maceratie, centrifugeren en filtratie processen te produceren.

Productie van Chick Embryo Extract voor de teelt van Muizen neurale lijst Stem Cells

We hebben een protocol voor de inductie van neuroblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke neurale voorouders en neuronale celtypes in het ontwikkelen van CNS voor neurale reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

Isolatie van embryonale neurale lijst van de neurale buis vergemakkelijkt het gebruik...

Isolatie en Cultuur van neurale lijst cellen van embryonale Murine Neural Tube

Protocollen voor neuronale differentiatie van pluripotente menselijke stamcellen (hPSCs) vaak tijdrovend en vereisen grote celkweek vaardigheden. Hier hebben we een kleine molecule aangepast gebaseerde differentiatie procedure een multititre plaat formaat, zodat eenvoudige, snelle en efficiënte productie van humane neuronen in een gecontroleerde manier.

Snelle en efficiënte generatie van de neuronen van menselijke pluripotente stamcellen in een Multititre Plate Format

Pluripotente stamcellen, hetzij embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen vormen een waardevolle bron van menselijke gedifferentieerde cellen, zoals cardiomyocyten. Hier zullen we ons richten op de cardiale inductie van iPS cellen, laten zien hoe ze te gebruiken om functionele menselijke hartspiercellen te verkrijgen via een embryoid lichamen-gebaseerd protocol.

Generatie van Human Cardiomyocytes: Een Differentiatie Protocol van Feeder-vrije Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen biedt fascinerende perspectieven voor de afleiding van autologe transplantaties. Echter, de progressie door middel van een pluripotente toestand en moeizaam re-differentiatie nog belemmert klinische vertaling. Hier beschrijven we de afleiding van volwassen humane fibroblasten en hun directe omzetting in geïnduceerde neurale progenitor cellen en de daaropvolgende differentiatie tot neuronale lijnen.

Afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in Expandable Neural Progenitor Cellen

Dit werk beschrijft een in vitro differentiatie protocol bij gepigmenteerde, volwassen melanocyten uit menselijke pluripotente stamcellen te produceren via een neurale en melanoblast tussenstap met behulp van een feeder-vrij, 25 dagen protocol.

Feeder-vrij Afleiding van melanocyten uit menselijke pluripotente stamcellen

Hier presenteren we een protocol om precies te vormen hemogenic endoteel van menselijke pluripotente stamcellen in een feeder-en xeno-vrije voorwaarde. Deze methode zal hebben brede toepassingen in ziektemodel lering en screening voor therapeutische verbindingen.

Hemogenic endoteel differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in een voeder-en xeno-vrije gedefinieerde voorwaarde

In dit protocol beschrijven we een stabiele, zeer efficiënte differentiatiestrategie voor het genereren van postganglionische sympathische neuronen uit menselijke pluripotente stamcellen. Dit model zal neuronen beschikbaar stellen voor het gebruik van studies van meerdere autonome aandoeningen.

Efficiënte differentiatie van postganglionic Sympathische neuronen met behulp van menselijke pluripotente stamcellen onder Feeder-vrije en chemisch gedefinieerde cultuurvoorwaarden

We presenteren een driedimensionaal (3D) in vitro differentiatieprotocol dat neurosferen van reproduceerbare grootte genereert om craniale neurale lijstcellen te produceren uit embryonale stamcellen van muizen. We laten zien dat deze methodologie de variabiliteit vermindert in vergelijking met eerdere protocollen en hoe deze kan worden gebruikt voor multiplexed assay om de ontwikkeling van craniale neurale lijstcellen te bestuderen.

Het craniale Neurale Protocol van de Lijstcellen Driedimensionaal in vitro Differentiatie voor Gemultiplexte Analyse

Leer een voedingsvrije methode voor het afleiden van neurale stamcellen uit humane pluripotente stamcellen. Dit protocol maakt reproduceerbare differentiatie mogelijk voor onderzoek naar neurale lijnziekten.

Voedingsvrije Afleiding van neurale stamcellen uit humane pluripotente stamcellen

Meer video's verkennen