Name: Geautomatiseerde Meting van Microcirculatoire snelheid van de bloedstroom in longmetastasen van Rats (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Leer een geautomatiseerde methode voor het meten van microcirculatoire bloedstroomsnelheid in longmetastasen bij ratten met behulp van intravitale microscopie. Deze techniek biedt waardevolle inzichten voor oncologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De wetenschappelijke adviezen van Drs. Timothy McMahon en Siqing Shan worden gewaardeerd. De presentatoren danken Drs. David Kirsch en Patricia Steeg voor de genereuze gift van de fluorescent gelabelde muissarcoom en metastaserende MDAMB-231 cellen, respectievelijk. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de U.S. Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Prime Award Nummer N66001-10-C-2134, en gedeeltelijk door het Department of Radiation Oncology, Duke University Medical Center.

OPMERKING: Alle diergerelateerde procedures beschreven in dit protocol zijn eerder door de Duke University Institutional Animal Care en gebruik Comite (DUIACUC) goedgekeurd. 1. Cancer Cell Cultuur en Injection <ol><li> Cultiveren fluorescent gelabelde uitgezaaide kankercellen (bijv mens MDAMB231-GFP borstkankercellen, gift van Dr. Patricia Steeg, NCI, en YFP-gelabeld muis sarcoom cellen, gift van Dr. David Kirsch, Duke University Medical Center, afdeling Radiation Oncology) in geschikt kweekmedium (bijvoorbeeld Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline / streptavidine) bij 37 ° C tot ongeveer 90% confluent. </li><li> Trypsinize cellen, was ze dan 2 keer met PBS, tellen, en dan injecteren ze in de staart aderen van-isofluraan verdoofd 10 weken oud vrouwelijk naakt ratten op 5 miljoen cellen per dier, met behulp van een spuit met een 27 G naald. Chirurgische niveau verdoia wordt gecontroleerd door het gebrek aan reactie op teen knijpen. </li></ol> 2. Toezicht van Metastases behulp MicroCT <ol><li> Onderzoek ratten wekelijks behulp van een micro-CT / micro-bestraler, de aanwezigheid van metastasen boven ongeveer 2 mm diameter detecteren. De micro-CT wordt in opdracht zoals eerder beschreven 12. <ol><li> Onder ratten 3% isofluraan anesthesie voor beeldvorming. Bevestig diepe narcose door teen knijpen. </li><li> Na het begin van de anesthesie, snel overbrengen ratten naar de beeldvorming wieg in de beeldvorming kamer en sluit via een neus-cone om een ​​isofluraan-luchtmengsel bij 2,5-3%. Pas de positie van de rat in de houder zodanig dat de thorax is gepositioneerd in de fotonenbundel van de MicroCT scanner via de externe positie controles en laser scheidingsteken op de beeldvorming houder. Controleer de deur naar de beeldvorming kamer gesloten, de onderzoeker te beschermen tegen de gammastralen. </li><li> Controleer de positie van het dier opnieuw metde kleur videocamera. Voer een lage resolutie CT-beeldvorming proefdraaien, en gebruik het resulterende beeld om het gezichtsveld te passen aan de xyz afmetingen van de borstholte. </li><li> Afbeelding van de rat thorax met behulp van een 2 mm Al filter op 40 kVp, 2,5 mA, en 0,008 voxel op 7 FPS en terug te keren het dier naar zijn kooi. Beeldvorming van één dier niet meer dan 15 of 20 minuten duren. Heeft een dier dat een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld niet meer terug. Heeft een dier niet onbeheerd achter, totdat het voldoende weer bij bewustzijn is om borstligging behouden. </li><li> Bevestig metastasen door de verschijning van relatief radiopaak objecten die niet kunnen worden verklaard door intrathoracale bloedvaten (Figuur 1A) </li></ol></li></ol> 3. Window Kamer Chirurgie <ol><li> Anesthesie, vitale functies en de staart ader catheterisatie <ol><li> Selecteer dieren met aanwezigheid van metastatische ziekte. Injecteer dier met een intraperitoneale dose van 50 mg / kg pentobarbital. Bevestig chirurgische niveau anesthesie door teen knijpen voordat u verder gaat. Opmerking: Anesthesie protocollen te worden afgestemd op de respectieve experimentele opstelling. Pentobarbital is hier gekozen als langwerkende anesthesie, teneinde diepe anesthesie voor langdurige procedures induceren, terwijl het de mogelijkheid van gemakkelijke Herdosering. Echter, verlies van dieren overdosering is een veelvoorkomend probleem met pentobarbital verdoving. Een andere optie die autonome reflexen bewaart tot een grotere mate dan pentobarbital is ketamine in combinatie met sedativa zoals xylazine of medetomidine, die echter slechts toelaat voor een single-re dosiscyclus. </li><li> Scheer dieren op de zijkant van het lichaam die de metastatische ziekte heeft, en in de nek, met een clipper. Veeg alle losse resterende haren uit de huid. Na losse haren verwijderd is, gelden veterinaire zalf voor de ogen, om te voorkomen dat ze uitdrogen. OPMERKING: Athymische naakt ratten mogen resterende haren die buite hebbenres verwijderen alvorens verder te gaan met chirurgische procedures. Het is zeer belangrijk om alle haar grondig te verwijderen, omdat het kan interfereren met chirurgische procedures en beeldvorming. </li><li> Fix het dier in rugligging op een metalen plaat die op een temperatuur van 37 ° C water gecirculeerd verwarming pad wordt geplaatst. De voorste en achterste ledematen zijn bevestigd op de plaat met tape. Opmerking: Het is nuttig te controleren en opnemen vitale functies zoals hartslag en arteriële oxygenatie door een pulse oximeter gedurende chirurgische en experimentele procedures. </li></ol></li><li> Tracheaalintubatie <ol><li> Om een ​​katheter plaatsen ventilatie van het dier eerst een transversale cervicale incisie, gevolgd door de mediaan scheiding van de longitudinale spieren ventrale naar de luchtpijp. </li><li> Gebruik herhaald openen te sluiten actie met een scherpe tang om een ​​doorgang voor de hechting te creëren via de dorsale zijde van de luchtpijp. </li><li> Voeg een kleine incisie in de trachea op tHij buikzijde niet meer dan halfcirkelvormig, ongeveer tussen de tweede en derde trachea ring. Laat een voldoende lang gedeelte van de trachea blootgesteld op het dorsale oppervlak fixatie van de tracheale katheter mogelijk. </li><li> Plaats een 2,5-3,0 mm &quot;Y&quot; tracheacanule in de luchtpijp, en draai met een 4-0 monofilament hechtdraad. Controleer de canule is verbonden met een druk gefietst ventilator met een fles verbonden afloop buis die gevuld is met 6 cm water, positieve pulmonaire druk te handhaven. Instromende gas moet 100% zuurstof, tenzij experimenteel anders gewenst. </li><li> Plaats een katheter met een 25-27 G naald, en gevuld met gehepariniseerde zoutoplossing in een van de staart aderen van de rat, en zet vast met tape. OPMERKING: Zorg ervoor dat de doorgankelijkheid van de staart ader katheter tijdens de gehele procedure door herhaaldelijk injecteren van een kleine hoeveelheid heparine zoutoplossing in de staartader. Ook oro-tracheale intubatie, dwz de begeleiding van een trachealebuis via de mond van het verdoofde dier en langs de larynx in de trachea, is een mogelijk alternatief voor de tracheotomie procedure die hier wordt beschreven. Deze werkwijze vereist een speciale opleiding en ervaring, om schade aan de luchtpijp te voorkomen en ook om de toevallige cannulatie van de slokdarm voorkomen. </li></ol></li><li> Toepassing van pulmonale venster <ol><li> Verwijder het vel van de zijkant van de borst waarbij de metastasen zich, door het creëren van een incisie, en vervolgens verwijderen van de huid met behulp van stompe dissectie. Opmerking: De huid kan worden uitgesneden en verwijderd na onthechting </li><li> Ga verder met het ontleden van de twee lagen over elkaar spieren (pectoralis, serratus, en latissimus dorsi), maar het verlaten van de intercostale spieren intact. Een perforatie in de borstholte van ongeveer 1,5 cm in diameter, door het verwijderen van gedeelten van typisch twee aangrenzende ribben. In het ideale geval, zoek de perforatie in de regio van de zesde en zevende ribs. </li><li> Osteotomie: <ol><li> Om bloeden en beschadiging van de longen oppervlak minimaliseren, stevig vasthouden van de rib met een getande chirurgische forceps te snijden tijdens het snijden. Met chirurgische schaar, knip de mediale zijde van de eerste rib, onder een hoek van ongeveer 45 °, waardoor de puntige zijde van de resterende rib wijst buiten. </li><li> Vervolgens stuurde de zijkant van de rib op een soortgelijke wijze weer waardoor de puntige zijde van de rib naar buiten stekende, om schade aan de longen oppervlak te voorkomen. </li><li> Herhaal de procedure voor de aangrenzende rib, knip dan de intercostale spieren en verwijder het weggesneden stuk. Tijdens deze procedure handhaven long druk op een wijze die mechanische interactie tussen de long oppervlak en de ribbenkast geminimaliseerd. Doe dit door het adequaat regelen van inspiratie druk op de ventilator. </li></ol></li><li> Bevestiging van het paneel: <ol><li> Plaats een maat long raam, bestaande uit een dekglaasje dateen Plexiglas socket (Figuur 1B) bevestigd. Bevestig het venster naar de socket door lijmen of door een kleine hoeveelheid vacuüm vet. Plaats het venster zodanig dat oppervlak metastasen zijn dicht bij het midden van het venster. Indien nodig de geplaatste gat om de micrometastasen naar het midden van het venster meenemen vergroten het gat enigszins aan de respectievelijke zijde. OPMERKING: gemetastaseerde ziekte op de pleura oppervlak kan worden geïdentificeerd als duidelijk herkenbare witte stippen of gebieden binnen de anders roze-to-zalmkleurige gezonde delen van de long oppervlakte die voornamelijk langs de scheuren verschijnen. Terwijl micrometastasen kunnen voordoen op andere gebieden van de pleurale buitenkant, de onderzochte cellijnen bijna altijd weer opduiken micrometastasen in het geperforeerde gebied, eenmaal metastasen radiologisch kunnen worden gedetecteerd. </li><li> Nadat de fitting in de perforatie en maken direct contact met de viscerale pleura van de lung, hechten de randen van het raamkozijn aan de omringende intercostale spieren, met 4,0 monofilament hechting (figuur 1C). Gebruik een lichte stijging van inspiratie druk op de ventilator om restlucht helpen te ontsnappen en een afdichting. Opmerking: De ademhalingssnelheid van ratten kan sterk variëren, afhankelijk van de status van anesthesie, de status van opwinding of angst, zuurstofconcentratie van ingeademde lucht (FiO 2), etc. Het verdient aanbeveling de ademhalingsfrequentie tussen 70 en 90 slagen passen. De inspiratie druk dient te worden aangepast met de nodige voorzichtigheid en niet worden ingesteld op meer dan ong. 8 cm H2O (0,6 mmHg) om schade aan de longen oppervlak beschadigt. </li></ol></li><li> Plaats het dier in een speciaal ontworpen restrainer die ontworpen Z-gerichte beweging (figuur 1D) op een stalen plaat die is geplaatst op een thermostatisch (elektrisch) verwarmingsdeken elimineren onder een fluorescentie microscoop. Controle lichaam van het diertemperatuur met behulp van een rectaal thermistor. Stel de schroeven van het dier weerhouder en de inspiratie druk op de ventilator om optimale controle van zijwaartse beweging te bereiken. Opmerking: Natuurlijke ademhaling bij zoogdieren heeft betrekking op alle drie de richtingen van de long beweging en borst uitbreiding: bilateraal, dorso-ventrale en cranio-caudale. Om de natuurlijke ademhaling beweging zoveel mogelijk behouden, is het belangrijk om z-richting compressie voor zover noodzakelijk minimaliseren. Omdat de Z-dimensionale beperking heeft het potentieel artefacten die van invloed bloedstroom en andere parameters invoeren, is het raadzaam om condities constant te houden tijdens aantal herhaalde metingen in hetzelfde dier. </li></ol></li></ol> 4. Imaging en waardering van Microcirculatoire Blood Flow <ol><li> Verzamel rode bloedcellen via hartpunctie en labelen met Dil (1,1 = -dioctadecyl 3,3,3 = 3 = tetramethyl-indocarbocyanine perchloraat), zoals eerder beschreven &lt;sup&gt; 10. </li><li> Injecteer 300 ui gelabelde rode bloedcellen in de staartader van de rat voor het raam kamer operatie wordt uitgevoerd, eerst door hechting effecten op het glasraam voorkomen. Verwijder luchtbellen in de spuit of katheter, zoals inbrengen van lucht in de ader zal verdere injecties remmen. </li><li> Afbeelding bloedstroom met een microscoop CCD camera bij -40 ° C chip koeltemperatuur en ongeveer 100X algemeen resolutie (dwz met een 10x microscoop objectief en 10X pre-camera oculair). Gebruik standaard Rhodamine / TRITC filter sets (excitatie 450-490 nm, emissie&gt; 515 nm). Noteer de werkelijke framesnelheid en pixel resolutie van het resulterende beeld sequenties. Record minstens 200 (idealiter rond 300) beelden per stapel, om een ​​succesvolle analyse van de stroomsnelheid te garanderen. </li><li> Vul vochtverlies in het dier door het injecteren ongeveer 1 ml zoutoplossing ip elk uur. OPMERKING: Experimentele instellingen die een interventie te betrekken, bijvoorbeeldeen geneesmiddel dat de bloedstroomsnelheid in een longkanker metastase wijzigt, dat meerdere metingen van de bloedstroomsnelheid in pulmonaire metastatische kanker. Voor deze uitgebreide experimenten is het belangrijk om het dier voldoende vloeistof vullen. </li><li> Euthanaseren de dieren door infusie van 3 ml 3 N KCl in de staartader </li><li> Evalueer het beeld stapels met behulp van een gepubliceerde, publiekelijk beschikbare Matlab-computer-algoritme, dat zal leiden tot stroomsnelheid grijswaarden en kleur gecodeerde kaarten voor alle bloedstroom sporen 10,11. De resulterende beelden in grijstinten met behulp van commerciële of openbare beeldanalyse software, zoals Image J, vervolgens evalueren na drempelen off waarden die aangeven geen beweging van bloedcellen, dwz geen actieve vaatstelsel. </li></ol>

<ol><li>Billingsley, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+metastases+from+soft+tissue+sarcoma%3A+analysis+of+patterns+of+diseases+and+postmetastasis+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Pulmonary metastases from soft tissue sarcoma: analysis of patterns of diseases and postmetastasis survival.</a> Ann Surg. 229, 602-610 (1999).</li>
<li>Rashid, O. M., Takabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+the+role+of+surgery+in+the+management+of+breast+cancer+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Dis%22%5BJournal%5D)">The evolution of the role of surgery in the management of breast cancer lung metastasis.</a> J Thorac Dis. 4, 420-424 (2012).</li>
<li>Mayer, A., Vaupel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%2C+lactate+accumulation%2C+and+acidosis%3A+siblings+or+accomplices+driving+tumor+progression+and+resistance+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+experimental+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia, lactate accumulation, and acidosis: siblings or accomplices driving tumor progression and resistance to therapy.</a> Advances in experimental medicine and biology. 789, 203-209 (2013).</li>
<li>Okunieff, P., O'Dell, W., Zhang, M., Zhang, L., Maguire, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+oxygen+measurements+and+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+experimental+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Tumor oxygen measurements and personalized medicine.</a> Advances in experimental medicine and biology. 765, 195-201 (2013).</li>
<li>Palmer, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+optical+molecular+imaging+and+analysis+in+mice+using+dorsal+window+chamber+models+applied+to+hypoxia%2C+vasculature+and+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent reporters.</a> Nature protocols. 6, 1355-1366 (2011).</li>
<li>Palmer, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+tumor+hypoxia+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+optics%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of tumor hypoxia dynamics.</a> Journal of biomedical optics. 15, (2010).</li>
<li>Funakoshi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+lung+metastasis+for+intravital+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">A new model of lung metastasis for intravital studies.</a> Microvasc Res. 59, 361-367 (2000).</li>
<li>Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+assessment+of+pulmonary+vascular+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Am+Thorac+Soc%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging assessment of pulmonary vascular responses.</a> Proc Am Thorac Soc. 8, 458-465 (2011).</li>
<li>Tabuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precapillary+oxygenation+contributes+relevantly+to+gas+exchange+in+the+intact+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung.</a> Am J Respir Crit Care Med. 188, 474-481 (2013).</li>
<li>Hanna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+measurement+of+blood+flow+velocity+and+direction+and+hemoglobin+oxygen+saturation+in+the+rat+lung+using+intravital+microscopy.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy. American journal of physiology.</a> Lung cellular and molecular physiology. 304, 86-91 (2013).</li>
<li>Fontanella, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mapping+of+hemodynamics+in+the+lung%2C+brain%2C+and+dorsal+window+chamber-grown+tumors+using+a+novel%2C+automated+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Quantitative mapping of hemodynamics in the lung, brain, and dorsal window chamber-grown tumors using a novel, automated algorithm.</a> Microcirculation. , (2013).</li>
<li>Newton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commissioning+a+small-field+biological+irradiator+using+point%2C+2D%2C+and+3D+dosimetry+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+physics%22%5BJournal%5D)">Commissioning a small-field biological irradiator using point, 2D, and 3D dosimetry techniques.</a> Medical physics. 38, 6754-6762 (2011).</li>
<li>Vaupel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironmental+physiology+and+its+implications+for+radiation+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+radiation+oncology%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology.</a> Seminars in radiation oncology. 14, 198-206 (2004).</li>
<li>Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+the+murine+pulmonary+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation.</a> J Appl Physiol. 104, 338-346 (2008).</li>
<li>Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+for+the+study+of+pulmonary+microcirculation%3A+determination+of+pulmonary+edema+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats.</a> J Surg Res. 57, 385-393 (1994).</li>
<li>Manzoor, A. A., Schroeder, T., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-stop-shop+tumor+imaging%3A+buy+hypoxia%2C+get+lactate+free%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">One-stop-shop tumor imaging: buy hypoxia, get lactate free.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 1616-1619 (2008).</li>
<li>Evans, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+analytical+methods+as+applied+to+the+evaluation+of+vasculature+and+hypoxia+in+human+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+research%22%5BJournal%5D)">Imaging and analytical methods as applied to the evaluation of vasculature and hypoxia in human brain tumors.</a> Radiation research. 170, 677-690 (2008).</li>
<li>Radiloff, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combination+of+theophylline+and+endothelin+receptor+antagonism+improves+exercise+performance+of+rats+under+simulated+high+altitude%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">The combination of theophylline and endothelin receptor antagonism improves exercise performance of rats under simulated high altitude.</a> Journal of applied physiology. 113, 1243-1252 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een model wordt gepresenteerd dat haalbaar is om beeld verandert in de microcirculatie bloedstroom en andere dynamische processen in longmetastasen van ratten, met behulp opklaren en computationele bloedstroom analyse. Terwijl andere methoden bestaan ​​om microscopie voeren op blootgestelde longen in de open borstkas van knaagdieren, dit model is ook de eerste die afbeelding longmetastasen door een borstwand perforatie in een gesloten kist setting. Met behulp van deze methode wordt de haalbaarheid aangetoond dat farmaco...

De long is een van de belangrijkste doelorganen van metastatische ziekten, en omdat deze aandoening moeilijk te behandelen is met chemo- en stralingstherapie, is een genezing nog steeds zeldzaam1,2. Specifieke pathofysiologische en microcirculatoire kenmerken van solide primaire en metastatische tumoren, zoals microregionale hypoxie, diffusiebeperking en inefficiënte tumorvaten, dragen in grote mate bij aan hun weerstand tegen antikankerbehandelingen3,4. Vanwege de microscopische schaal en dynamische aard van parameters zoals microvasculair bloedvolume, is intravitale microscopie van de tumor in het levende dier een zeer belangrijk onderzoeksinstrument in het veld geworden5. Hoewel intravitale microscopiemodellen zijn toegepast op tumoren op verschillende plaatsen in het lichaam, inclusief de metastatische long binnen een open ribbenkast, is er nog geen protocol ontwikkeld voor het onderzoek naar pulmonaire metastasen in een fysiologisch behoudende, gesloten-borstkas omgeving6,7. Een dergelijke onderneming wordt met name gehinderd door de noodzaak om chirurgisch toegang te krijgen tot de ribbenkast zonder de algehele functie van de long te beïnvloeden7-9. Onlangs is een methode geïntroduceerd om pulmonaire microcirculatoire bloedstroom te beeldvormen in een gesloten-borstkas omgeving bij levende ratten, met behulp van fluorescente intravitale microscopie10. Dit protocol maakt de systematische kwantificering van bloedstroomsnelheid van geïnjecteerde, fluorescerend gelabelde rode bloedcellen mogelijk, met behulp van geautomatiseerde analyse, terwijl het dier fysiologisch stabiel blijft en de integriteit van de long behouden blijft11. In deze studie wordt getoond hoe deze technologie kan worden aangepast om microcirculatoire bloedstroom in staartvene-geïnfecteerde pulmonaire metastasen op het pleuraoppervlak in de immuungecompromitteerde rat te beeldvormen en te kwantificeren. Dit model is ook het eerste om metastatische longtumoren te bestuderen in een gesloten-borstkas intravitale microscopie omgeving.

<table><tbody><tr><td>Athymic nude rats</td><td>Charles River</td><td>Strain code 316</td><td>Female 10 week-old athymic nude rats</td></tr><tr><td>micro-CT/micro-Irradiator&nbsp;</td><td>Precision X-ray Inc.</td><td>Xrad 225Cx</td><td>Gebruik MicroCT om metastasen te detecteren</td></tr><tr><td>DiI (1,1=-dioctadecyl-3,3,3=,3=-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>468495-100MG</td><td>Meng 100 ul verpakte rode bloedcellen met 100 ul van 0,5 mg/ml DiI in 200 proof ethanol, 2 ml van 5% dextrose-oplossing in water, en vul op tot een eindvolume van 10 ml met zoutoplossing</td></tr><tr><td>Rodent ventilator</td><td>Kent Scientific</td><td>TOPO Small Animal Ventilator</td><td>Apparaat is belangrijk om de positieve longdruk na toepassing van pneumothorax te handhaven</td></tr><tr><td>Zeiss Axioskop fluorescence microscope upright</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop</td><td>Microscoop voor intravitale beeldvorming</td></tr><tr><td>Andor CCD camera</td><td>Andor</td><td>iXonEM 885</td><td>CCD-camera voor live beeldvorming van bloedstroom</td></tr><tr><td>Pulse oximeter</td><td>StarrLife</td><td>MouseOx</td><td>Pulsoximeter</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop</td><td>Fluorescentiemicroscoop</td></tr></tbody></table>

geautomatiseerde meting van microcirculatoire snelheid van de bloedstroom in longmetastasen van rats

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

Omdat de long een belangrijk doelorgaan is voor metastaserende ziekten, zijn diermodellen om de fysiologie van pulmonale metastasen te bestuderen van groot belang. Er bestaan echter tot op heden maar zeer weinig methoden om longmetastasen op dynamische wijze op microcirculair niveau te onderzoeken, vanwege de moeilijkheid om de long met een microscoop te benaderen. Hier wordt een intravitale microscopiemethode gepresenteerd om de microcirculatie van oppervlakkige pulmonale metastasen bij ratten functioneel af te beelden en te kwantificeren, met behulp van een gesloten borstvliesvenster en geautomatiseerde analyse van bloedstroomsnelheid en -richting. De bruikbaarheid van deze methode wordt gedemonstreerd om toenames in bloedstroomsnelheid te meten als reactie op farmacologische interventie, en om de bekende bochtige vasculaire structuur van vaste tumoren af te beelden. Dit is de eerste demonstratie van intravitale microscopie op pulmonale metastasen in een model met gesloten borst. Vanwege de geminimaliseerde invasiviteit, evenals vanwege de relatieve eenvoud en praktische toepasbaarheid, heeft deze technologie het potentieel om wijdverspreid te worden gebruikt in laboratoria die gespecialiseerd zijn in longtumoronderzoek.

Het vaatstelsel in solide tumoren is bekend dat het aanzienlijk afwijken van de normale bloedvoorziening, tonen een grotere mate van tortuositeit, en hogere INTERVASCULAR afstanden 13. Dienovereenkomstig bloedstroom tracks in experimentele pulmonaire borstkanker en sarcoom metastasen onregelmatige vormen en grote INTERVASCULAR gaten (figuur 2A, onderste twee panelen) vergeleken met de normale pulmonaire microcirculatie (Figuur 2A, bovenste paneel). In een eerdere studie, het ...

Er wordt een methode gepresenteerd om de snelheid van de microcirculatoire bloedstroom te meten in longkankermetastasen van het pleuraoppervlak bij ratten op een geautomatiseerde manier, met behulp van gesloten-borst intravitale longmicroscopie. Dit model heeft het potentieel om als een wijdverbreid hulpmiddel te worden gebruikt om fysiologisch onderzoek uit te voeren naar longmetastasen bij knaagdieren.

Geautomatiseerde Meting van Microcirculatoire snelheid van de bloedstroom in longmetastasen van Rats

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Het algemene doel van deze procedure is het maken van een thoracaal venster voor intravitale microscopie bij een rat met longmetastasen. Dit wordt bereikt door eerst het dier met metastasen te anesthetiseren, te intuberen en aan te sluiten op een ventilator voor kleine dieren voor overdrukventilatie. Vervolgens worden fluorescentie-gelabelde rode bloedcellen in de staartvene van het dier geïnjecteerd.Vervolgens wordt de borstholte chirurgisch geopend zonder het longoppervlak te beschadigen, wordt de metastase geïdentificeerd en wordt er een window geplaatst. Ten slotte wordt microscopische beeldvorming van het dier uitgevoerd. Uiteindelijk maken de chirurgische opening van de long en de plaatsing van een window voor acute microscopie in de levende rat geautomatiseerde metingen van de microcirculatoire bloedstroom in longmetastasen mogelijk.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals micro-CT-thoraxbeeldvorming, niet-invasieve epitthoracale microscopie en micro-PET van de oncologische long, is dat het real-time metingen mogelijk maakt met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie van de microcirculatie van pulmonale metastasen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van pulmonale metastasering, zoals de wijze waarop behandelingen of cancerprogressie de bloedstroom en uiteindelijk de hypoxie in longmetastasen kunnen beïnvloeden. De implicaties van deze techniek reiken tot de diagnose en therapie van pulmonale metastatische kanker, omdat het een ongekend inzicht biedt in de dynamiek van de microcirculatoire en metabole micro-omgeving van deze metastatische tumoren.Deze methode zal de weg openen naar een beter begrip van de dynamiek van longmetastasen en de microcirculatie, en zal zo helpen bij het verbeteren van de huidige behandelstrategen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat er ervaring nodig is om de instellingen zodanig aan te passen dat de autonome beweging van de long wordt geminimaliseerd. Nadat metastatisch kanker bij een rat is geïnduceerd en bevestigd volgens het tekstprotocol en het dier is geanestheseerd met een intraperitonele dosis pentobarbital, wordt een knijptest bij de teen uitgevoerd om de sedatie te bevestigen.Scheer het dier aan de zijde van het lichaam waar de metastatische ziekte zich bevindt en in het nekgebied, en veeg alle resterende losse haren van de huid om te voorkomen dat deze de beeldvorming hinderen. Breng veterinaire zalf aan in de ogen om uitdroging te voorkomen. Plaats het dier in rugligging op een metalen plaat op een watergecirculeerde warmtemat van 37 °C en gebruik tape om de voor- en achterpoten te fixeren.Bevestig een pulsoximeter voor het bewaken en registreren van de vitale functies gedurende de gehele procedure om de rat te intuberen. Begin met het maken van een transversale cervicale huidincisie. Scheid vervolgens met een scherp pincet de longitudinale musculatuur ventraal van de trachea mediaal.Gebruik een herhaalde openende en sluitende beweging om een doorgang voor de hechtdraad te creëren door de dorsale zijde van de trachea op de ventrale zijde tussen de tweede en derde trachearing. Maak een kleine incisie in de trachea. Laat een voldoende lang gedeelte van de trachea op het dorsale oppervlak blootgesteld om fixatie van de katheter mogelijk te maken.Plaats vervolgens een Y-trachealkanule van 2,5 tot 3,0 millimeter in de trachea en gebruik een monofilament hechtdraad 4-0 om deze vast te zetten. Om een positieve longdruk te behouden, wordt de kanule via een drukgestuurde ventilator aangesloten op 100% oxygen, met een fles gevuld met zes centimeter water die is aangesloten op het uitademingskanaal. Gebruik daarna een naald van 25 tot 27 gauge en een spuit gevuld met gehepariniseerde zoutoplossing om een katheter in een van de staartvenen in te brengen en fixeer deze met tape. Injecteer vervolgens 300 microliters rode bloedcellen, die vooraf zijn verzameld en gelabeld met DII volgens het tekstprotocol, in de staartvene van de rat om een pulmonaal venster te creëren.Maak een incisie aan de zijde van de borstkas waar de tumor zich bevindt en scheid de huid los middels botte dissectie. Disseceer de twee lagen overlappende musculatuur en laat de intercostaalspieren intact in de regio van de zesde en zevende rib. Maak een perforatie in de borstholte van ongeveer 1,5 centimeter diameter om een osteotomie uit te voeren.Begin met het aanpassen van de inspiratiedruk op de ventilator, zodat de mechanische interactie tussen het longoppervlak en de borstkas wordt geminimaliseerd. Verwijder delen van de zesde en zevende rib door de te knippen rib stevig vast te houden met een chirurgische tandextractietang en deze door te knippen met een chirurgische schaar. Knip de mediale zijde van de rib onder een hoek van ongeveer 45 graden, waarbij de scherpe zijde naar buiten is gericht.Snijd de laterale zijde van het bot op een soortgelijke manier, waarbij de puntige zijde opnieuw naar buiten blijft wijzen. Om beschadiging van de long te voorkomen, herhaalt u de osteotomie bij de aangrenzende rib voordat u de intercostale spieren doorsnijdt en het uitgesneden stuk verwijdert. Maak een op maat gemaakt lang venster door met lijm of een kleine hoeveelheid vacuümvet een dekglas aan een plexiglas houder te bevestigen.Plaats vervolgens het venster zodanig dat de oppervlaktemetastasen dicht bij het centrum van het venster liggen, waarbij het gat indien nodig aan één zijde wordt vergroot. Nadat de houder in de perforatie is geplaatst en er direct contact is ontstaan met de viscerale pleura van de long, worden de randen van het vensterframe met een vier-nul monofilamenthechting aan de omringende intercostale spier gehecht. Verhoog de inspiratiedruk op de ventilator om het ontsnappen van resterende lucht te bevorderen en een afdichting te creëren.Plaats het dier vervolgens in een op maat gemaakte fixatiehouder die is ontworpen om beweging in de Z-richting te elimineren en positioneer het op een verwarmde stalen plaat onder een fluorescentiemicroscoop. Voeg daarna een rectale thermistor in om de lichaamstemperatuur van het dier te regelen. Pas de schroeven van de fixatiehouder en de inspiratiedruk op de ventilator aan om een optimale beheersing van de laterale beweging te bereiken.Voor beeldvorming en metingen van de microcirculatoire bloedstroom. Gebruik een CCD-camera met een chipkoelingstemperatuur van -40 °C en een 10x objectief. Leg met standaard rod Domine Trit C-filtersets de werkelijke framerate en pixelresolutie van de resulterende beeldsequenties vast.Registreer ten minste 200 beelden per stack om een succesvolle analyse van de stroomsnelheid te waarborgen. Voer tijdens de beeldsessies elk uur een intraperitoneale injectie van ongeveer één milliliter zoutoplossing uit om het vochtverlies bij het dier aan te vullen en een constante bloedstroomsnelheid te handhaven.Euthanaseer het dier volgens het tekstprotocol nadat de beeldvorming is voltooid. De vasculatuur in solide tumoren staat erom bekend significant te verschillen van de normale bloedvoorziening, waarbij een grotere mate van tortuositeit en grotere intervasculaire afstanden optreden. Overeenkomstig wat hier wordt getoond, vertonen bloedstroombanen in experimentele pulmonale borstkanker en metastasen onregelmatige vormen en grote intervasculaire openingen in vergelijking met de normale microcirculatie.In deze studie, vergelijkbaar met wat is aangetoond in gezonde longen, leidde dosering met een combinatie van efedrine en de endotheline-receptorantagonist entin tot een verhoging van de bloedstroomsnelheid in muissarcomen. Elk datapunt vertegenwoordigt de gepoolde individuele gemiddelden van drie metingen met intervallen van vijf minuten, gemiddeld over de gegevens die zijn verkregen bij vijf dieren. De eerste injectie verhoogde de bloedstroomsnelheid in het tumorgebied significant van 0.61 ± 0.12 millimeters per seconde naar 0.74 ± 0.19.Terwijl de tweede injectie de verhoogde stroomsnelheid handhaafde op 0,74 plus of minus 0,19 millimeters per seconde. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat scherpe puntstructuren vermeden moeten worden tijdens het opensnijden van de borstkas, omdat dit kan leiden tot subsequent letsel en bloedingen van de long na de ontwikkeling. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van onderzoek naar longmetastasen om eindpunten te verkennen die gerelateerd zijn aan de ontwikkeling van anticancermiddelen, zoals diffusie, beperking van de toediening van cytotoxische geneesmiddelen en diffusiebeperkte hypoxie en ratmodellen voor longmetastasen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u chirurgische toegang verkrijgt tot de gezonde long of de long met metastasen van de rat en hoe u hiermee microscopische beeldvorming uitvoert.

automated-measurement-microcirculatory-blood-flow-velocity-pulmonary

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Normale volwassen gevasculariseerde weefsel van zoogdieren die fysiologische angiogenese en die mist nog niet is blootgesteld aan chirurgische ingreep wordt gebruikt om te bestuderen: (i) de instelling en ontwikkeling van angiogenese na intraperitoneale toediening van test-agenten, en (ii) wijziging van angiogenese na systemische toediening van geselecteerde test agenten.

Rat mesenterium Angiogenese Assay

Hypoxische pulmonale vasoconstrictie (HPV) is een belangrijk fysiologisch fenomeen waarbij bij alveolaire hypoxie longperfusie wordt afgestemd op beademing. Het belangrijkste vasculaire segment dat bijdraagt aan HPV is de intra-acinaire slagader. Hier beschrijven we ons protocol voor de analyse van HPV van muriene longvaten met diameters van 20-100 μm.

Videomorfometrische analyse van hypoxische pulmonale vasoconstrictie van intrapulmonale slagaders met behulp van murineprecisie gesneden longschijfjes

De geïsoleerde bloed geperfundeerd long bereiding maakt het mogelijk om microvaatje netwerken visualiseren op het longoppervlak. Hier beschrijven we een aanpak om de permeabiliteit van enkele bloedvaten in geïsoleerde longen te kwantificeren met behulp van real-time fluorescentie beeldvorming.

Kwantificeren Single microvessel permeabiliteit in Geïsoleerde-Blood geperfuseerde Rat Lung Voorbereiding

De gemodificeerde Landis-techniek maakt gepaarde meting mogelijk van de hydraulische geleidbaarheid van individuele microvaten in de mesenterium van normale en genetisch gemodificeerde ratten onder controle- en testomstandigheden met behulp van microperfusietechnieken. Het biedt een handige methode om mechanismen te evalueren die de doorlaatbaarheid van microvaten en transvasculair uitwisseling onder fysiologische omstandigheden reguleren.

Microperfusion techniek te onderzoeken verordening van microvessel permeabiliteit in Rat Mesenterium

Dit manuscript beschrijft de ontwikkeling van een diermodel dat directe testen van de effecten van tumorhypoxie op metastase en het ontcijferen van de werkingsmechanismen mogelijk maakt. Hoewel de hier beschreven experimenten zich richten op Ewing-sarcoom, kan een vergelijkbare aanpak worden toegepast op andere tumortypen.

In vivo model voor het testen Effect van hypoxie op tumormetastase

Hier wordt een protocol gepresenteerd om de coronaire microcirculatie in levend murinehartweefsel te bestuderen door ex vivo monitoring van de arteriële perfusiedruk en -stroom die de druk handhaaft, evenals vasculaire boomcomponenten, waaronder de capillaire bedden en pericyten, omdat de septale slagader wordt ingeblikt en onder druk staat.

Dynamische meting en beeldvorming van haarvaten, slagaders en pericyten in muishart

Hier presenteren we een protocol voor de chirurgische implantatie van een permanent inwonend optisch venster voor de muriene thorax, dat een hoge resolutie, intravitale beeldvorming van de long mogelijk maakt. De duurzaamheid van het venster maakt het zeer geschikt voor de studie van dynamische cellulaire processen in de longen, vooral die welke langzaam evolueren, zoals gemetastaseerde progressie van verspreide tumorcellen.

Een permanent venster voor het onderzoeken van kankermetastase naar de longen

Dit protocol introduceert een snelle methode voor kwantitatieve driedimensionale vasculaire beeldvorming op de hele berg met behulp van light-sheet fluorescentiemicroscopie. De werkzaamheid van de methode wordt aangetoond met behulp van het faryngeale boogslagadersysteem van het kuikenembryomodel, waarbij hemodynamische krachten worden gekwantificeerd via computationele vloeistofdynamica.

Snelle beeldvorming met hoge resolutie van de hele berg van het vaatstelsel van kleine dieren voor kwantitatieve studies

Het protocol biedt een gedetailleerde introductie tot de ervaring van het gebruik van de juiste hartkatheterisatiemethode om de bloeddruk van de longslagader bij ratten te detecteren, wat helpt om nauwkeurige gegevens efficiënter te verkrijgen en het slagingspercentage van het experiment te verbeteren. Deze methode verbetert ook de reproduceerbaarheid van experimenten in verschillende laboratoria.

Meting van de longslagaderdruk bij ratten met behulp van rechterhartkatheterisatie

De endotheliale glycocalyx / endotheliale oppervlaktelaag is ideaal bestudeerd met behulp van intravitale microscopie. Intravitale microscopie is technisch uitdagend in een bewegend orgaan zoals de longen. We zien hoe gelijktijdige helderveld en fluorescentiemicroscopie kan worden gebruikt om endotheeloppervlak laagdikte schatten in een vrij...

In vivo meting van de muis Pulmonary Endothelial oppervlaktelaag

Leer een geautomatiseerde methode voor het meten van microcirculatoire bloedstroomsnelheid in longmetastasen bij ratten met behulp van intravitale microscopie. Deze techniek biedt waardevolle inzichten voor oncologisch onderzoek.

Geautomatiseerde Meting van Microcirculatoire snelheid van de bloedstroom in longmetastasen van Rats

Meer video's verkennen