Uitgebreide analyse van de transcriptie van Brain Dynamics Monsters Na Behavioral Experience

Het algemene doel van het volgende experiment is om de transcriptionele dynamiek en gedefinieerde hersenkernen van muizen na gedragsmatige ervaringen te bestuderen. Dit wordt bereikt door de dieren eerst te laten wennen en hun locomotorische activiteit na een zoutoplossingsinjectie te registreren. Zodra de gewenning is voltooid, wordt de locomotorische activiteit na een enkele dosis cocaïne geregistreerd, waarna monsters uit de nucleus accumbens worden verzameld en gebruikt voor RNA-isolatie en cDNA-preparatie.

Vervolgens wordt een qPCR-analyse uitgevoerd om de door gedrag geïnduceerde genexpressie te bestuderen. Uiteindelijk worden resultaten verkregen die de transcriptionele dynamiek na blootstelling aan cocaïne laten zien. Het protocol zal gedurende drie opeenvolgende dagen worden gedemonstreerd door Dr. Hatu, de labmanager, Dum Muer, een promovendus uit het lab, en Duran, een bachelorstudent uit het lab. Elke muis wordt gewend aan de hanteer- en injectieprocedures; de muizen worden vóór de start van het experiment in kooien georganiseerd, zodat de muizen in de toekomst niet tussen kooien worden overgeplaatst en nooit gedurende een langere periode in isolatie worden gelaten.

30 minuten voor aanvang van de tests moeten alle testkooien naar de gedragskamer worden verplaatst, zodat de dieren kunnen acclimatiseren aan de omgeving. Dien een intraperitoneale injectie van 250 microliters saline toe; plaats de muis direct na de injectie in een gedragskamer om de locomotorische activiteit gedurende 15 minuten te monitoren. De muis kan gedurende 20 minuten in de gedragskamer worden geplaatst.

Een activiteit die wordt gemonitord van minuut twee tot 17. Herhaal deze stappen op hetzelfde tijdstip van de dag gedurende de volgende twee dagen. Dien op de vierde dag een enkele injectie cocaïne of zoutoplossing toe, afhankelijk van de groep, en plaats de muis onmiddellijk in de kamer om de lokale motorische activiteit gedurende 20 minuten te monitoren op geselecteerde tijdstippen na blootstelling aan cocaïne; neem vervolgens de hersenen uit en plaats deze gedurende één tot twee minuten in een ijskoude A CSF-oplossing om ze te koelen en te harden.

Nadat het cerebellum is verwijderd en overtollig vocht is weggezogen, wordt het brein met het rostrale deel naar boven vastgelijmd op de tafel van een vibraatom. Vul de kamer met ijskoud A CSF en maak coupes van 200 micron totdat de nucleus accumbens duidelijk is geïdentificeerd. Let tijdens het snijden nauwkeurig op de vorm van het corpus callosum, de locatie en vorm van de commissura anterior en de ventrikels.

Zodra de juiste regio is geïdentificeerd, worden twee secties van 400 microns gesneden waaruit de nucleus accumbens onder een stereoscoop zal worden gedisseceerd. Gebruik een fijn mesje om de nucleus accumbens uit de secties te disseceren. Vier snelle sneden met het mesje in het juiste gebied zouden het betreffende weefsel onmiddellijk moeten isoleren.

Plaats het geïsoleerde weefsel in 900 µL lysereagens en bewaar dit bij -80 °C tot de RNA-extractie; begin met het ontdooien van de buisjes bij 37 °C en homogeniseer deze. Met behulp van een naald van 25 gauge kunnen de eerste paar rondes lastig zijn, waarbij het weefsel tegen de wand van het buisje moet worden gedrukt om het in kleine stukjes te homogeniseren. Om een goede homogenisatie te waarborgen, wordt het lysaat op een kaya shredder mini spin column gepipetteerd en gecentrifugeerd.

Pipetteer het lysaat in een nieuwe microcentrifugebuis en extraheer het RNA volgens de instructies van de fabrikant. Na de RNA-zuivering wordt omgekeerde transcriptie naar cDNA uitgevoerd, evenals doelspecifieke pre-amplificatie van de monsters met primers gericht tegen de groep genen die voor de analyse is gekozen. Deze procedures worden beschreven in de tekstversie van het protocol.

Commerciële microfluidische chips voor uitgebreide QPCR-analyse zijn verkrijgbaar in een 48 bij 48-formaat, waarmee 48 monsters met 48 probesets kunnen worden geanalyseerd, of in een 96 bij 96-formaat waarbij 96 monsters met 96 probes worden geanalyseerd. In de meeste gevallen hangt de keuze van de chip primair af van het aantal te analyseren monsters.

Bereid eerst het monster mengsel voor op basis van de chip die voor het experiment is gekozen. Wees voorzichtig bij het pipetteren van het 20 XDNA-bindingskleurstof monsterlaadreagens. Agiteer de oplossingen van het monster mengsel gedurende minimaal 20 seconden en centrifugeer gedurende ten minste 30 seconden.

Voorbereide reacties kunnen gedurende korte perioden worden bewaard bij 4 °C totdat de chip klaar is voor belading. Bereid vervolgens het assay-mengsel voor, schud het monster-mengsel grondig en centrifugeer om alle componenten naar beneden te brengen. Zoals eerder getoond, heeft de dynamic array IFC-chip inlaatopeningen voor monsters en assays, evenals specifieke inlaatopeningen voor de controlelijn-vloeistof die wordt gebruikt om de microfluïdische kamers onder druk te zetten.

Injecteer eerst vloeistof voor de controlelijn in elke accumulator op de chip. Prime vervolgens de chip door deze in de IFC-controller te plaatsen en het bijbehorende script uit te voeren. Wanneer het script is voltooid, verwijdert u de geprimede chip uit de IFC-controller en pipetteert u 5 µL van elke assay.

Meng op de chip. Voeg vijf µL van elk monster-mengsel toe aan de bijbehorende inlaatopeningen en plaats de chip terug in de IFC-controller met behulp van de IFC-controller-software. Voer het script uit om de monsters en assays in de chip te laden.

Wanneer het script voor het laden van de mengsels is voltooid, verwijdert u de geladen chip uit de IFC-controller. Plaats de chip vervolgens in de thermocycler en start een nieuwe chip-run inclusief een smeltcurve-analyse. Controleer met de software van de thermocycler of de reactiekamers correct worden herkend en laat de reactie volledig doorlopen.

Een toename in de locomotorische activiteit was duidelijk na een enkele acute injectie van cocaïne. In deze coronale doorsnede markeren dikke witte lijnen de locatie van de sneden die zijn gemaakt om de grenzen van de nucleus accumbens te definiëren. Tijdens de dissectie tonen de amplificatiecurven van primers gericht tegen CFO's en phos B aan dat de primerparen hun doeltranscript amplificeren met een efficiëntie van ongeveer 100%.

In elke cyclus laten de resultaten zien dat de door cocaïne geïnduceerde expressie van CFO's en phos B in de nucleus accumbens het hoogst was één en twee uur na blootstelling. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals next-generation sequencing, worden uitgevoerd om nieuwe, niet-gekarakteriseerde transcripten te identificeren.