Uitgebreide analyse van de transcriptie van Brain Dynamics Monsters Na Behavioral Experience
August 26th, 2014
Dit manuscript beschrijft een protocol dat een uitgebreid profiel toepast voor de analyse van transcriptionele programma's die worden geïnduceerd in specifieke hersenkernen van knaagdieren na gedragsparadigma's. Hierin wordt deze aanpak geïllustreerd in de context van het profileren van genen die worden geïnduceerd in de nucleus accumbens (NAc) van muizen na acute cocaïne-blootstelling, met behulp van microfluïdische qPCR-arrays.
Het algemene doel van het volgende experiment is om transcriptionele dynamica en gedefinieerde hersenkernen van muizen te bestuderen na gedragservaring. Dit wordt bereikt door de dieren eerst te habitueren en hun locomotorische activiteit na injectie van fysiologische zoutoplossing te registreren. Eenmaal gehabitueerd, wordt de locomotorische activiteit geregistreerd na een enkele dosis cocaïne, waarna monsters uit de nucleus accumbens worden verzameld en gebruikt voor RNA-isolatie en cDNA-voorbereiding.
Vervolgens wordt QPCR-analyse uitgevoerd om genexpressie geïnduceerd door gedrag te bestuderen. Uiteindelijk worden resultaten verkregen die transcriptionele dynamica na cocaïnervaring tonen. Het protocol wordt gedemonstreerd door Dr. Hatu, de labmanager, Dum Muer, een afgestudeerde student uit het lab en Duran, een student uit het lab, gedurende drie opeenvolgende dagen. Elke muis wordt gehabitueerd aan de hanterings- en injectieprocedures, en muizen worden in kooien georganiseerd voordat het experiment begint, zodat muizen niet meer tussen kooien worden overgeplaatst en muizen nooit voor langere tijd geïsoleerd worden achtergelaten.
30 minuten voor het begin van de test moeten alle testkooien in de gedragsruimte worden gebracht om de dieren te laten wennen aan de omgeving. Direct na de injectie een intraperitoneale injectie van 250 microliter fysiologische zoutoplossing toedienen, de muis in een gedragskamer plaatsen om de locomotorische activiteit 15 minuten lang te monitoren. De muis kan 20 minuten in de gedragskamer worden geplaatst.
Een activiteit wordt gemonitord vanaf minuut twee tot 17. Herhaal deze stappen op hetzelfde tijdstip van de dag gedurende de volgende twee dagen. Op de vierde dag een enkele injectie van cocaïne of fysiologische zoutoplossing toedienen, afhankelijk van de groep, en de muis onmiddellijk in de kamer plaatsen om de lokale motorische activiteit 20 minuten bij geselecteerde tijdstippen na cocaïne-blootstelling te monitoren, de hersenen verwijderen en in ijskou, A CSF-oplossing plaatsen voor een tot twee minuten om af te koelen en te verharden.
Na het verwijderen van het cerebellum en het wegvegen van overtollig vocht, lijmt u de hersenen op het platform van een vibram met de rostrale partij naar boven. Vul de kamer met ijskou A CSF en snijd 200 micrometer secties totdat de nucleus accumbens duidelijk wordt geïdentificeerd. Let goed op de vorm van het corpus callosum, de locatie en vorm van de voorste commissure en de ventrikels tijdens het snijden.
Zodra het juiste gebied is geïdentificeerd, snijdt u twee secties van 400 micrometer waaruit de nucleus accumbens onder een stereoscoop wordt gedissecteerd. Gebruik een fijn mes om de nucleus accumbens van de secties te dissecteren. Vier snelle passen van het mes in het juiste gebied moeten het juiste weefsel onmiddellijk isoleren.
Plaats het geïsoleerde weefsel in 900 microliter lysisreagens en bewaar het bij minuus 80 graden Celsius tot RNA-extractie om te beginnen met het ontdooien van de buisjes bij 37 graden Celsius en homogeniseren. Gebruik een naald van 25 gauge, de eerste paar rondes kunnen moeilijk zijn en vereisen dat het weefsel tegen de wand van de buis wordt geduwd om het in kleine stukjes te homogeniseren. Om een goede homogenisatie te garanderen, pipetteer het lysate op een kaya shredder mini spin column en centrifugeer.
Pipetteer het lysate in een nieuwe microcentrifugebuis en extract het RNA volgens de instructies van de fabrikant. Na RNA-zuivering wordt reverse transcriptie naar cDNA uitgevoerd, evenals doelspecifieke preem-amplificatie van de monsters met primers gericht tegen de groep genen die voor analyse zijn gekozen. Deze procedures worden beschreven in de tekstversie van het protocol.
Commerciële microfluïdische chips voor uitgebreide QPCR-analyse zijn verkrijgbaar in 48 bij 48. formaat, waardoor analyse van 48 monsters met 48 sondesets mogelijk is, of in een 96 bij 96-formaat waarin 96 monsters worden geanalyseerd met 96 sondes. In de meeste gevallen hangt de keuze van de chip voornamelijk af van het aantal geanalyseerde monsters.
Bereid eerst de monstermix voor volgens de voor het experiment gekozen chip. Wees voorzichtig bij het pipetteren van het 20 XDNA-bindende kleurstof monsterlaadreagens. Roer de oplossingen van de monstermix minimaal 20 seconden en centrifugeer gedurende ten minste 30 seconden.
Bereide reacties kunnen voor korte tijd bij vier graden Celsius worden bewaard totdat de chip klaar is om te laden. Bereid vervolgens de testmix voor, roer de monstermix grondig en centrifugeer om alle componenten naar beneden te draaien. Zoals eerder is getoond, heeft de dynamische array IFC-chip inlaten voor monsters en tests, evenals gespecificeerde inlaten voor controlevloeistof die wordt gebruikt om de microfluïdische kamers onder druk te zetten.
Injecteer eerst controlevloeistof in elke accumulator op de chip. Prime vervolgens de chip door deze in de IFC-controller te plaatsen en het juiste script uit te voeren. Wanneer het script is voltooid, verwijdert u de geprimede chip uit de IFC-controller en pipet 5 microliter van elke test.
Meng op de chip. Voeg vijf microliter van elk monstermengsel toe aan hun inlaten en plaats de chip terug in de IFC-controller met behulp van de IFC-controllersoftware. Voer het script uit om de monsters en tests in de chip te laden.
Wanneer het laadmixscript is voltooid, verwijdert u de geladen chip uit de IFC-controller. Laad vervolgens de chip op de thermische cycler en maak een nieuwe chiprun die een smeltcurve-analyse omvat. Gebruik de thermische cycler software om ervoor te zorgen dat de reactiekamers correct worden herkend en laat de reactie tot voltooiing lopen.
Na een enkele acute cocaïne-injectie was een toename van locomotorische activiteit duidelijk zichtbaar. In deze coronale sectie markeerden dikke witte lijnen de locatie van sneden die werden gemaakt om de grenzen van de nucleus accumbens te definiëren. Tijdens de dissectie tonen de amplificatiecurven van primers gericht tegen CFO's en phos B aan dat de primerparen hun doeltranscript met ongeveer 100% efficiëntie versterken.
In elke cyclus laten de resultaten zien dat cocaïne-geïnduceerde expressie van CFO's en phos B in de nucleus accumbens het
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit manuscript beschrijft een protocol voor het analyseren van transcriptionele programma's in specifieke hersenkernen van knaagdieren na gedragsparadigma's. De aanpak wordt geïllustreerd door het profileren van genen die worden geïnduceerd in de nucleus accumbens (NAc) van muizen na acute cocaïne-blootstelling.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Gedragsanalyse
- Gene expressie profilering
Achtergrond
- Transcriptionele dynamica is cruciaal voor het begrijpen van hersenreacties op gedrag.
- De nucleus accumbens is een sleutelregio betrokken bij beloning en verslaving.
- Cocaïne-blootstelling verandert genexpressie in de hersenen.
- Microfluidische qPCR arrays staan gedetailleerd genprofilering toe.
Doel van het onderzoek
- Om transcriptionele veranderingen in de nucleus accumbens na cocaïne-blootstelling te bestuderen.
- Om een protocol voor RNA-isolatie en genexpressie-analyse vast te stellen.
- Om de gedragsimpact op genexpressie bij knaagdieren te begrijpen.
Gebruikte methoden
- Habituatie van muizen aan hantering en fysiologische zoutoplossing-injectie.
- Registratie van locomotieve activiteit na cocaïne-toediening.
- Verzameling van nucleus accumbens-monsters voor RNA-isolatie.
- QPCR-analyse om genexpressieveranderingen te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Transcriptionele dynamica werden waargenomen na cocaïne-blootstelling.
- Specifieke genen werden geïdentificeerd als geïnduceerd in de NAc.
- Het protocol toonde effectieve profilering van genexpressie.
- Resultaten dragen bij aan het begrijpen van de moleculaire basis van verslaving.
Conclusies
- Het onderzoek biedt een robuust protocol voor het analyseren van genexpressie in reactie op gedragsstimuli.
- Bevindingen vergroten de kennis van transcriptionele reacties in verslavingsonderzoek.
- Deze aanpak kan worden toegepast op andere gedragsparadigma's in de neurowetenschap.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to quantitatively assess transcriptional dynamics in defined brain regions following behavioral or pharmacological perturbations, supporting target validation in neuropsychiatric drug discovery. By providing reproducible, quantitative gene expression readouts from limited tissue samples, it enhances predictive confidence in early-stage mechanistic studies and informs go/no-go decisions for CNS-targeted therapeutics. The approach is particularly valuable for de-risking hypotheses related to addiction, reward pathways, and behavioral phenotypes prior to investment in lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional programs in nucleus accumbens to validate functional relevance of genes implicated in cocaine-induced behavioral responses.
- Operational Value: Supports robust target hypothesis testing using microfluidic qPCR to quantify gene expression changes with high sensitivity from limited brain tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream screening by establishing baseline transcriptional profiles following acute pharmacological challenge.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through standardized RNA isolation, reverse transcription, and microfluidic qPCR workflows applicable across multiple samples.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant transcriptional readouts in a well-established model of psychostimulant response, supporting biomarker alignment and mechanistic de-risking.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by delivering quantitative, multiplexed gene expression data suitable for cross-platform confirmation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven target validation and assay development prior to lead identification efforts in CNS drug discovery programs.
- Discovery Biology: Enables mechanistic interrogation of transcriptional dynamics following behavioral experience, supporting pathway clarification and target de-risking.
- Screening: Generates quantitative, multiplexed outputs that support assay readiness and reproducibility for compound screening campaigns.
- Analytics: Delivers normalized gene expression measurements from microfluidic qPCR arrays, enabling statistical comparison across experimental conditions and time points.
- Translational Research: Connects acute behavioral responses to molecular signatures in reward circuitry, supporting translational validity in addiction models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable transcriptional profiling platform applicable across diverse behavioral paradigms and pharmacological challenges in neuroscience research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking behavioral phenotypes to defined transcriptional responses in key brain regions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of gene expression analysis through standardized microfluidic qPCR protocols suitable for multi-sample processing.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of CNS targets through mechanistic insight before costly lead optimization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets by providing quantitative evidence of pathway engagement following pharmacological challenge.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroscience techniques including behavioral testing, brain dissection, and RNA handling.
- Depends on access to microfluidic qPCR platforms and associated instrumentation for high-throughput gene profiling.
- Necessitates standardized protocols for sample collection, RNA isolation, and cDNA synthesis to ensure cross-experiment consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different brain regions, species, or behavioral paradigms beyond cocaine-induced nucleus accumbens responses.
- Practical limitations include tissue yield constraints from small brain nuclei and the need for careful normalization to account for sample variability.
