Name: Uitgebreide analyse van de transcriptie van Brain Dynamics Monsters Na Behavioral Experience (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Ontdek transcriptieanalyse in de nucleus accumbens van muizen na cocaïne-expositie met behulp van qPCR. Deze methode ondersteunt verslavingsonderzoek door gedragsgerelateerde genexpressie te meten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk is gefinancierd door de Israel Science Foundation Grant (ISF # 393/12), Israel Centers of Research Excellence Grant (I-CORE 1796/12), German-Israel Foundation Grant (GIF # 2299-2291.1/2011) en de Marie Curie Career Integration Grant (FP7-PEOPLE-2013-CIG #618201). De eerste stappen in het project werden gefinancierd door een AXA postdoctorale beurs aan AC. We danken de genereuze opstartfondsen van het Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences.
Kritisch lezen door leden van het Citri lab wordt zeer op prijs gesteld.

OPMERKING: Het protocol volgt het dier zorg richtlijnen van de Hebreeuwse Universiteit van Jeruzalem. 1 Bereiding van ACSF Solution <ol><li> Bereid ACSF oplossing zoals beschreven in Tabel 1. Voeg 1 L in DDH 2 O (&gt; 18 MQ zuiverheid), waardoor osmolariteit tot ~ 300 mOsm / L met geschikte toevoeging van water en NaCl. </li></ol> 2 Apparatuur en Room Set Up De apparatuur voor de monitoring van cocaïne geïnduceerde locomotorisch gedrag bestaat uit het gedrag van de kamers (50 x 45 cm) bedraad met een inwendige lichtbron, ventilator en een camera (of infrarood sensoren), en uitgerust met een inwendige perspex doos (30 x 30 cm) in waarbij de muizen vrij kunnen bewegen terwijl hun voortbeweging wordt bewaakt. De gedrags-testen moeten worden uitgevoerd tussen 1 uur na lichten op tot 1 uur vóór lichten uit, op een regelmatige licht / donker-cyclus. De dieren moeten consequent elke dag getraind worden op hetzelfde moment. <ol><li&gt; Sluit de camera of infrarood systeem om een ​​passend systeem voor de bewaking en het opnemen van het locomotorisch gedrag van de muizen. </li><li> Reinig de kamers na elk experiment met een ontsmettingsmiddel door muis, en / of geur verwijderen reagens om olfactorische cue vertekening te voorkomen en een goede ontsmetting. </li></ol> BELANGRIJK: Tijdens de behandeling van de muizen stil, rustig en voorzichtig. 3 Animal Voorbereiding <ol><li> Huis 5 C57BL6 mannelijke muizen (6-12 weken oud; ~ 25-35 gram gewicht) per kooi, in een kamer met een 12 uur licht / donker cyclus en vrije toegang tot voedsel en water, volgens de normen en eisen van de lokale Animal zorg begeleiding en protocollen Comite. Vóór de start van het experiment, wegen de muizen en meld de gegevens. Cocaïne wordt later toegediend overeenkomstig het gewicht van de muizen. </li><li> De overdracht van alle kooien met muizen in de gedrags-kamer 30 min voor aanvang van de eerste proef. </li><li> Gewennen allemuizen in het experiment Experimenter hanteren, injecties en toezicht bij het gedrag opstart. Dit wordt bereikt door 3 opeenvolgende dagelijkse intraperitoneale injecties van 250 pl zoutoplossing zoals hieronder beschreven. </li><li> Dien een intraperitoneale injectie van 250 ul zoutoplossing. Onmiddellijk na de injectie, plaatst u de muis in een gedrag kamer om de locomotorische activiteit te monitoren gedurende 15 minuten. Herhaal deze actie voor 3 opeenvolgende dagen, op hetzelfde tijdstip iedere dag. </li><li> Op de vierde dag, verdeel de muizen in twee groepen. Bereid een voorraadoplossing van cocaïne 2 mg / ml in zoutoplossing. Dien een enkele injectie van cocaïne-oplossing (uiteindelijke 20 mg / kg) aan de experimentele groep overeenkomstig het gewicht van de muis (bijvoorbeeld een muis 25 g - injecteer 250 pl, dat 30 g muis krijgt 300 pi). Dien zoutoplossing om de controlegroep. Onmiddellijk na de injectie, plaatst u de muis voor 20 min in een gedrag kamer voor monitoring van bewegingsactiviteit (typicbondgenoot, zijn de eerste 15 min gecontroleerd). </li><li> Na cocaïne injectie offeren de muizen op verschillende tijdstippen (0, 1, 2, 4, 8 en 24 uur na injectie). Belangrijker is, zorg ervoor dat referentie-muizen (0 tijdstip) elke injectie niet krijgt op deze dag. Door zijn betekenis, is het noodzakelijk om herhalingen van de referentiegroep omvatten. </li></ol> 4 Dissectie van de nucleus accumbens <ol><li> Verdoven van de muizen met isofluraan op het juiste moment na de cocaïne / zoutoplossing injectie. De isofluraan moet direct worden afgevoerd uit de kamer. Daarom moet de procedure worden uitgevoerd in een zuurkast. </li><li> Bewaken van de diepte van de anesthesie door het testen van de achterste voet reflex. Knijp de poot van een terugtrekking reactie van het dier te lokken. Een dier dat een reflex toont is niet een chirurgische anesthesieniveau en niet in staat om inslapen. </li><li> Extractie van de hersenen: <ol><li> Euthanaseren de muis door onthoofding. </li> &lt;li&gt; Verwijder de huid boven het midden van de schedel en snijd de schedel met een scherpe schaar. </li><li> Plaats de schaar op het punt waar het ruggenmerg komt de hersenen (foramen magnum) en maak twee zijdelingse sneden. </li><li> Vanaf hetzelfde punt, maak een lange sagittale versnijding in de pijlnaad. Bij het bereiken van de bulbus olfactorius, clip naar links en rechts. </li><li> Met een pincet, verwijder de schedel zorgvuldig, grijpen elke helft van de schedel stevig en trekken naar de kant, zorg ervoor dat u drukt op of schade aan de hersenen. </li><li> Verwijder de hersenen terwijl doorsnijden van het craniale zenuwen via een omgekeerde micro lepel spatel. </li></ol></li><li> Plaats de hersenen in een ijskoude ACSF oplossing voor 1-2 minuten om te relaxen en te verharden. </li><li> Verwijder de hersenen uit de ACSF, lont overtollig vocht met een papieren handdoek, maak een coronale snede tussen de kleine hersenen en de rest van de hersenen en lijm de hersenen, met de rostrale deel naar boven op de vibratome podium. </li><li> Het snijden van de NAC: <ol&gt; <li> Handhaaf ACSF oplossingen bij ijskoude temperaturen in het snijden kamer van de vibratome. Sectie bij 200 micrometer tot de nucleus accumbens (NAC) is duidelijk geïdentificeerd volgens de Paxinos en Franklin Mouse Brain Atlas (ongeveer 1,8 mm anterior naar Bregma, aandacht te besteden aan de vorm van het corpus callosum, de ligging en de vorm van de voorste commissuur en de ventrikels, en de totale morfologie van de hersenpreparaat). Op dit moment maken twee 400 urn secties, waarvan de NAC wordt ontleed. </li><li> Onder een stereoscoop, gebruik een fijne tanden om de NAC gebied ontleden uit de plakjes. De definitie van de NAC is volgens de Paxinos en Franklin muizenhersenen atlas, en kon gemakkelijk in de juiste vakken worden doorsneden door vier snelle passes van het blad op het weefsel. (Figuur 2). </li><li> Plaats NAC secties direct in 900 ul Trizol lysisreagens in een microcentrifugebuis en bewaar bij -80 ° C tot RNA extractie. </li></ol></li></ol> 5 RNA-extractie en cDNA reverse transcriptie <ol><li> Ontdooi de buizen die nucleus accumbens gedeelten in Trizol lysis reagens bij kamertemperatuur en homogeniseer het lysaat met een 1 ml spuit verbonden 25 G naald totdat het weefsel volledig gehomogeniseerd (minstens 15-20 keer). De eerste paar ronden moeilijk, en vereist duwen het weefsel tegen de wand van de buis om het breken in kleine stukjes die de punt van de naald kon komen. </li><li> Om homogenisatie garanderen, pipet het lysaat in een Qiashredder mini centrifugekolom en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 1 minuut. </li><li> Pipet het lysaat in nieuwe microcentrifugebuis en pak het RNA volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar het RNA bij -80 ° C tot gebruik. </li><li> Meet de RNA-concentratie, analyseren de integriteit en de kwaliteit van het gebruik van een Bioanalyzer of gelijkwaardige apparatuur. Gebruik 100-500 ng RNA voor elke ronde van cDNA voorbereiding met random hexameerprimers. </li></ol> 6 Primer Ontwerp en Primer testen <ol><li> Het kiezen van goede primers: Voor een optimale primer paar voor qPCR van mRNA-transcripten, volgt u deze eisen (Figuur 3): <ol><li> Ontwerp van primers die niet meer dan 17-28 basen. Vermijd nucleotide herhalingen als ze bevorderen mispriming. </li><li> Ontwerp primers met smelttemperatuur (Tm) tussen 56-68 ° C (optimaal 60-64 ° C). De T m in het primerpaar moet binnen 1 ° C van elkaar. </li><li> Wees ervan bewust dat het product grootte idealiter zou moeten zijn tussen de 80 en 150bp. </li><li> Zorg ervoor dat ten minste een van de primers omvat een exon-exon junctie of de amplicon bevat een groot intron (intron-spanning), amplificatie van genomisch DNA te vermijden verontreinigingen. </li><li> Gebruik een betrouwbare software gebaseerd op Primer3 (voor voorbeelden zie tabel 2) om de primer ontwerp te verbeteren. </li></ol></li><li> Het testen van de prIMERS: Om de specificiteit en efficiëntie van de primers dient een controle qPCR reactie worden uitgevoerd: <ol><li> Gebruik een positief monster (met cDNA template voor alle relevante primer paren) en titreer de cDNA (bijvoorbeeld acht drie-voudige verdunningen van een initiële concentratie van ~ 10 ng) in tweevoud parallel reacties. Onder meer een no-template controle, die controleert op besmetting binnen de voor de reactie oplossingen. </li><li> Bereken primer efficiëntie met de formule: (10 (- 1 / helling) -1) x 100, zodat de curve van de optimale helling - 3,333 (ie 10 (- 1 / 3,333) = 2) (figuur 4). </li><li> Bepaal de specificiteit van de versterking. Specifieke amplificatie wordt aangetoond door een prominente piek bij al deze smeltcurven van de geamplificeerde producten, terwijl off-target amplificatie als een duidelijke afwijking fr lijktOM de enkele grote piek. </li></ol></li></ol> 7 qPCR Analyse <ol><li> Voorversterking: <ol><li> Uitgebreide qPCR analyse is gebaseerd op parallelle opvragen beperken hoeveelheden RNA met een groot aantal primerparen. Daarom is een stap van pre-amplificatie is essentieel. In deze stap, de cDNA ondergaat 14-18 cycli van pre-amplificatie met een mengsel van de primers die worden gebruikt voor het opvragen van het monster in de toekomst (tot 800 primerparen). </li><li> Verdun alle primers in TE (laag EDTA) aan 50 uM voor specifieke Target Amplification (STA). </li><li> Pool samen 1 pi aliquots van alle 50 uM primer sets worden opgenomen in de STA reactie tot 800 assays. </li><li> Bereid voormengsel en monsters voor STA zoals beschreven in Tabel 3. Zijn toegestaan ​​voor vergist bereiden mix voor 110% van het aantal monsters dat moet worden geamplificeerd. </li><li> Aliquot 3.75 ul STA pre-mix voor elk monster. Voeg 1,25 picDNA aan elk. </li><li> Vortex de reacties en centrifuge meng gedurende 10 sec. </li><li> Plaats de STA reacties in een PCR-apparaat en de cyclus, zoals aangegeven in tabel 4. </li></ol></li><li> Exonuclease I (ExoI) behandeling: <ol><li> Verdun het Exo I zoals aangegeven in tabel 5. </li><li> Voeg 2 pi van verdunde ExoI (4 U / pl) aan elke 5 ul STA reactie, vortex, spin down (&gt; 6.000 xg) en plaats in een PCR-apparaat bij 37 ° C gedurende 30 minuten en vervolgens bij 80 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Verdun de eindproducten tot een geschikte concentratie te testen. Gebruik TE buffer (voeg 43 ul TE-buffer om de 7 pl monster TSA). </li><li> Bewaar de verdunde STA producten bij -20 ° C of onmiddellijk te gebruiken. </li></ol></li><li> Primer en monster setup voor qPCR: <ol><li> Bereid monsters getoond in Tabel 6. Bereid mix volgens de bij dit experiment chip en samples toevoegen nodig. </li><li> Agitate Sample Mix oplossingen minimaal 20 seconden en centrifugeer (&gt; 6000 xg) gedurende ten minste 30 sec. Bereide reacties kunnen worden opgeslagen korte perioden bij 4 ° C totdat de chip kunt leggen. </li><li> Bereid de testen zoals beschreven in Tabel 7. </li><li> Schud het Assay Mix minimaal 20 seconden en centrifugeer (&gt; 6000 xg) gedurende ten minste 30 seconden te spinnen neer alle componenten. BELANGRIJK: Vortex grondig en centrifuge alle monster en test oplossingen voor pipetteren in de chip inhammen. Doet u dit niet kan leiden tot een afname van de kwaliteit van de gegevens. OPMERKING: De eindconcentratie van elke primer 5 uM in de inlaat en 500 nM in de uiteindelijke reactie. </li></ol></li><li> Priming en laden Dynamic Array IFC (geïntegreerd fluïdumkringloop) chip. De IFC chip heeft inlaten voor monstername, testen, alsmede met specifieke inlaten (accumulatoren) voor stuurleiding vloeistof (minerale olie) gebruikt om de microfluïdische kamers druk (Figure 4A). <ol><li> Injecteer bedieningsleiding fluïdum in elke accumulator op de chip. </li><li> Verwijder de blauwe beschermfolie ontdoen van de bodem van de chip. </li><li> Plaats de chip in de juiste IFC controller (controller MX voor 48.48 Dynamic Array IFC of de IFC controller HX voor 96.96 Dynamic Array IFC), voer de Prime (113x) script voor de 48.48 Dynamic Array IFC of de Prime (136x) script voor de 96.96 Dynamic Array IFC om prime de chip. </li><li> Wanneer het script klaar is, verwijder het gegronde chip van de IFC-controller. </li><li> Pipet 5 pi van elke Assay Mix en 5 ul van elk monster Mix in hun inlaten. </li><li> Breng de chip naar de IFC-controller. </li><li> Met behulp van de IFC-controller software, voert u de Load Mix (113x) script voor de 48.48 Dynamic Array IFC) of Load Mix (136x) script voor de 96.96 Dynamic Array IFC aan de monsters en analyses te laden in de chip. Wanneer de belasting Mix script klaar is, verwijder de belastinged chip van de IFC-controller. </li><li> Laad de chip op het PCR-apparaat, maakt u een nieuwe chip run (volgens de fabrikant richtlijnen), met inbegrip van smeltcurveanalyse. Met behulp van de PCR-apparaat software, ervoor te zorgen dat de reactiekamers behoren worden erkend, en laat de reactie uit te voeren naar de voltooiing. </li></ol></li></ol> 8 Data Analysis <ol><li> Kwaliteitsborging: Om de kwaliteit van gegevens te waarborgen, controleert de kwaliteit van de primers door het aanpakken verdunningskrommes (zoals hierboven beschreven). Controleer de specificiteit van amplificatie door het bekijken van de smeltcurven van amplicons, de pieken waarvan er optimaal goed uitgelijnd 29. </li><li> Visualisatie: Voor visualisatie van grote hoeveelheden data obtained by high-throughput qPCR gebruik door programmatuur gegenereerde heatmaps, waarbij expressie kleurcode van intensiteit. Daarnaast tonen de transcriptie dynamiek van enkele genen als bekleed puntgrafieken. </li><li> Publicatie: In het publicerende resultaten genexpressie, is het aangeraden om de MiQE richtlijnen volgen voor de publicatie van kwantitatieve real-time PCR-experimenten, waarin de minimale informatie die moet worden opgegeven voor een qPCR experiment om de relevantie, nauwkeurigheid, juiste interpretatie, en reproduceerbaarheid te waarborgen. </li></ol>

<ol><li>Amit, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+module+of+negative+feedback+regulators+defines+growth+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">A module of negative feedback regulators defines growth factor signaling.</a> Nature genetics. 39, 503-512 (2007).</li>
<li>Citri, A., Yarden, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF-ERBB+signalling%3A+towards+the+systems+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">EGF-ERBB signalling: towards the systems level.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 7, 505-516 (2006).</li>
<li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).</li>
<li>Kleim, J. A., Jones, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+experience-dependent+neural+plasticity%3A+implications+for+rehabilitation+after+brain+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+speech%2C+language%2C+and+hearing+research%22%5BJournal%5D)">Principles of experience-dependent neural plasticity: implications for rehabilitation after brain damage.</a> Journal of speech, language, and hearing research. 51, S225-S239 (2008).</li>
<li>Kauer, J. A., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+and+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity and addiction.</a> Nature reviews. Neuroscience. 8, 844-858 (2007).</li>
<li>Grueter, B. A., Rothwell, P. E., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+synaptic+plasticity+and+striatal+circuit+function+in+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Integrating synaptic plasticity and striatal circuit function in addiction.</a> Current opinion in neurobiology. 22, 545-551 (2012).</li>
<li>Robinson, T. E., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+associated+with+exposure+to+drugs+of+abuse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity associated with exposure to drugs of abuse.</a> Neuropharmacology. 47, Suppl 1. 33-46 (2004).</li>
<li>Koob, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiological+mechanisms+in+the+transition+from+drug+use+to+drug+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+biobehavioral+reviews%22%5BJournal%5D)">Neurobiological mechanisms in the transition from drug use to drug dependence.</a> Neuroscience and biobehavioral reviews. 27, 739-749 (2004).</li>
<li>Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+mechanisms+of+addiction%3A+the+role+of+reward-related+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory.</a> Annual review of neuroscience. 29, 565-598 (2006).</li>
<li>Beurrier, C., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+inhibition+of+synaptic+transmission+by+dopamine+in+the+nucleus+accumbens+during+behavioral+sensitization+to+cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enhanced inhibition of synaptic transmission by dopamine in the nucleus accumbens during behavioral sensitization to cocaine.</a> The Journal of neuroscience. 22, 5817-5822 (2002).</li>
<li>Robinson, T. E., Berridge, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+psychology+and+neurobiology+of+addiction%3A+an+incentive-sensitization+view%5BTitle%5D)+AND+%22Addiction%22%5BJournal%5D)">The psychology and neurobiology of addiction: an incentive-sensitization view.</a> Addiction. 95, Suppl 2. S91-S117 (2000).</li>
<li>Boening, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+an+addiction+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neural+transmission%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of an addiction memory.</a> Journal of neural transmission. 108, 755-765 (2001).</li>
<li>Everitt, B. J., Robbins, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+systems+of+reinforcement+for+drug+addiction%3A+from+actions+to+habits+to+compulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural systems of reinforcement for drug addiction: from actions to habits to compulsion.</a> Nature neuroscience. 8, 1481-1489 (2005).</li>
<li>Volkow, N. D., Fowler, J. S., Wang, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+addicted+human+brain%3A+insights+from+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">The addicted human brain: insights from imaging studies.</a> The Journal of clinical investigation. 111, 1444-1451 (2003).</li>
<li>Carlezon, W. A. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cocaine+reward+by+CREB%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of cocaine reward by CREB.</a> Science. 282, 2272-2275 (1998).</li>
<li>Hope, B., Kosofsky, B., Hyman, S. E., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+immediate+early+gene+expression+and+AP-1+binding+in+the+rat+nucleus+accumbens+by+chronic+cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Regulation of immediate early gene expression and AP-1 binding in the rat nucleus accumbens by chronic cocaine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5764-5768 (1992).</li>
<li>Hope, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+long-lasting+AP-1+complex+composed+of+altered+Fos-like+proteins+in+brain+by+chronic+cocaine+and+other+chronic+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Induction of a long-lasting AP-1 complex composed of altered Fos-like proteins in brain by chronic cocaine and other chronic treatments.</a> Neuron. 13, 1235-1244 (1994).</li>
<li>Pulipparacharuvil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+regulates+MEF2+to+control+synaptic+and+behavioral+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cocaine regulates MEF2 to control synaptic and behavioral plasticity.</a> Neuron. 59, 621-633 (2008).</li>
<li>Robison, A. J., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+epigenetic+mechanisms+of+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and epigenetic mechanisms of addiction.</a> Nature reviews. Neuroscience. 12, 623-637 (2011).</li>
<li>Hyman, S. E., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addiction+and+the+brain%3A+the+neurobiology+of+compulsion+and+its+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Addiction and the brain: the neurobiology of compulsion and its persistence.</a> Nature reviews. Neuroscience. 2, 695-703 (2001).</li>
<li>Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurobiology+of+cocaine+addiction.+Science+%26+practice+perspectives+%2F+a+publication+of+the%5BTitle%5D)+AND+%22National+Institute+on+Drug+Abuse%2C+National+Institutes+of+Health%22%5BJournal%5D)">The neurobiology of cocaine addiction. Science & practice perspectives / a publication of the.</a> National Institute on Drug Abuse, National Institutes of Health. 3, 4-10 (2005).</li>
<li>Robbins, T. W., Everitt, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobehavioural+mechanisms+of+reward+and+motivation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neurobehavioural mechanisms of reward and motivation.</a> Current opinion in neurobiology. 6, 228-236 (1996).</li>
<li>Kaplan, G. B., Moore, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+cognitive+enhancers+in+animal+models+of+fear+extinction%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology%2C+biochemistry%2C+and+behavior%22%5BJournal%5D)">The use of cognitive enhancers in animal models of fear extinction.</a> Pharmacology, biochemistry, and behavior. 99, 217-228 (2011).</li>
<li>Chauvet, C., Goldberg, S. R., Jaber, M., Solinas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+environmental+enrichment+on+the+incubation+of+cocaine+craving%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Effects of environmental enrichment on the incubation of cocaine craving.</a> Neuropharmacology. 63, 635-641 (2012).</li>
<li>Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enriched+environments%2C+experience-dependent+plasticity+and+disorders+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system.</a> Nature reviews. Neuroscience. 7, 697-709 (2006).</li>
<li>Silingardi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK+pathway+activation+bidirectionally+affects+visual+recognition+memory+and+synaptic+plasticity+in+the+perirhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+behavioral+neuroscience%22%5BJournal%5D)">ERK pathway activation bidirectionally affects visual recognition memory and synaptic plasticity in the perirhinal cortex.</a> Frontiers in behavioral neuroscience. 5, 84(2011).</li>
<li>Tropea, D., Majewska, A. K., Garcia, R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+synapses+in+vivo+correlate+with+functional+changes+during+experience-dependent+plasticity+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of synapses in vivo correlate with functional changes during experience-dependent plasticity in visual cortex.</a> The Journal of neuroscience. 30, 11086-11095 (2010).</li>
<li>Steketee, J. D., Kalivas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+wanting%3A+behavioral+sensitization+and+relapse+to+drug-seeking+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+reviews%22%5BJournal%5D)">Drug wanting: behavioral sensitization and relapse to drug-seeking behavior.</a> Pharmacological reviews. 63, 348-365 (2011).</li>
<li>Citri, A., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+qPCR+profiling+of+gene+expression+in+single+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells.</a> Nature protocols. 7, 118-127 (2012).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Succesvolle karakterisering van genexpressie van hersenweefsel na gedragsparadigma&#39;s hangt af van: 1) Een zorgvuldige behandeling van muizen tijdens de gedrags-paradigma; 2) Snelle en nauwkeurige dissectie van weefsel van belang; 3) RNA-veilige maatregelen om de integriteit van RNA waarborgen; en 4) zorgvuldige planning van primers en experimentele opmaak en precisie en aandacht voor detail voorbereiding van de qPCR analyse. Het doel van de procedure is de dynamiek van transcriptionele g...

Dynamische organisatie van de hersenen in staat stelt cognitieve en gedragsmatige flexibiliteit. Ervaringen worden gecodeerd door wijzigingen in de structuur en sterkte van verbindingen tussen neuronen in de hersenen 3. Deze &quot;ervaringsafhankelijke plasticiteit&quot; is het resultaat van inductie van specifieke patronen van genexpressie die de benodigde eiwitten voorziet modificatie van synaptische structuur en sterkte 4. De identificatie van gen-regulatorische netwerken via de vorming van lange-termijn geheugen is een van de kernelementen van de moleculaire neurowetenschappen, met de verwachting dat de identificatie van de dominante elementen van de transcriptie-programma inzicht zal geven in de fundamentele beginselen die vorming van het geheugen, maar ook doelen voor behandeling van neurodegeneratieve en neuropsychiatrische aandoeningen. Transcriptionele programma ontvouwen in temporeel gedefinieerde golven, die elk coderen voor genen van andere aard, die belangrijk zijn voor different momenten in de uitvoering van de resultaten van de signalering evenement 1,2. Het is daarom belangrijk om transcriptionele dynamiek richten op een uitgebreide tijdelijke tijdschema, teneinde de volledige complement van genen geïnduceerd identificeren en inzicht in de potentiële functie volgens de dynamiek van de inductie. Drugsverslaving is een robuuste vorm van ervaring-afhankelijke plasticiteit veroorzaakt door de langdurige effecten van drugs op de neurale circuits in de hersenen 5,6. Eerste, acute blootstelling aan middelen kan leiden tot de ontwikkeling van verslaving en de overgang naar chronisch gebruik. Contextuele informatie is een cruciaal element in de ontwikkeling van verslaving. Drugs geassocieerd omgevingsfactoren zijn groot belang toegekend in de hoofden van drugsgebruikers. Contextuele informatie herinneren een drugsgebruiker van verleden drugservaring kan terugval naar drugs verlangen opwekken, zelfs na lange periodes van onthouding van drugs blootstelling 7,8.Vandaar de grote klinische uitdaging in verslaving - de neiging van verslaafden om nog lang recidief na ontwenningsverschijnselen zijn verdwenen 9. Sensitisatie is een eenvoudig model van cocaïne ervaring nuttig voor de studie van de mechanismen van drugsverslaving. In deze breed bestudeerde model voor de langdurige sensibilisatie veroorzaakt door chronische blootstelling aan drugs worden knaagdieren eerst gewend aan saline injecties (intraperitoneaal, IP) in een nieuwe omgeving (open veld kamer waarin de locomotorische activiteit bewaakt) ; dan krijgen ze dagelijkse injecties van cocaïne in het open veld kamers terwijl hun activiteit bewaakt 10 (figuur 1). Deze gedrags paradigma resulteert typisch in een robuuste sensibilisatie van locomotorische gedrag (8-12 voudig boven uitgangswaarde activiteit) 11, die gedurende een periode van maanden na beëindiging van cocaïne injecties, waaruit de vorming van een pervasive geheugen sporen van drugs ervaring. De neurale circuits van de beloning, van nature betrokken bij het ​​versterken van het gedrag van essentieel belang voor het succes van een soort (bijvoorbeeld voeding, geslacht), wordt uitgebuit door drugs tot drugs geassocieerd gedrag 12,13 versterken. De moleculaire en cellulaire mechanismen die de ervaring van misbruik van drugs wordt versterkt lijken op de mechanismen die ten grondslag liggen aan de vorming van declaratieve of semantische herinneringen in andere hersenstructuren 14 te zijn. Daarom is de robuustheid van de sensitisatie model maakt het aantrekkelijk modelsysteem mechanismen ervaring plasticiteit onderzoeken. De nucleus accumbens (NAC) is een centrale integrator van de hersenen van de beloning circuits, en is uitgebreid in verband met de ontwikkeling van verslaving 5,6. De vorming van verslaving afhankelijk transcriptie van nieuwe eiwitten in de nucleus accumbens en robuustductie van duidelijk gestructureerde transcriptie programma&#39;s wordt waargenomen in de NAC volgende cocaïne ervaring 15-19. De acute transcriptionele respons op blootstelling aan cocaïne is waarschijnlijk om te functioneren op verschillende niveaus om aan te passen aan de sterke inductie stimulans en om de productie van nieuwe eiwitten die zijn verantwoordelijk voor de structurele en elektrofysiologische veranderingen geïnduceerd door blootstelling aan het geneesmiddel 6,19-22. Om de studie van moleculaire mechanismen ervaring plasticiteit van de hersenen te bevorderen, wordt een protocol beschreven voor de uitgebreide analyse van transcriptie dynamica in hersenweefsel monsters na gedragsbeïnvloeding. Het protocol wordt weergegeven in de context van de gedrags ervaring bestudeerd in de Citri lab - sensitisatie, gebruik microfluïdische dynamische arrays voor transcriptionele analyse. De beschreven protocol is uiteraard niet beperkt tot het bestuderen thij nucleus accumbens in de context van sensitisatie, maar kan worden toegepast op een groot aantal gedragsparadigma&#39;s en hersengebieden. In feite kan dit protocol worden toegepast lichaamsweefsels buiten de hersenen en diverse ondergaat of manipulaties van het organisme onderzocht. Het protocol is ruwweg verdeeld in vier stappen. In de eerste stap wordt het dier blootgesteld aan de gedrags paradigma; in de tweede stap het weefsel gemicrodissecteerde; in de derde stap - mRNA wordt gezuiverd, reverse getranscribeerd en gemerkt, en in de laatste stap de gegevens worden geanalyseerd. In de context van transcriptionele dynamiek bestuderen, de precieze timing en definitie van de ervaring zijn waarschijnlijk de belangrijkste experimentele parameters te controleren. Daarom onze gedragsmodel keuze is die van sensitisatie, een systeem dat hoge experimentator regelaar maakt over de parameters van de experience. Bijkomende gedrags-paradigma&#39;s die precieze timing en adressen te activeren verschillende modellen van ervaring-afhankelijke plasticiteit of vorming van het geheugen beschikbaar zijn. Deze modellen zijn voorzien van angst conditionering 23, acute kooiverrijking 24,25, nieuw object exploratie 26 en visuele ervaring volgende donkere opfok 27. Toch sensitisatie is een solide en samenhangend gedrags manipulatie, waardoor een sterk doordringende geheugen trace die duurt maanden na cocaïne ervaring 28. De hersenen is verdeeld, gevolgd door handmatige microdissectie van de nucleus accumbens. Het is onze ervaring dat handmatige microdissection van snel voorbereid hersenplakjes biedt de meest betrouwbare en snelle methode voor het extraheren van het weefsel aan de gedrags-paradigma relevant, en met ervaring, de grenzen van het weefsel zichtbaar worden en dat makkelijk te herkennen. Als alternatief zou fijne plakjes prepar zijned, gevolgd door laser-microdissectie. Hoewel deze methode maakt het mogelijk zeer gedefinieerde afbakening van de regio van belang, het is traag (en dus het risico van verlies van labiele mRNA), vervelend en vereist dure speciale apparatuur (een microscoop voorzien van een laser-capture setup). Het protocol hierin gedefinieerd kan ook worden aangepast om eencellige transcriptionele analyse handmatig aspiratie van cytoplasma visueel geïdentificeerde cellen middels patch pipetten 29. Het is belangrijk op te merken dat de beschreven protocol verschaft een populatiegemiddelde, terwijl het zeer waarschijnlijk dat in de meeste gevallen slechts een subpopulatie van de cellen in het weefsel daadwerkelijk betrokken als reactie op de ervaring. Het is van belang transcriptie profileren selectieve wijze vanuit specifieke celpopulaties reageren op de ervaring, maar bespreking van deze benaderingen is dan de huidige scope. Voor mRNA-zuivering, reverse-transcriptie en qPCR opvragen, het weefselwordt verstoord door het door fijne naalden, gevolgd door het gebruik van in de handel verkrijgbare kits (voor meer informatie, zie Tabel 8). De keuze wordt geïnformeerd door de ervaring met deze methodieken, die betrouwbare extractie van hoge kwaliteit RNA en robuuste resultaten van downstream-toepassingen te verzekeren. Terwijl het protocol beschreven voor high-throughput qPCR behulp dynamische arrays kunnen monsters worden gesondeerd genexpressie middels eindpunt PCR, low-throughput qPCR genexpressie microarrays of diepe sequencing. De voorkeur voor high-throughput qPCR behulp dynamische arrays komt door het feit dat mRNA verkregen hersenkernen volgende gedragsparadigma&#39;s vaak beperken hoeveelheden. Dynamische arrays bieden een platform dat efficiënte uitgebreide analyse van transcripten mogelijk maakt uit een groot aantal parallelle monsters in een enkel experiment. Na de eerste overname van de microfluïdische systeem (meestal een institutionele purchase), experimenten relatief lage bedrijfskosten. Naar aanleiding van deze analyse, kan verdere bevraging van de monsters worden uitgevoerd met behulp duurder platforms om te zoeken naar nieuwe transcripties (door microarrays of RNAseq) met de dynamische arrays bieden een uitgebreide referentie voor kwaliteitsborging. Tenslotte, voor gegevensanalyse, standaard benaderingen worden gebruikt. Specifieke aanwijzingen met betrekking tot problemen die zich kunnen voordoen zal in de tekst van het protocol worden besproken. Dit protocol is het meest geschikt voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in een grondig onderzoek van hun systeem van belang, het bestuderen van meerdere voorwaarden en herhalingen. Het protocol is ook het meest geschikt voor onderzoekers die reeds in zijn aangescherpt (door middel van microarray of RNAseq experimenten) op een subset van 50-500 genen van belang, dat ze geïnteresseerd zijn in herhaaldelijk bevragen.

<table><tbody><tr><td>Virusol</td><td>Oriek Medical</td><td>J29D</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP 100%</td><td>MINRAD INC</td><td>NDC 60307-110-25</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy plus Universal Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>73404</td><td></td></tr><tr><td>QIAshredder</td><td>QIAGEN</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>High Capacity cDNA Reverse Transcription kit</td><td>Invitrogen</td><td>AB-4368814</td><td></td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>1355656</td><td></td></tr><tr><td>Behavior Chamber (MDF; 50 x 45 cm)</td><td></td><td></td><td>Zelf geassembleerd</td></tr><tr><td>Inner Perspex box (30 x 30 cm)</td><td></td><td></td><td>Zelf geassembleerd</td></tr><tr><td>Camera and video recorder</td><td>Campden Inst.</td><td>CMD-80051</td><td></td></tr><tr><td>Media Recorder software</td><td>Noldus</td><td>NDS-NMR3-00M</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>FST</td><td>FST-14062-09</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden Inst.</td><td>7000SMZ-2</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>The Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1852048</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microspoon spatula</td><td>Bochem Instrument GmbH</td><td>3213</td><td></td></tr><tr><td>Biomark HD Reader</td><td>Fluidigm</td><td>BMHD-BMKHD</td><td></td></tr><tr><td>Dynamic array Chip for 96.96 gene expression</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td></td></tr></tbody></table>

uitgebreide analyse van de transcriptie van brain dynamics monsters na behavioral experience

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

De codering van de ervaringen in de hersenen en de consolidatie van de lange-termijn geheugen is afhankelijk van gen transcriptie. Het identificeren van de functie van specifieke genen in het coderen ervaring is een van de belangrijkste doelstellingen van de moleculaire neurowetenschappen. Bovendien is de functionele organisatie van bepaalde genen met specifieke gedragingen heeft implicaties voor het begrijpen van de basis van neuropsychiatrische aandoeningen. Inductie van robuuste transcriptie&#39;s waargenomen in de hersenen van muizen na verscheidene gedrags manipulaties. Terwijl sommige genetische elementen herhaaldelijk worden gebruikt volgende verschillende gedragsmatige manipulaties en in verschillende hersenkernen transcriptionele programma&#39;s algemeen uniek voor het inducerende prikkels en de structuur waarin ze worden bestudeerd 1,2. In deze publicatie wordt een protocol beschreven voor robuuste en uitgebreide transcriptie profilering van hersenkernen van muizen in reactie op gedrags-manipulatie. Hetprotocol wordt aangetoond in het kader van de analyse van genexpressie dynamiek in de nucleus accumbens na acute cocaïne bieden. Na een bepaalde in vivo ervaring, het doelwit zenuwweefsel wordt ontleed; gevolgd door RNA-zuivering, reverse transcriptie en het gebruik van microfluïdische arrays voor een uitgebreide analyse van qPCR meerdere target genen. Dit protocol is gericht uitgebreide analyse (adressering 50-500 genen) beperken hoeveelheden uitgangsmateriaal, zoals kleine hersenstalen of enkele cellen. Het protocol is het meest voordelig voor parallelle analyse van meerdere monsters (bijvoorbeeld enkele cellen, dynamische analyse na de farmaceutische, virale of gedragsproblemen verstoringen). Echter, kan het protocol ook dienen voor de karakterisering en de kwaliteitsborging van de monsters voorafgaand aan het hele genoom studies van microarrays of RNAseq, alsook de validering van gegevens die zijn verkregen uit het hele genoom studies.

De kwaliteit van de door die dit protocol results cruciaal hangt af van een aantal parameters. Een goede experimentele planning leidt tot minimale verstoring van de experimentele muizen, zodat de geteste ervaring (in dit voorbeeld, dat blootstelling aan cocaïne) de meest dominante ervaring in hun recente geschiedenis en derhalve resulteert in een sterke en specifieke transcriptionele programma. Figuur 1 beschrijft de experimentele plan voor sensitisatie, het definiëren van de tijdstippen volgende cocaïn...

Dit manuscript beschrijft een protocol dat een uitgebreid profiel toepast voor de analyse van transcriptionele programma's die worden geïnduceerd in specifieke hersenkernen van knaagdieren na gedragsparadigma's. Hierin wordt deze aanpak geïllustreerd in de context van het profileren van genen die worden geïnduceerd in de nucleus accumbens (NAc) van muizen na acute cocaïne-blootstelling, met behulp van microfluïdische qPCR-arrays.

Uitgebreide analyse van de transcriptie van Brain Dynamics Monsters Na Behavioral Experience

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de transcriptionele dynamiek en gedefinieerde hersenkernen van muizen na gedragsmatige ervaringen te bestuderen. Dit wordt bereikt door de dieren eerst te laten wennen en hun locomotorische activiteit na een zoutoplossingsinjectie te registreren. Zodra de gewenning is voltooid, wordt de locomotorische activiteit na een enkele dosis cocaïne geregistreerd, waarna monsters uit de nucleus accumbens worden verzameld en gebruikt voor RNA-isolatie en cDNA-preparatie.Vervolgens wordt een qPCR-analyse uitgevoerd om de door gedrag geïnduceerde genexpressie te bestuderen. Uiteindelijk worden resultaten verkregen die de transcriptionele dynamiek na blootstelling aan cocaïne laten zien. Het protocol zal gedurende drie opeenvolgende dagen worden gedemonstreerd door Dr. Hatu, de labmanager, Dum Muer, een promovendus uit het lab, en Duran, een bachelorstudent uit het lab. Elke muis wordt gewend aan de hanteer- en injectieprocedures; de muizen worden vóór de start van het experiment in kooien georganiseerd, zodat de muizen in de toekomst niet tussen kooien worden overgeplaatst en nooit gedurende een langere periode in isolatie worden gelaten.30 minuten voor aanvang van de tests moeten alle testkooien naar de gedragskamer worden verplaatst, zodat de dieren kunnen acclimatiseren aan de omgeving. Dien een intraperitoneale injectie van 250 microliters saline toe; plaats de muis direct na de injectie in een gedragskamer om de locomotorische activiteit gedurende 15 minuten te monitoren. De muis kan gedurende 20 minuten in de gedragskamer worden geplaatst.Een activiteit die wordt gemonitord van minuut twee tot 17. Herhaal deze stappen op hetzelfde tijdstip van de dag gedurende de volgende twee dagen. Dien op de vierde dag een enkele injectie cocaïne of zoutoplossing toe, afhankelijk van de groep, en plaats de muis onmiddellijk in de kamer om de lokale motorische activiteit gedurende 20 minuten te monitoren op geselecteerde tijdstippen na blootstelling aan cocaïne; neem vervolgens de hersenen uit en plaats deze gedurende één tot twee minuten in een ijskoude A CSF-oplossing om ze te koelen en te harden.Nadat het cerebellum is verwijderd en overtollig vocht is weggezogen, wordt het brein met het rostrale deel naar boven vastgelijmd op de tafel van een vibraatom. Vul de kamer met ijskoud A CSF en maak coupes van 200 micron totdat de nucleus accumbens duidelijk is geïdentificeerd. Let tijdens het snijden nauwkeurig op de vorm van het corpus callosum, de locatie en vorm van de commissura anterior en de ventrikels.Zodra de juiste regio is geïdentificeerd, worden twee secties van 400 microns gesneden waaruit de nucleus accumbens onder een stereoscoop zal worden gedisseceerd. Gebruik een fijn mesje om de nucleus accumbens uit de secties te disseceren. Vier snelle sneden met het mesje in het juiste gebied zouden het betreffende weefsel onmiddellijk moeten isoleren.Plaats het geïsoleerde weefsel in 900 µL lysereagens en bewaar dit bij -80 °C tot de RNA-extractie; begin met het ontdooien van de buisjes bij 37 °C en homogeniseer deze. Met behulp van een naald van 25 gauge kunnen de eerste paar rondes lastig zijn, waarbij het weefsel tegen de wand van het buisje moet worden gedrukt om het in kleine stukjes te homogeniseren. Om een goede homogenisatie te waarborgen, wordt het lysaat op een kaya shredder mini spin column gepipetteerd en gecentrifugeerd.Pipetteer het lysaat in een nieuwe microcentrifugebuis en extraheer het RNA volgens de instructies van de fabrikant. Na de RNA-zuivering wordt omgekeerde transcriptie naar cDNA uitgevoerd, evenals doelspecifieke pre-amplificatie van de monsters met primers gericht tegen de groep genen die voor de analyse is gekozen. Deze procedures worden beschreven in de tekstversie van het protocol.Commerciële microfluidische chips voor uitgebreide QPCR-analyse zijn verkrijgbaar in een 48 bij 48-formaat, waarmee 48 monsters met 48 probesets kunnen worden geanalyseerd, of in een 96 bij 96-formaat waarbij 96 monsters met 96 probes worden geanalyseerd. In de meeste gevallen hangt de keuze van de chip primair af van het aantal te analyseren monsters.Bereid eerst het monster mengsel voor op basis van de chip die voor het experiment is gekozen. Wees voorzichtig bij het pipetteren van het 20 XDNA-bindingskleurstof monsterlaadreagens. Agiteer de oplossingen van het monster mengsel gedurende minimaal 20 seconden en centrifugeer gedurende ten minste 30 seconden.Voorbereide reacties kunnen gedurende korte perioden worden bewaard bij 4 °C totdat de chip klaar is voor belading. Bereid vervolgens het assay-mengsel voor, schud het monster-mengsel grondig en centrifugeer om alle componenten naar beneden te brengen. Zoals eerder getoond, heeft de dynamic array IFC-chip inlaatopeningen voor monsters en assays, evenals specifieke inlaatopeningen voor de controlelijn-vloeistof die wordt gebruikt om de microfluïdische kamers onder druk te zetten.Injecteer eerst vloeistof voor de controlelijn in elke accumulator op de chip. Prime vervolgens de chip door deze in de IFC-controller te plaatsen en het bijbehorende script uit te voeren. Wanneer het script is voltooid, verwijdert u de geprimede chip uit de IFC-controller en pipetteert u 5 µL van elke assay.Meng op de chip. Voeg vijf µL van elk monster-mengsel toe aan de bijbehorende inlaatopeningen en plaats de chip terug in de IFC-controller met behulp van de IFC-controller-software. Voer het script uit om de monsters en assays in de chip te laden.Wanneer het script voor het laden van de mengsels is voltooid, verwijdert u de geladen chip uit de IFC-controller. Plaats de chip vervolgens in de thermocycler en start een nieuwe chip-run inclusief een smeltcurve-analyse. Controleer met de software van de thermocycler of de reactiekamers correct worden herkend en laat de reactie volledig doorlopen.Een toename in de locomotorische activiteit was duidelijk na een enkele acute injectie van cocaïne. In deze coronale doorsnede markeren dikke witte lijnen de locatie van de sneden die zijn gemaakt om de grenzen van de nucleus accumbens te definiëren. Tijdens de dissectie tonen de amplificatiecurven van primers gericht tegen CFO's en phos B aan dat de primerparen hun doeltranscript amplificeren met een efficiëntie van ongeveer 100%.In elke cyclus laten de resultaten zien dat de door cocaïne geïnduceerde expressie van CFO's en phos B in de nucleus accumbens het hoogst was één en twee uur na blootstelling. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals next-generation sequencing, worden uitgevoerd om nieuwe, niet-gekarakteriseerde transcripten te identificeren.

comprehensive-analysis-transcription-dynamics-from-brain-samples

Research

JoVE Journal

Behavior

Gedrag

Tot voor kort werden expressie studies over menselijke hersenen beperkt tot de kwantificering van RNA of eiwit. Met de chromatine immunoprecipitatie technieken beschreven in dit document, zal het mogelijk zijn om histon-methylatie en andere epigenetische regulatoren van genexpressie in postmortem hersenen kaart.

Een Chromatine Assay voor menselijk hersenweefsel

Een gestroomlijnde workflow om DNA-methylatie en expressie van genen veranderingen te bestuderen op de jeugd stress wordt weergegeven. Vanaf moeder scheiding van pasgeboren muizen en isolatie van discrete hersenweefsel vertegenwoordigen wij een protocol van DNA en RNA tegelijk isoleren van hersenweefsel ponsen voor latere bisulfiet sequencing en RT-PCR analyse.

Geoptimaliseerd Analyse van DNA-methylatie en Gene Expression uit kleine, anatomisch gedefinieerde gebieden van de hersenen

Het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de therapeutische effecten van diepe hersenstimulatie (DBS) chirurgie moet onderzocht worden. De methoden die in dit manuscript worden gepresenteerd, beschrijven een experimentele benadering om de cellulaire gebeurtenissen geactiveerd door DBS te onderzoeken door de genexpressieprofiel van kandidaatgenen te analyseren die neurogenese na DBS-chirurgie kunnen bevorderen.

Analyse van genexpressie Veranderingen in het Rat Hippocampus Na Deep Brain Stimulation van de Anterior Thalamic Nucleus

De identificatie van moleculen en routes die synaptische plasticiteit en geheugen beheersen, is nog steeds een grote uitdaging in de neurowetenschappen. Hier wordt een workflow beschreven die zich richt op de relatieve kwantificering van synaptische eiwitten die vermoedelijk betrokken zijn bij de moleculaire reorganisatie van synapsen tijdens het leren en het consolideren van geheugen in een auditief leerparadijm.

High Resolution Kwantitatieve Synaptic Proteome Profilering van Mouse Brain Regio Na Auditieve discriminatie Learning

Dit protocol beschrijft het combinatorische gebruik van ChIP-seq, 4sU-seq en totaal RNA-seq ribosoom profilering voor cellijnen en primaire cellen. Hierdoor wijzigingen bijhouden in transcriptiefactor bindend, DOVO transcriptie, RNA-verwerking, omzet en vertaling na verloop van tijd, en de algemene gang van zaken in geactiveerd en/of snel veranderende cellen weer te geven.

Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire

We beschrijven hier, het protocol en de uitvoering van Methyl-Seq, een epigenomic-platform, met behulp van een rat-model om epigenetische veranderingen die zijn gekoppeld aan chronische stress blootstelling te identificeren. Resultaten tonen aan dat de rat Methyl-Seq platform is voor het opsporen van methylation van verschillen die uit stress blootstelling bij ratten voortvloeien van.

Een Rat Methyl-Seq Platform om epigenetische veranderingen Associated with Stress Exposure te identificeren

We presenteren een methode die specifiek is afgestemd op het beeld van de hele hersenen van volwassen Drosophila tijdens gedrag en als reactie op stimuli. Het hoofd is gepositioneerd om optische toegang tot de hele hersenen mogelijk te maken, terwijl de vlieg zijn benen en de antennes kan bewegen, de punt van de proboscis en de ogen zintuiglijke stimuli kunnen ontvangen.

Volwassen Drosophila melanogaster voorbereiden op whole brain imaging tijdens gedrags- en stimulireacties

Dit protocol schetst het gebruik van een op maat ontworpen opnameapparaat en elektroden om lokale veldpotentialen vast te leggen en de informatiestroom in de hippocampus en prefrontale cortex van de muis te onderzoeken.

Dubbele extracellulaire opnames in de hippocampus en prefrontale cortex van de muis

Hier wordt een pijplijn voor video-analyse gepresenteerd die uitdagingen op het gebied van gedragsmonitoring binnen MRI-omgevingen overwint, waardoor niet-geïnstrueerde gedragsreacties op externe signalen kunnen worden gedetecteerd. Deze analyse zal een beter begrip van opgewekte interne toestandsveranderingen en hersenbrede activiteit vergemakkelijken.

Profilering van maternale gedragsreacties tijdens beeldvorming van de hele hersenen

Dit protocol biedt een geïntegreerd raamwerk op basis van geavanceerde computationele neuroethologische methoden om hersencodering in naturalistische contexten te begrijpen.

Het decoderen van natuurlijk gedrag vanuit neuro-ethologische inbedding

Dit artikel introduceert een protocol voor het gebruik van DeepSpaceDB, een dynamische, interactieve database voor ruimtelijke transcriptomics, die analyseworkflows en voorbeelden biedt om weefselorganisatie en ziektegerelateerde genexpressie te onderzoeken.

Mining Spatial Transcriptomics-datasets met behulp van DeepSpaceDB

Ontdek transcriptieanalyse in de nucleus accumbens van muizen na cocaïne-expositie met behulp van qPCR. Deze methode ondersteunt verslavingsonderzoek door gedragsgerelateerde genexpressie te meten.

Uitgebreide analyse van de transcriptie van Brain Dynamics Monsters Na Behavioral Experience

Meer video's verkennen