Name: Femorale beenmergaspiratie in levende muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Leer een niet-letale methode voor femorale beenmergaspiratie bij levende muizen. Dit protocol maakt seriële bemonstering mogelijk voor longitudinale hematopoëtische studies zonder dieren te offeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O.A.-W. wordt ondersteund door een NIH K08 Clinical Investigator Award (1K08CA160647-01), een U.S. Department of Defense Postdoctoral Fellow Award in Bone Marrow Failure Research (W81XWH-12-1-0041), het Josie Roberston Investigator Program en een Damon Runyon Clinical Investigator Award met ondersteuning van de Evan’s Foundation.

Alle dierlijke procedures beschreven in dit protocol werden uitgevoerd in overeenstemming met de Richtlijnen voor de Zorg en gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUCs) het Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. 1. Aspiratie van beenmerg (BM) cellen uit het dijbeen <ol><li> Verdoven van de muis die femorale beenmergaspiratie zal ondergaan met isofluraan (1-4%) toegediend met een precisie vaporizer. Diepte van de anesthesie moet worden gecontroleerd elke 5-10 min gedurende de procedure met de opmerking dat er geen verandering in de ademhalingsfrequentie in verband met chirurgische manipulatie en / of het oor, neus en staart knijpen. Anesthesie wordt geïnduceerd met isofluraan en ook gedurende de gehele procedure met isofluraan. Een preventieve pre-procedurele dosis buprenorfine in een dosis van 0,05-0,1 mg / kg subcutaan elke 6-12 uur kan worden gebruikt om pijn geassocieerd met de procedure als een bijvoeglijk voorkomenunct de Carprofen. </li><li> Breng oogzalf om de ogen van de muis na inductie van anesthesie drogen cornea voorkomen. </li><li> De vacht wordt zorgvuldig geknipt van een huidgebied ongeveer 150% groter dan het gebied van de beoogde aspiratie plaats. Losse haren wordt verwijderd met een vochtige gaasje. Houd de muis op een circulerende warm water pad of andere veilige thermostatisch oppervlak om onderkoeling tijdens de procedure te voorkomen. </li><li> Ontsmet de hele been met het dijbeen die aspiratie zal ondergaan met drie sets van afwisselend scrubs (afwisselend met ofwel een povidonjood (Betadine) of chloorhexidine (Nolvasan) scrub en 70% isopropylalcohol of 70% ethanol gedrenkt gaas sponzen). </li><li> Bevochtig een 0,5 ml tuberculinespuit (volume: 0.5 cc; gauge: 27,5 G) met steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) voor opzuigen van de BM. Vul de spuit met 200-500 pi PBS en onmiddellijk verdrijven de PBS. Herhaal deze procedure 2-3 tIMES. </li><li> Houd de tibia gebogen uit het dijbeen door op de tibia of de ringvinger of de vijfde vinger. Controleer of een geschikte verdoving vlak is bereikt. De spuit wordt gehouden met behulp van de duim en de wijsvinger. Hierdoor kan de condyli worden blootgesteld en vergemakkelijkt het inbrengen van de naald. </li><li> Na het bevochtigen van de injectiespuit en steek de naald door de patellapees, zodat de naald stevig tussen de twee knobbels van het femur wordt ingediend. Door met de diafyse nabij de epifyse van het dijbeen met de duim en de wijsvinger, wordt de naald in de schacht van de femur ingebracht gemakkelijk. </li><li> Draai de naald naar buiten en naar boven zodat deze evenwijdig met de as van het dijbeen is. Deze actie vergemakkelijkt het terugvinden van de inhoud beenmerg uit het dijbeen as. </li><li> Draai de naald met de klok mee en tegen de klok in terwijl u het langzaam in de femorale mergholte. Controleer de juiste plaatsing van de naald door zachtjes bewegen van de SYringe lateraal. </li><li> Trek de naald zuiger terug, het creëren van negatieve druk, terwijl het verplaatsen van de naald heen en weer in de BM holte. Opmerking: Het volume van BM aangezogen wordt ongeveer 5 pl die typisch overeenkomt met 0,4-0,8 x 10 6 mononucleaire cellen. Succesvolle aspiratie wordt visueel worden bevestigd door het verschijnen van bloed in de top van de naald in de basis van de injectiespuit. Indien geen bloed wordt gezien in de injectiespuit is het waarschijnlijk dat een kleine bot of weefsel fragment zit vast in de naald. Dit blijkt uit de naald verwijderd worden door het bewegen van de zuiger op en neer in PBS (dit is een reden waarom de spuit moet worden ingevuld met PBS voor het opzuigen van de BM). Als het weefsel niet kan worden verdreven uit de spuit, gebruik een nieuwe naald en spuit (weer nat de spuit met 200-500 pi PBS). </li><li> Zodra BM succes wordt opgezogen uit het dijbeen, verwijder de naald en spuit uit het dijbeen en de muis. </li><li> Verplaats aangezogen BM een microfugebuis prefilled met 500 ui PBS. Voor de meeste toepassingen de BM cellen moeten vervolgens op ijs bewaard totdat zij worden verwerkt indien mogelijk. </li><li> Na afronding van de procedure, beheren pijnstillende met carprofen 5 mg / kg subcutaan. Verwijder vervolgens de muis uit de narcose en plaats op een verwarmde pad tot volledig hersteld. LET OP: Er mag geen complicaties of ongerief na de aspiratie procedure indien goed uitgevoerd zijn. </li><li> Alvorens terug te keren muizen om de woonwijk, zodat ze in staat zijn om ambulate en bereiken voedsel en water. Let op de muizen voor tekenen van angst of een infectie na de procedure in de komende 24 uur. Symptomen zijn: constante bloeden, bloedarmoede, lusteloosheid. Als een van deze effecten optreedt na de procedure, moet het dier (en) worden gedood. Opmerking: BM aspiratie / bemonstering worden herhaald, maar de herhaalde procedure worden uitgevoerd aan de tegenoverliggende dijbeen herhaalde trauma aan hetzelfde been verhinderen. Er is weinig informatie beschikbaar over de frequency dat BM aspiratie kan worden uitgevoerd. Femorale beenmerg aspiratie wordt algemeen herhaald niet vaker dan om de 2 weken. </li></ol> 2. Beoordeling van Cellulaire Content in Aspirated BM cellen <ol><li> Pellet cellen afkomstig uit BM aspiratie en in een microcentrifugebuis door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C of kamertemperatuur. </li><li> Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in 500 ui van ACK rode bloedcellen lysis buffer (&quot;ammonium-chloride-kalium&quot; lysisbuffer). </li><li> Incubeer de cellen in erytrocyten lysis buffer gedurende 10 minuten en voeg 1 ml PBS en spin neer het mengsel opnieuw bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C of kamertemperatuur. Opmerking: De rode bloedcellen gelyseerd pellet bestaat nu uit BM mononucleaire cellen. Deze kunnen worden gesuspendeerd voor FACS kleuring, celtelling, transplantatie, Cytospin analyse en / of enig ander gebruik (zoals BM cellen geoogst uit muizen opgeofferd worden gebruikt). </li></ol>

<ol><li>Sundberg, R., Hodgson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspiration+of+bone+marrow+in+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Aspiration of bone marrow in laboratory animals.</a> Blood. 4, 557-561 (1949).</li>
<li>Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+technique+for+intrafemoral+injection+and+bone+marrow+sampling+in+mouse+transplant+models%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+lymphoma%22%5BJournal%5D)">Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models.</a> Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).</li>
<li>Warner, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+cooperating+genetic+events+in+the+leukemic+transformation+of+normal+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells.</a> Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).</li>
<li>Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-initiating+cells+in+human+T-lymphoblastic+leukemia+exhibit+glucocorticoid+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance.</a> Blood. 116, 5268-5279 (2010).</li>
<li>Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+isolation%2C+and+stimulation+of+quiescent+primitive+leukemic+progenitor+cells+from+patients+with+acute+myeloid+leukemia+%28AML%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML).</a> Blood. 101, 3142-3149 (2003).</li>
<li>Nolta, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gold+standard+improves%3A+a+better+assay+for+HSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The gold standard improves: a better assay for HSCs.</a> Blood. 106, 1141-1142 (2005).</li>
<li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121, 1109-1121 (2005).</li>
<li>Purton, L., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+factors+in+murine+hematopoietic+stem+cell+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays.</a> Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).</li>
<li>Dykstra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+propagation+of+distinct+hematopoietic+differentiation+programs+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo.</a> Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).</li>
<li>Jordan, C., Lemischka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+and+systemic+analysis+of+long-term+hematopoiesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse.</a> Genes & development. 4, 220-232 (1990).</li>
<li>Challen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnmt3a+is+essential+for+hematopoietic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation.</a> Nature genetics. 44, 23-31 (2012).</li>
<li>Hess, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+based+on+CD133+and+high+aldehyde+dehydrogenase+activity+isolates+long-term+reconstituting+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells.</a> Blood. 107, 2162-2169 (2006).</li>
<li>Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+myeloerythroid+repopulation+after+intrafemoral+transplantation+of+NOD-SCID+mice+reveals+a+new+class+of+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells.</a> Nat Med. 9, 959-963 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Serial BM aspiratie is een routine procedure kritisch naar klinisch onderzoek van hematologische aandoeningen bij de mens. De mogelijkheid om een ​​analoge seriële bemonstering van BM verrichten muizen voor karakterisatie van de cellulaire samenstelling en bestanddelen van BM gedurende langdurige experimenten is ook zeer waardevol. Deze procedure is bruikbaar voor karakterisering van HSPC&#39;s zonder dat de muis, maar ook om de aanwezigheid van andere celtypen in de BM in gevallen waarin de inhoud van het perifere bloe...

Alle bloedcellen zijn afgeleid van hematopoëtische stamcellen (HSC's). Procedures die toegang bieden tot het beenmerg (BM), de plaats waar de overgrote meerderheid van HSC's zich in muizen en mensen bevindt, zonder dat dieren geofferd hoeven te worden, bieden een middel om de bron van hematopoëse serieel te monitoren. Het algemene doel van de hier beschreven procedure is om een gedetailleerd protocol te bieden voor het bemonsteren van BM-cellen uit het dijbeen van levende muizen, wat materiaal levert dat representatief is voor de cellen die door conventionele oogst van BM-cellen door het offeren van de muizen zouden worden verkregen. Het voordeel van deze procedure boven conventionele oogst van BM-cellen is dat deze procedure het offeren van muizen niet vereist en daarom een longitudinaal onderzoek van het beenmergcompartiment van muizen in de loop van de tijd mogelijk maakt.
Hoewel deze murine beenmerg aspiratieprocedure in een aantal studies is gebruikt en eerder is beschreven (zie Sundberg et al. voor een historische review1), zijn formele stap-voor-stap procedures die deze techniek illustreren niet eerder gepubliceerd. Dit protocol maakt routinematige serieuze bemonstering van het BM mogelijk voor doeleinden zoals het beoordelen van aanplant in het BM van cellen die exogeen in de muis zijn geïntroduceerd (zoals bijvoorbeeld in xenograftstudies2,3), analyse van chimerisme in het BM ter vergelijking met dat van het perifere bloed (waar de resultaten niet noodzakelijk congruent zijn), het monitoren van de abundantie van specifieke celtypen die normaal verrijkt zijn in het beenmerg, zoals hematopoëtische stam- en voorlopercellen, en het verkrijgen van BM-cellen voor ex vivo cultuur en/of transplantatie. Bovendien kan evaluatie van beenmerginhoud zeer nuttig zijn in muismodellen van hematologische ziekten, aangezien aspiratie nuttig is bij het beoordelen van de belasting van hematologische ziekten op tijdstippen waarop de ziekte mogelijk niet in het perifere bloed is evident3-5. Bovendien kan deze techniek worden gebruikt om de respons van hematologische ziekten in het beenmerg op geneesmiddelen die in therapeutische studies worden toegediend, te evalueren. Dus, de hier beschreven procedure is ideaal voor onderzoekers die toegang willen krijgen tot hematopoëtische beenmergcellen van muizen voor cytologische analyse, flowcytometrische analyse, in vitro cultivering en/of in vivo transplantatiestudies zonder dat het offeren of schaden van de muizen vereist is.
Het protocol voor het bemonsteren van BM dat hier wordt beschreven, is vrij vergelijkbaar met de techniek die wordt gebruikt voor intra-femorale injectie van materiaal direct in de beenmergholte3,6. Het belangrijkste verschil is dat dit protocol de procedure voor het verwijderen van cellen uit het beenmerg beschrijft, in tegenstelling tot het direct inbrengen van materiaal in de beenmergholte, zoals bij intrafemorale injectie wordt gedaan.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>PAA</td><td>K41-001</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysis buffer</td><td>Homemade</td><td></td><td>in 1 L. Adjust pH 7.2 ~ 7.4 en filter steriel met 0.22 &mu;m vacuümfilter.</td></tr><tr><td>8.3 g Ammonium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>1 g Potassium bicarbonate</td><td>Fisher Scientific</td><td>P184-500</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;l 0.5 M EDTA pH 8</td><td>Gibco</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA</td><td>E15-842</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml Tuberculin syringe 27.5 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Sterile cell strainer 70 &mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Attane</td><td>NDC:66794-014-25</td><td></td></tr><tr><td>Blunt-end needle</td><td>Stemcell Technologies</td><td>28110</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide needle 23 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305193</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Syringe Luer-Lok tip</td><td>Becton Dickinson</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Non-tissue culture treated plate, 6 Well</td><td>Becton Dickinson</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>12 x 75 mm 5 ml tubes&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>352054</td><td>FACS staining</td></tr><tr><td>12 x 75 mm 5 ml tubes with cell-strainer cap</td><td>Becton Dickinson</td><td>352235</td><td>FACS staining</td></tr><tr><td>NK1.1 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>108723</td><td></td></tr><tr><td>CD11b APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>101225</td><td></td></tr><tr><td>CD45R (B220) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103223</td><td></td></tr><tr><td>CD3 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>100222</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>108423</td><td></td></tr><tr><td>Ter119 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>116223</td><td></td></tr><tr><td>CD19 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>302217</td><td></td></tr><tr><td>CD4 APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>317417</td><td></td></tr><tr><td>CD117 (c-KIT) PE</td><td>BioLegend</td><td>105808</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>122513</td><td></td></tr><tr><td>CD34 APC</td><td>Biolegend</td><td>128612</td><td></td></tr><tr><td>CD16/32 e450</td><td>eBioscience</td><td>48-0161-82</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32670</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434</td><td>STEMCELLTECHNOLOGIES</td><td>3434</td><td>Voor methocellulose cultuur</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Crescent Chemical Company</td><td>C11045850</td><td>1 dosis (5mg/kg)&nbsp;</td></tr><tr><td>Flow cytometer, LSRFortessa</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puralube vet ointment (sterile petrolatum ophthalmic ointment)</td><td>Dechra-US</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr></tbody></table>

femorale beenmergaspiratie in levende muizen

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Seriematige bemonstering van de cellulaire samenstelling van beenmerg (BM) is een routineprocedure die van cruciaal belang is voor klinische hematologie. Dit protocol beschrijft een gedetailleerde stap-voor-stap technische procedure voor een analoog proces bij levende muizen dat serielle karakterisering van cellen in het beenmerg mogelijk maakt. Deze procedure vergemakkelijkt studies die gericht zijn op het detecteren van de aanwezigheid van exogene toegediende cellen in het beenmerg van muizen, zoals bijvoorbeeld in xenotransplantatiestudies. Bovendien maakt deze procedure het mogelijk om cellen die verrijkt zijn in het beenmerg, zoals hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's) te verzamelen en karakteriseren zonder dat de muizen worden geofferd. Aangezien de cellulaire samenstelling van perifeer bloed niet noodzakelijkerwijs representatief is voor de verhoudingen en typen van stam- en voorlopercellen die in het beenmerg aanwezig zijn, zijn procedures die toegang bieden tot dit compartiment zonder dat de muizen geëuthanaseerd hoeven te worden, zeer nuttig. Het gebruik van aspiratie van het femur-beenmerg wordt hier geïllustreerd voor cytologische analyse van beenmergcellen, flowcytometrische karakterisering van het hematopoëtische stam/voorlopercellen compartiment, en cultivatie van gesorteerd HSPC's verkregen door aspiratie van het femur-beenmerg, vergeleken met conventionele beenmergwinning.

Femorale BM aspiratie van een live C57/B6 muis werd gebruikt om BM mononucleaire cellen gevolgd door conventionele BM oogst van dezelfde muis na offer te verkrijgen. BM verkregen door de twee werkwijzen mononucleaire cellen werden vervolgens geanalyseerd door (1) cytologische analyse van BM-cellen, (2) het bepalen van de relatieve frequentie van hematopoëtische stam / progenitorcellen (HSPCs), en (3) ex vivo kweken gesorteerde HSPCs. In het laatste experiment, afstammings-negatieve SCA1 + c-KIT werden + (STL) c...

Dit protocol beschrijft een procedure voor seriële bemonstering van femur beenmerg (BM) zonder dat muizen hiervoor worden geofferd. Deze procedure vergemakkelijkt longitudinale studies van de samenstelling van beenmerg van muizen in de loop van de tijd en biedt seriële toegang tot cellen binnen het beenmerg voor ex vivo en transplantatiestudies.

Femorale beenmergaspiratie in levende muizen

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Het algemene doel van deze procedure is om op veilige wijze de hematopoëtische cellen uit de mergholte van het dijbeen van een levende muis te aspireren. Dit wordt bereikt door eerst een tuberculinespuit te vullen met PBS. In de tweede stap wordt het achterpootje van de muis zorgvuldig in de optimale hoek geplaatst voor het onttrekken van het beenmerg.De hematopoëtische cellen worden vervolgens geaspireerd uit de mergruimte van het dijbeen en de rode bloedcellen worden verwijderd. Uiteindelijk kan de succesvolle aspiratie van de beenmerginhoud worden gevisualiseerd via flowcytometrische en cytologische analyses. De procedure zal worden gedemonstreerd door de jonge Rock Chung, een zeer getalenteerde technicus uit ons laboratorium.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals conventionele oogst van beenmerg, is dat deze techniek het mogelijk maakt een deel van de hematopoëtische cellen uit het beenmerg te verkrijgen terwijl het dier in leven blijft voor verdere observatie en seriële analyse. F, na bevestiging van de sedatie door een knijpprik in de teen, wordt er oogzalf aangebracht in de ogen van de geanestheseerde muis om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen en wordt het been geschoren om de huid bloot te leggen. De steriele chirurgische voorbereiding van de huid wordt vervolgens uitgevoerd door het gebied te scrubben met chloorhexidine-desinfectiemiddel, gevolgd door een alcoholswab.Dit proces wordt drie keer uitgevoerd, waarbij voor elk dier een nieuwe, ongeopende steriele spuit en naald worden gebruikt. Controleer of een passend anesthetisch vlak is bereikt. Bevochtig vervolgens een tuberculinespuit van 0,5 milliliter met steriele PBS en aspireer daarna onmiddellijk 200 tot 500 milliliters van de zoutoplossing twee tot drie keer om deze weer uit te stoten.Gebruik vervolgens een van de laatste twee vingers van één hand om het scheenbeen voorzichtig van het dijbeen af te buigen om de blootstelling van de condylaire ruimte van het dijbeen en de inbreng van de naald te vergemakkelijken. Voer de naald nu door de patellapees in, zodat deze stevig tussen de twee condylen van het dijbeen vastzit. Gebruik de duim en wijsvinger van de andere hand om de diafyse dicht bij de epifyse van het dijbeen vast te houden, zodat de naald gemakkelijk in de schacht van het bot kan worden ingebracht.Als er geen bloed in de spuit zichtbaar is, is de kans groot dat een klein bot- of weefselfragment in de naald vastzit. Dit kan uit de naald worden verwijderd door de zuiger in PBS op en neer te bewegen. Als het weefsel niet uit de spuit kan worden verwijderd, gebruik dan een nieuwe naald en spuit.Bevochtig de spuit opnieuw met 200 tot 500 µL PBS. Draai de naald vervolgens met de en tegen de klok in terwijl u deze tegen de condylaire ruimte duwt, zodat de naald parallel loopt aan de schacht van het femur. Dit is om het onttrekken van de beenmerginhoud uit de femurschacht te vergemakkelijken.Draai de naald met de en tegen de klok in terwijl u deze langzaam in de mergholte van het femur duwt. Bevestig de juiste positie van de naald door de spuit voorzichtig zijwaarts te bewegen. Trek vervolgens voorzichtig aan de zuiger van de naald om onderdruk te creëren, terwijl u de naald heen en weer beweegt in de mergholte.Een succesvolle aspiratie wordt bevestigd door de verschijning van bloed in de bovenkant van de naald aan de basis van de spuit. Zodra het beenmerg succesvol uit het dijbeen is geaspireerd, wordt de naald uit het bot verwijderd en wordt het geaspireerde beenmerg overgebracht naar een microcentrifugebuisje dat vooraf is gevuld met 500 µL PBS op ijs. Laat de muis, na toediening van het analgeticum, herstellen onder een warmtelamp voordat de muizen worden teruggebracht naar de huisvestingsruimte.Zorg ervoor dat ze in staat zijn om zich voort te bewegen en bij voedsel en water kunnen komen. Plaats de muis vervolgens terug in de kooi en observeer het dier gedurende de volgende 24 uur na de procedure op tekenen van stress of infectie. Centrifugeer ondertussen de beenmergcellen, aspireer voorzichtig de PBS weg en resuspendeer het pellet.Was na 10 minuten de cellen in één milliliter PBS in 500 microliters erytrocytenlysebuffer. Het pellet bevat mononucleaire cellen uit het beenmerg die gebruikt kunnen worden voor experimentele analyse. Deze eerste figuren illustreren hoe vergelijkbare typen en proporties van bulkcellen en hematopoëtische stam- en progenitorcellen kunnen worden waargenomen via morfologische en flowcytometrische analyses, waarbij gebruik is gemaakt van zowel femorale beenmergaspiratie als conventionele beenmergoogst.Hier wordt het percentage van lineage-negatieve SKA1-positieve c-kit-positieve en myeloïde progenitor-subpopulaties getoond, uitgedrukt als een frequentie van het totaal aantal levende cellen in drie onafhankelijke aspiraties en een conventionele mergopname. Deze gegevens onthullen een afname in de lineage-negatieve SKA1-positieve, c-kit-positieve en myeloïde progenitor-subpopulaties uit beenmerg verzameld via femorale aspiratie vergeleken met conventionele mergopname. Dit verschil was voor deze populatie niet statistisch significant.Echter, sortering van lineage-negatieve ska1-positieve c-kit-positieve cellen, gevolgd door ex vivo kweek in methylcellulose, resulteert in vergelijkbare aantallen koloniën en celtypen als die verkregen worden via femurbeenmergaspiratie. Net als bij conventionele beenmergoogst omvatten de kolonietypen die in beide kweken zijn waargenomen en geteld, colony forming units van granulocyten, erytrocyten, monocyten en megakaryocyten, colony forming units van granulocyten en monocyten, en erythroid burst forming units. Deze techniek kan in 10 minuten per muis worden uitgevoerd indien deze procedure correct wordt gevolgd.Andere methoden, zoals intrafemorale beenmerginjectie, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals wat het effect is van een xenograft van menselijke hematopoëtische cellen in immuungecompromitteerde muizen?

femoral-bone-marrow-aspiration-in-live-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Diermodellen worden vaak gebruikt om uitzaaiing studeren bot. In dit protocol beschrijven we twee gebruikelijke methoden van tumorinoculatie voor bot metastase studies en beschrijf kort enkele van de analyses gebruikt om toezicht te houden en te kwantificeren deze modellen.

Modellen van bot metastase

This video describes a detailed protocol to isolate fresh whole bone marrow from the mouse's hind limbs to investigate whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia.

Bone Marrow Harvest from Mouse Hind Limb

Monocyten zijn belangrijke regulatoren van aangeboren immuniteit en spelen een cruciale rol bij de vernieuwing van het perifere mononucleaire fagocytische systeem en in geval van ontsteking. Dit manuscript beschrijft de procedure van realtime beeldvorming van het muiscalvaria beenmerg om het mechanisme van monocytmobilisatie te bestuderen.

Tracking muisbeenmerg Monocyten<em&gt; In Vivo</em

Er wordt een strategie gepresenteerd om histologisch data in het beenmerg kwantitatief te analyseren. Confocale microscopie van fluorescent gelabelde cellen in weefselsecties resulteert in 2-dimensionale beelden, die automatisch worden geanalyseerd. Co-lokalisatieanalyses van verschillende celtypen worden vergeleken met gegevens van gesimuleerde beelden, waardoor kwantitatieve informatie over cellulaire interacties wordt verkregen.

Geautomatiseerde kwantificering van hematopoietische cellen - stromale cel interacties in histologische afbeeldingen van ontkalkte Bone

Het protocol beschrijft een nieuw model voor een muis dijbeenraamkamer dat kan worden gebruikt om de beweging van cellen in het beenmerg in vivo te volgen. Intravitale multifotonfluorescentiemicroscopie wordt gebruikt om drie componenten van het dijbeenmerg (vaatstelsel, collageenmatrix en neutrofielen) in de tijd te beeldvormen.

Dijbeen Window Chamber Model voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Tracking in het Muizen Bone Marrow

Intravital fluorescentie microscopie (IVFM) van de calvarium wordt toegepast in combinatie met genetische diermodellen om de homing en engraftment van hematopoietische cellen in het beenmerg (BM) niches te studeren.

Intravital Fluorescent microscopie (IVFM) te combineren met genetische modellen om te studeren van Engraftment dynamiek van hematopoietische cellen aan het beenmerg Niches

Het model lymfkliertest gesloten femurfractuur is een krachtig platform om te studeren fractuur genezing en nieuwe therapeutische strategieën te bot regeneratie te versnellen. Het doel van deze chirurgische protocol is het genereren van unilaterale gesloten femorale fracturen in muizen met behulp van een intramedullaire stalen staaf te stabiliseren van het dijbeen.

De generatie van gesloten femorale fracturen in muizen: een Model om te studeren bot genezing

Hier presenteren we een protocol voor het verwerken van vers beenmerg (BM) geïsoleerd van muis of mens voor High-dimensionale massa Cytometry (Cytometry door time-of-Flight, CyTOF) analyse van neutrofiele-Lineage cellen.

Voorbereiding van het hele beenmerg voor massa Cytometry analyse van neutrofiele-Lineage cellen

We beschrijven drie methoden van beenmergtransplantatie (BMT): BMT met total-body bestraling, BMT met afgeschermde bestraling en BMT-methode zonder pre-conditionering (adoptieve BMT) voor de studie van klonale hematopoiese in muismodellen.

Beenmergtransplantatieprocedures bij muizen om clonal hematopoiese te bestuderen

Dit protocol beschrijft de intrafemorale injectie van enkele hematopoëtische of leukemische stamcellen, waaronder gen-bewerkte cellen, in muizenxenotransplantaatmodellen, die niet alleen de snelle en veilige transplantatie van cellen mogelijk maken, maar ook seriële analyses van het beenmerg.

Vereenvoudigde intrafemorale injecties met levende muizen maken continue beenmerganalyse mogelijk

Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd om micro-omgevingspopulaties in het beenmerg te isoleren en te karakteriseren op basis van muizenmodellen van myelodysplastische syndromen en acute myeloïde leukemie. Deze techniek identificeert veranderingen in de niet-hematopoëtische beenmergniche, inclusief de endotheliale en mesenchymale stromale cellen, met ziekteprogressie.

Identificatie van micro-omgevingspopulaties in het beenmerg bij myelodysplastisch syndroom en acute myeloïde leukemie

Leer een niet-letale methode voor femorale beenmergaspiratie bij levende muizen. Dit protocol maakt seriële bemonstering mogelijk voor longitudinale hematopoëtische studies zonder dieren te offeren.

Femorale beenmergaspiratie in levende muizen

Meer video's verkennen