SIVQ-LCM protocol voor de ArcturusXT Instrument

Het algemene doel van deze procedure is om ruimtelijk invariante, vector-kwantificering of SIVQ-beeldanalyse in combinatie met laser capture MICRODISSECTIE of LCM te gebruiken om weefselkenmerken van belang te identificeren en snel gerichte microdissectie uit te voeren. Dit wordt bereikt door eerst beelden van het doelweefsel voor SIVQ vast te leggen. Vervolgens wordt de SIVQ-analyse uitgevoerd en wordt de SIVQ-annotatie geïmporteerd in het microdissectieapparaat voor verwerking.

Uiteindelijk kunnen de cellen van belang worden geïsoleerd door S-I-V-Q-L-C-M voor downstream moleculaire analyse. Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat S-I-V-Q-L-C-M het proces van selecteren en micro-dissectie van grote doelgebieden stroomlijnt die anders uitdagend en tijdrovend zouden zijn met traditionele laser capture micro-dissectietechnieken. Dr. Avi Rosenberg, een klinisch fellow in ons laboratorium, zal de procedure demonstreren om de weefselspecimens van belang te beeldhouwen.

Laad eerst de dia's op de gemotoriseerde tafel van het microdissectie-instrument en start de bijbehorende software. Selecteer vervolgens de juiste selectievakjes om de posities van de geladen dia's aan te wijzen en zorg ervoor dat de vastgelegde beeldbestanden worden opgeslagen in JPEG-formaat. Pas de helderheid en focus van het beeld op het scherm aan om de beeldkwaliteit te optimaliseren.

Gebruik vervolgens de inspectietoolbox, draai de diffuser in en stel een lamphelderheid van 60 en een cameraversterking van twee 20 in. Klik in het overzichtsvenster met de rechtermuisknop om te selecteren, onthoud instellingen en sla op. Leg een miniatuuroverbeeld van de dia vast om een plattegrond voor het dissectieproces te bieden.

Pas een vergroting aan en zoek het gebied van belang. Leg vervolgens een afbeelding van het gebied vast voor algoritmische analyse van de vastgelegde afbeeldingen. Begin door de afbeeldingen over te brengen naar de SIVQ-map.

Open vervolgens SIVQ en laad de vastgelegde afbeelding van belang. Navigeer naar het gebied van belang en pas de grootte van de viewport vijf en zes weergavevensters aan zonder de vergroting van het beeld aan te passen. Selecteer vervolgens de grootte van de ringvector en het aantal ringen dat voor analyse wordt gebruikt.

Klik met de rechtermuisknop op de te vangen predicaatbeeldfunctie in het viewport zes venster, selecteer heatmap en klik vervolgens op scan naar X om het beeld te analyseren. Gebruik vervolgens de bovenste van de twee horizontale schuifbalken om de algehele vectorspecificiteit aan te passen. Gebruik de onderste balk om de gevoeligheid te verhogen nadat de huid is uitgevoerd.

Om het gebied dat als match is geclassificeerd te vergroten, schakel het selectievakje van de heatmap uit om ervoor te zorgen dat de SIVQ-heatmap wordt gewijzigd in een uniforme rode kleur en verhoog de verfgrootte. Sla de afbeelding op door op de knop 'afbeelding opslaan' te klikken. Converteer vervolgens de BMP-uitvoer naar een JPEG-bestandsformaat.

Gebruik vervolgens een hex-editor om de positionele coördinaten gevonden tussen het begin van de afbeeldingsmarkering en de eerste gedefinieerde kwantiseringstabelmarkering in de bestandsheader van de post-analyse JPEG van de oorspronkelijke dissectieinstrumentafbeelding te herlezen voordat u begint met de microdissectie. Plaats de laser capture MICRODISSECTIE of LCM-kap op het centrum van het gebied van belang waar de afbeeldingen zijn vastgelegd voor de SIVQ-analyse. Na het kalibreren van de UV- en infraroodlasers, optimaliseer vervolgens de parameters, inclusief duur van de stroom, laserlocaties en UV-snijsnelheid.

Open vervolgens de geautomatiseerde selectiesoftware en importeer de geanalyseerde afbeelding. Maak een nieuw analysebestand aan om de geautomatiseerde selectiesoftware te trainen om de SIVQ-annotatie te herkennen. Selecteer nu de achtergrondgebieden die zijn gemarkeerd door de blauwe vierkanten van de SIVQ-geanalyseerde afbeelding.

Selecteer vervolgens de gebieden van belang of R OIS gemarkeerd door de rode cirkels en klik op leren om het trainingsbestand te genereren. Kopieer de geselecteerde gebieden naar de live-afbeelding. Om met de microdissectie te beginnen, selecteer de microdissectietoolbox en kies de juiste infrarood-opname of UV-snijdknoppen.

Nadat de dissectie is voltooid, verplaats de LCM-kap naar het kwaliteitscontrolestation en leg een afbeelding van het gedissekteerde exemplaar vast. Als de gewenste exemplaren met succes zijn gedissekteerd, klikt u op de knop 'huidige fase' en verwijdert u de LCM-kap om de moleculaire extractieprocedure voor downstream-analyse te starten. In dit representatieve experiment werd een formaline-gefixeerd, paraffine-ingebedde menselijke borstweefselsectie geïmmunokleuring voor cytokeratine AE een, AE drie met behulp van een standaard immunohistochemieprotocol.

Aangezien dit weefsel niet kan worden afgedekt voor microdissectie, kunnen de immunohistochemisch gekleurde cellen moeilijk visueel te waarderen zijn. Om een betere indexaanpassing en een verbeterd beeld te bieden, werden xyleen toegevoegd aan de weefselsectie om een pseudodeksel te creëren. Er werd vervolgens een JPEG-afbeelding vastgelegd van het pseudodekselgebied en geïmporteerd in SIVQ voor algoritmische analyse.

Een predicaatbeeldfunctie waargenomen als een donkerbruine DAB-kleurstof werd door de gebruiker geselecteerd en de SIVQ-algoritme werd gestart voor beeldanalyse. De SIVQ-heatmap werd vervolgens omgezet in een rode verf die wordt herkend door de geautomatiseerde selectiesoftware en de xyleen werden geëvaporeerd. De SIVQ-heatmap werd vervolgens geïmporteerd in de geautomatiseerde selectiesoftware.

Ten slotte werden de gemarkeerde cellen gedissecteerd met de infraroodlaser. De LCM-kap werd vervolgens verplaatst naar het kwaliteitscontrolestation van het microdissectie-instrument en visueel geïnspecteerd om de succes van de dissectie te beoordelen. Het resterende weefsel werd ook geïnspecteerd en de SIVQ-heatmap werd opnieuw geïmporteerd.

Om de efficiëntie van de microdissectie verder te bevestigen kan eenmaal beheerst S-I-V-Q-L-C-M in enkele minuten per dia worden gedaan en snel verrijkte input