Name: Snelle identificatie van Gram-negatieve bacteriën van Blood Culture Bouillon Met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 29 s
Description: Leer een snelle identificatiemethode voor Gram-negatieve bacteriën uit bloedkweekbouillon met MALDI-TOF massaspectrometrie. Dit protocol versnelt de diagnose van bloedstroominfecties en ondersteunt tijdige antimicrobiële therapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<html> 1. Bloed kweeksuspensies Markeren als &quot;Positief&quot; <ol><li> Verwijder de gesignaleerd bloedkweekfles van de continue monitoring incubatie kast en plaats deze in een biologisch veiligheidskabinet. Opmerking: De flessen kunnen gevaarlijke micro-organismen bevatten en universele voorzorgsmaatregelen moeten worden gevolgd. Vanwege het risico van infectieuze aërosolen in monsters, moeten alle monsters procedures worden uitgevoerd in een Biosafety klasse II laminair flowkast. </li></ol> 2. Gram Stain is voorbereid <ol><li> Maak een Gramkleuring van de gesignaleerd bloed cultuurbouillon volgens lokale institutionele protocollen. Opmerking: Bij Gram negatieve organismen zijn vermeld microscopie bloed kweekmedium wordt verwerkt volgens de volgende werkwijze. Bij Gram-positieve organismen worden geïdentificeerd, wordt een alternatieve moleculaire methode gericht genetische identificatie en resistentiemerkers toegepast op de bouillon (niet in dit artikel behandeld) 13. </li></ol>e &quot;&gt; 3. Overdracht van Markeerde Blood Culture Bouillon een Serum Scheiden Tube <ol><li> Meng de bloedkweekfles door het omkeren van 2-3x. </li><li> Binnen de bioveiligheid kast bevestig een injectiespuit 10 ml van een veiligheidsprobleem bloedtransfusie apparaat. </li><li> Bevestig de bloedtransfusie apparaat om de bloedkweekfles en 5 ml van de bouillon te trekken in de spuit. Breng de aangezogen BC bouillon in een serum scheiden buis. </li></ol> 4. Concentratie van Blood Culture Bouillon <ol><li> Centrifugeer het serum scheiden buis bij 1250 xg gedurende 15 min met een groot volume rode bloedcellen verwijderd. </li><li> Zuig de bovenstaande vloeistof met behulp van een steriele transferpipet voorzichtig om ongeveer 1 ml van de buffycoat direct boven de gel / vloeistof-interface te verlaten. Opmerking: De aërobe flessen een duidelijke scheiding van rode bloedcellen op de bodem van de buis met de gel / vloeistof-interface verschijnt een ondoorschijnende witte kleur. Wanneer daarentegentoegepast op de lytische anaerobe bloed cultuurbouillon de gel / vloeistof-interface verschijnt als een diepe rode kleur te wijten aan de gelyseerde rode bloedcellen componenten blijven gesuspendeerd in het supernatant. </li></ol> 5. Herhaal Centrifugeren wasstappen <ol><li> Meng de laatste 1 ml buffy coat vloeistof boven de gel interface met een steriele pipet en vervolgens over het gehele volume in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Centrifugeer de nieuwe buis bij 288 g gedurende 30 sec. </li><li> Breng de supernatant met een wegwerpbare plastic 1 ml pipet in een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis en gooi de buis met de pellet. Opmerking: Het is van cruciaal belang in deze stap die zorg wordt genomen om de overdracht van de pellets voorkomen. Dit is bijzonder belangrijk voor een preparaat uit de anaërobe BC fles verwerkt de supernatant blijft gepigmenteerd en de pellet wordt niet altijd duidelijk zichtbaar. </li></ol> 6. Lysis van een blijvend Cellen </p&gt; <ol><li> Centrifugeer het monster bij 18.407 xg gedurende 1 minuut en vervolgens aspireren (en teruggooi) de bovenstaande vloeistof met een fijne tip transferpipet om zo weinig resterende vloeistof mogelijk te verlaten zonder verstoring van de pellet. </li><li> Resuspendeer de residuele pellet in 1 ml steriel DNAse en RNAse vrij water op en neer te pipetteren. Opmerking: Sommige auteurs hebben het gebruik van alcohol oplossingen in plaats van steriel water om de pellet welke bacteriën niet-levensvatbaar maakt resuspenderen beschreven. </li><li> Centrifugeer de oplossing geresuspendeerd 18.407 xg gedurende 1 minuut. </li></ol> 7. Extractie van bacteriële eiwitten <ol><li> Zuig en gooi het supernatant, wederom met behulp van aspiratie met een fijne tip pipet ervoor te zorgen dat zoveel vloeistof als mogelijk wordt verwijderd. </li><li> Resuspendeer de pellet in 10 pl mierenzuur (70% v / v). Opmerking: Mierenzuur kan het lichaam beïnvloeden als deze wordt ingeademd of wanneer het in contact komt met de huid. Bij de voorbereiding of het manipuleren van oplossingen is het rANBEVOLEN dat medewerkers gebruik maken van een zuurkast in aanvulling op de persoonlijke beschermingsmiddelen. </li><li> Meng goed met behulp van de pipet om een ​​homogene geresuspendeerd oplossing zorgen. De pipetpunt fysiek verstoren de pellet kan nodig zijn om een ​​homogene oplossing te garanderen. </li></ol> 8. Bereiding van MALDI-TOF richtmerk <ol><li> Inoculeren een schone MALDI-TOF doel plaat met 2 pi van de bereide suspensie per doel plek. Bereid 3 doelwitplaatsen voor elk monster de occasionele probleem van de mislukte leest overwinnen. </li><li> Laat de MALDI-TOF richtplaat te drogen. De droogsnelheid kan worden verhoogd door het plaatsen van de plaat op de rand van de zuurkast luchtstroom over de plaat te maximaliseren. </li><li> Overlay elk gedroogde vlek met 1 pl van de matrix-oplossing (10 mg / ml α-cyaan-4-hydroxykaneelzuur (HCCA), 50% acetonitril, 2,5% trifluorazijnzuur). Opmerking: Matrix oplossing kan het lichaam beïnvloeden als het wordt ingeademd of als het komt in contact met de huid. Bij de voorbereiding of het manipuleren van oplossingen is het aanbevolen dat het personeel gebruik een zuurkast in aanvulling op de persoonlijke beschermingsmiddelen. </li><li> Laat de MALDI-TOF richtplaat drogen aan de rand van de zuurkast zoals hierboven beschreven. Zorgen homogene bereiding elk doel vlekken op de plaat vult. </li></ol> 9. Place MALDI-TOF Richtmerk in de massaspectrometer <ol><li> Steek de MALDI-TOF doel plaat in de MALDI-TOF massaspectrometer. Zorg ervoor dat de plaat zit gelijk met de verende platen. Let op: niet in te voegen het doel plaat totdat alle doelgroepen plekken zijn droog. </li><li> Zorg ervoor dat de rubberen afdichting schoon is van pluizen, stof en haren om de vereiste vacuüm kan worden gecreëerd. </li><li> Sluit de MALDI-TOF stadium deksel en druk op de &quot;in / out&quot;-knop op de voorkant van het instrument. Het deksel zal nu vergrendeld en kan de vereiste vacuüm te creëren. </li></ol> 10. MALDI-TOF MS Spectra Acquisitie <ol><li> Open de MALDI Biotyping en FlexControl software. </li><li> Binnen de typen software selecteren &quot;nieuwe classificatie&quot; uit het dropdown menu met de titel &quot;file&quot;. Noem het project en selecteer &quot;nieuw&quot;. Selecteer &quot;Next&quot; om de installatie binnen de typen software te voltooien. </li><li> Binnen de besturingssoftware venster identificeren van de afbeelding van het doel plaat op het scherm. Markeer de MALDI-TOF doelwit plekken die in gebruik zijn door het bewegen van de muis over het geënte plekken terwijl u de linkermuisknop ingedrukt houdt. </li><li> Gebruik de rechter muisknop ergens op het geselecteerde doel posities en selecteer vervolgens &quot;analyten toevoegen&quot; uit het dropdown menu. </li><li> Voeg bloedkweek identificatiegegevens aan de &quot;ID&quot; kolom voor elk van de beoogde plekken in en klik op &quot;volgende&quot; als u klaar bent. </li><li> Selecteer de commerciële &quot;taxonomie&quot; spectra databank en selecteer &quot;volgende&quot;. Opmerking: Laboria kan gebruik maken van bijkomende vaste of commerciële databases om het aantal referentie-spectra te verhogen. </li><li> Klik op &quot;finish&quot; en de MALDI-TOF MS zal beginnen genereren spectra. Opmerking: MALDI-TOF instellingen waren als per instelling fabricage&#39;s (lineaire positieve modus, 60 Hz laser frequentie, 20 kV versnelling spanning, 16,7 kV IS2 voltage, 170 ns extractie vertraging, en 2,000-20,137 m / z bereik). </li><li> Als de MALDI control software niet pieken genereren, kan handmatige overname van spectra worden uitgevoerd (methode niet beschreven). </li></ol> 11. Bericht Analyse Interpretatie van MALDI-TOF MS Scores <ol><li> Zodra de spectra worden verworven en analyse is voltooid, selecteert u de knop &quot;+&quot; naast de identificatie van soorten op de Typen software om de identificatie lijst voor elke doelgroep uit te breiden. </li><li> Bestudeer de top 5 identificaties, wijzend als de top 5 zijn vergelijkbaar. Strijdige top 5 geslachten met scores ≥ 1.7 van dezelfde doelgroepspot gewezen op de mogelijkheid van gemengde bouillon. Opmerking: MALDI-TOF-technologie heeft een slechte sensitiviteit voor de detectie van gemengde bouillon. Wanneer bijvoorbeeld een bouillon bevat gemengde species een hoge betrouwbaarheidscore worden geïdentificeerd voor slechts een van de gemengde species. </li><li> Bij een score ≥ 2,0 wordt genoteerd voor de hoogste wedstrijd op een doel plek, melden de soort. </li><li> Wanneer de hoogste score op een doel spot is ≥ 1,7, doch &lt;2,0, melden alleen de geslachten. Als aanvullende criteria van de top 5 identificaties zijn concordant, vervolgens verslag uit bij soortniveau. </li></ol> 12. Verwijdering van MALDI-TOF Richtmerk <ol><li> Wanneer alle spectra zijn, drukt het &quot;in / out&quot;-knop op de MALDI-TOF machine. </li><li> Open de MALDI-TOF doel plaat houder en verwijder de MALDI-TOF richtmerk. </li><li> Bij gebruik van een herbruikbare MALDI-TOF richtmerk, schoon alle doelgroepen plekken gebruik van alcohol en opslaan van de MALDI-TOF plaat bij RT als het eenmaal schoon en droog is. </li></ol>

<ol><li>Bearman, G. M., Wenzel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteremias%3A+a+leading+cause+of+death%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Med.+Res%22%5BJournal%5D)">Bacteremias: a leading cause of death.</a> Arch. Med. Res. 36 (6), 646-659 (2005).</li>
<li>Leibovici, L., Shraga, I., Drucker, M., Konigsberger, H., Samra, Z., Pitlik, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+benefit+of+appropriate+empirical+antibiotic+treatment+in+patients+with+bloodstream+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Intern.+Med%22%5BJournal%5D)">The benefit of appropriate empirical antibiotic treatment in patients with bloodstream infection.</a> J. Intern. Med. 244 (5), 379-386 (1998).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duration+of+hypotension+before+initiation+of+effective+antimicrobial+therapy+is+the+critical+determinant+of+survival+in+human+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock.</a> Crit. Care Med. 34 (6), 1589-1596 (2006).</li>
<li>Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+treatment+of+bloodstream+infection%3A+laboratory+reporting+and+antimicrobial+management%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management.</a> J. Clin. Microbiol. 41 (1), 495-497 (2003).</li>
<li>Clerc, O., Prod'hom, G., Vogne, C., Bizzini, A., Calandra, T., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry+on+the+Clinical+Management+of+Patients+With+Gram-negative+Bacteremia%3A+A+Prospective+Observational+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Impact of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry on the Clinical Management of Patients With Gram-negative Bacteremia: A Prospective Observational Study.</a> Clin. Infect. Dis. 56 (8), 1101-1107 (2013).</li>
<li>Dekker, J. P., Branda, J. A. MALDI-TOF Mass Spectrometry in the Clinical Microbiology Laboratory. Clinical Microbiology Newslette. 33 (12), 87-93 (2011).</li>
<li>Seng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ongoing+revolution+in+bacteriology%3A+routine+identification+of+bacteria+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Clin. Infect. Dis. 49 (4), 543-551 (2009).</li>
<li>Neville, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry+following+introduction+for+routine+laboratory+bacterial+identification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Utility of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry following introduction for routine laboratory bacterial identification.</a> J. Clin. Microbiol. 49 (8), 2980-2984 (2011).</li>
<li>Schmidt, V., Jarosch, A., März, P., Sander, C., Vacata, V., Kalka-Moll, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+bacteria+in+positive+blood+culture+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of bacteria in positive blood culture by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (3), 311-317 (2012).</li>
<li>March-Rosselló, G. A., Muñoz-Moreno, M. F., de Urriés, M. C., Bratos-Pérez, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differential+centrifugation+protocol+and+validation+criterion+for+enhancing+mass+spectrometry+%28MALDI-TOF%29+results+in+microbial+identification+using+blood+culture+growth+bottles%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">A differential centrifugation protocol and validation criterion for enhancing mass spectrometry (MALDI-TOF) results in microbial identification using blood culture growth bottles.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 32 (5), 699-704 (2012).</li>
<li>Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+bacteria+from+positive+blood+culture+bottles+by+use+of+matrix-assisted+laser+desorption-ionization+time+of+flight+mass+spectrometry+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting.</a> J. Clin. Microbiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).</li>
<li>Gray, T. J., Thomas, L., Olma, T., Iredell, J. R., Chen, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+Gram-negative+organisms+from+blood+culture+bottles+using+a+modified+extraction+method+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of Gram-negative organisms from blood culture bottles using a modified extraction method and MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 72 (2), 110-112 (2013).</li>
<li>Hazelton, B. J., Thomas, L. C., Unver, T., Iredell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+Gram-positive+pathogens+and+their+resistance+genes+from+positive+blood+culture+broth+using+a+multiplex+tandem+RT-PCR+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of Gram-positive pathogens and their resistance genes from positive blood culture broth using a multiplex tandem RT-PCR assay.</a> J. Med. Microbiol. 62 (2), 223-2231 (2013).</li>
<li>Saffert, R. T., Cunningham, S. A., Mandrekar, J., Patel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+preparatory+methods+for+detection+of+bacteremia+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of three preparatory methods for detection of bacteremia by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 73 (1), 21-26 (2012).</li>
<li>Consoir, C., Lörch, D., Schneider, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+identification+of+bacteria+from+charcoal-containing+blood+culture+bottles+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionisation+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Direct identification of bacteria from charcoal-containing blood culture bottles using matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (10), 2843-2850 (2012).</li>
<li>Martiny, D., Dediste, A., Vandenberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+an+in-house+method+and+the+commercial+Sepsityper%E2%84%A2+kit+for+bacterial+identification+directly+from+positive+blood+culture+broths+by+matrix-assisted+laser+desorption-ionisation+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of an in-house method and the commercial Sepsityper™ kit for bacterial identification directly from positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption-ionisation time-of-flight mass spectrometry.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (9), 2269-2281 (2012).</li>
<li>Moussaoui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+identifies+90%25+of+bacteria+directly+from+blood+culture+vials%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials.</a> Clin Microbiol Infect. 16 (11), 1631-1638 (2010).</li>
<li>Novel,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((improved+sample+preparation+for+rapid%2C+direct+identification+from+positive+blood+cultures+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+%28MALDI-TOF%29+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">improved sample preparation for rapid, direct identification from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry.</a> J. Mol. Diagn. 13 (6), 701-706 (2011).</li>
<li>Fothergill, A., Kasinathan, V., Hyman, J., Walsh, J., Drake, T., Wang, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Identification+of+Bacteria+and+Yeasts+from+Positive-Blood-Culture+Bottles+by+Using+a+Lysis-Filtration+Method+and+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization-Time+of+Flight+Mass+Spectrum+Analysis+with+the+SARAMIS+Database%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Identification of Bacteria and Yeasts from Positive-Blood-Culture Bottles by Using a Lysis-Filtration Method and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrum Analysis with the SARAMIS Database.</a> J. Clin. Microbiol. 51 (3), 805-809 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Het is van belang bij de toepassing van MALDI-TOF MS om bloed cultuurbouillon dat de post centrifugeren stappen worden uitgevoerd met voldoende zorg niet aan de gescheiden componenten te remixen. Het is bijzonder belangrijk om de bestanddelen bloedkweek en menselijke cellulaire eiwitten, zoals hemoglobine, die spikes interfereren met de MALDI-TOF spectra kunnen veroorzaken te verwijderen. Hoewel MS produceert raden afgesneden score van ≥ 2,0 voor soorten en ≥ 1,7 voor genus identificatie, he...

Patiënten met een infectie in de bloedbaan (BSI) als gevolg van bacteriën blijven hoog sterftecijfer in het ziekenhuis hebben, variërend 6-48% 1. De levering van geschikte empirische antibiotica bevordert de overleving en de subgroep van patiënten met ernstige sepsis, elk uur vertraging passende therapie correleert met verminderde overleving 2,3. Dienovereenkomstig is een belangrijke doelstelling van het klinisch laboratorium is om snel te detecteren, identificeren en communiceren van de aanwezigheid van bacteriën in het bloed culturen om klinische beslissingen. Het is aangetoond dat de microbiologie laboratorium heeft de grootste invloed op antimicrobiële therapie bij de rapportage van de Gramkleuring 4 en recent een waarnemingsstudie aangetoond dat matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie vluchttijd massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) direct uitgevoerd op bloed kweeksuspensies beïnvloeden voorschrijven in meer dan een derde van de BSI veroorzaakt door Gram-negatieve bacteriën 5. 6,7. De technologie is nu goed ingeburgerd en is geïntegreerd in veel laboratoria voor snelle en accurate identificatie van micro-organismen die op vaste media 6,8. De directe toepassing van MALDI-TOF MS bloed cultuur (BC) bouillon die voor micro-organismen beroep op zowel clinici en laboratorium managers vanwege de potentie om een ​​snellere identificatie van micro-organismen tegen een lage prijs te krijgen &quot;positief&quot; zijn gesignaleerd. De klinische bruikbaarheid van directe toepassing van MALDI-TOF MS om bloed cultuurbouillon is beperkt door de brede waaier van gevoeligheden waargenomen in vergelijking met standaard fenotypische cultuur gebaseerde methoden van identificatie, met meldingen van succesvolle identificatie van Gram-negatieve bacteriën, variërend 47-98,9 % 9-11. De variatie in gevoeligheid waarschijnlijkebetreft de BC bouillon samenstelling, aanvankelijk bacteriële concentratie variatie monstervoorbereiding en de talloze gramnegatieve organismen aangetroffen in onderzoekspopulatie 9. Vergeleken met deze andere gepubliceerde protocollen de hier gepresenteerde werkwijze vermijdt het gebruik van ethanol, ammoniumchloride of extra (niet-matrix) acetonitril. Als gevolg van de bacteriële pellet levensvatbaar blijft (tot het tijdstip eiwitextractie) waardoor potentiële fenotypische gevoeligheid testmethoden rechtstreeks worden toegepast op deze organismen in bouillon. Daarnaast heeft de gepresenteerde methode getoond goedkoop, betrouwbaar en snel met bacteriële identificatiemiddelen bestaan ​​binnen 25 minuten van de bloedkweek Gramkleuring resultaten met minimale praktijkervaring op tijd 12 zijn. Deze werkwijze is een eenvoudige eigen rotatie-lysis protocol gebruik mierenzuur extractie direct op positieve bloedkweek bouillon door Gram negatieve b identificerenBacteriën met MALDI-TOF MS technologie.

<table><tbody><tr><td>BACTEC Plus Aerobic/F Medium</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>442192</td><td></td></tr><tr><td>BACTEC Lytic/10 Anaerobic/F Medium</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>442265</td><td></td></tr><tr><td>BACTEC Peds Plus Medium</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>442194</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer - Blood transfer device</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>364880</td><td>Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury</td></tr><tr><td>Vacutainer SST 5.0 ml, Advance plus</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>367954</td><td>Serum separating tube</td></tr><tr><td>Syringe 10 ml</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>302143</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Samco, USA</td><td>222-20S</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette (fine tipped)</td><td>Samco, USA</td><td>232-20S</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube (2.0 ml)</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>0030.120.094</td><td></td></tr><tr><td>Sterile water (DNAse and RNAse free)</td><td>Life Technologies, Carlsbad, California, USA</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>Matrix solution&nbsp;</td><td>Bruker Daltonics, Bremen Germany</td><td>285074</td><td>10 mg/ml &alpha;-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid</td></tr><tr><td>Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS</td><td>Bruker Daltonics, Bremen Germany</td><td></td><td>Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software</td></tr></tbody></table>

snelle identificatie van gram-negatieve bacteriën van blood culture bouillon met behulp van maldi-tof massaspectrometrie

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Een belangrijke rol van de klinische microbiologie laboratorium is om een ​​snelle identificatie van bacteriën die bloedbaan infectie. Traditionele identificatie vereist de sub-cultuur van gesignaleerd bloedkweek bouillon met identificatie alleen beschikbaar nadat kolonies op vaste agar hebben gerijpt. MALDI-TOF MS is een betrouwbare, snelle werkwijze voor identificatie van de meeste klinisch relevante bacteriën wanneer toegepast op kolonies op vaste media. De toepassing van MALDI-TOF MS direct naar bloedkweek bouillon is een aantrekkelijke aanpak, omdat het heeft potentieel om species identificatie van bacteriën versnellen en verbeteren van klinische behandeling. Echter, een belangrijk probleem te overwinnen is de pre-analyse verwijdering van storende harsen, eiwitten en hemoglobine in bloedkweek specimens die, indien niet verwijderd, interfereren met de MS-spectra en kan leiden tot onvoldoende of lage discriminatie identificatie scores. Bovendien moet bacter concentrerenia te ontwikkelen spectra van voldoende kwaliteit. De gepresenteerde methode beschrijft de concentratie, zuivering en extractie van Gram-negatieve bacteriën waardoor de vroegtijdige identificatie van bacteriën uit een gesignaleerd bloedkweek bouillon.

De gegenereerde MALDI-TOF MS spectra vergeleken met de geïntegreerde referentiedatabank spectra. Een logaritmische score wordt toegekend voor het vertrouwen van de wedstrijd tussen de test isolaat en de referentiedatabank isolaten, met de aanbeveling van een score ≥ 1.7 vereist voor waarschijnlijke identificatie geslachten niveau (figuur 1) en ≥ 2,0 voor waarschijnlijke identificatie van soorten (Figuur 2). Rapporteer aan soorten in als de score ≥ 1.7 en de eerste 5 identificaties geëve...

De toepassing van matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie vluchttijd (MALDI-TOF) massaspectrometrie (MS) rechtstreeks bloed kweekbouillon versnelt de identificatie van bacteriën. De onderhavige methode is een snelle en betrouwbare methode voor de identificatie van Gram-negatieve bacteriën direct uit bloed kweekbouillon.

Snelle identificatie van Gram-negatieve bacteriën van Blood Culture Bouillon Met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Het algemene doel van deze procedure is om gramnegatieve organismen direct uit bloedkweekbouillon te identificeren met behulp van de maloff-technologie. Hiervoor worden vijf milliliters van een positieve bloedkweekbouillon overgebracht naar een serumscheidingsbuis en gecentrifugeerd. Na het centrifugeren wordt de bacteriebevattende vloeistoflaag overgebracht naar een microcentrifugebuis en vervolgens op lage snelheid gecentrifugeerd. Het supernatant wordt daarna overgebracht naar een nieuwe microcentrifugebuis en op hoge snelheid gecentrifugeerd.Het resulterende pellet wordt gesuspendeerd in mierenzuur en geanalyseerd via MALDI om de aanwezige bacteriële soorten te identificeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals traditionele kweek, is de eerdere identificatie van gramnegatieve bacteriën. De implicaties van deze techniek reiken tot in de klinische microbiologie, omdat een diagnose van bacteriëmie invloed heeft op de keuze van het antimicrobiële middel dat door de clinicus wordt voorgeschreven.Leonardo Bascu, een van de technici in onze afdeling die deze procedure regelmatig uitvoert, zal deze procedure demonstreren. Aerobe of anaerobe bloedkweekflessen, verzameld naar goeddunken van het klinische personeel, meestal bij een febriele aandoening, worden geïncubeerd in geautomatiseerde apparaten die continu de groei van bacteriën bewaken. Wanneer er bewijs is voor groei in een bloedkweekfles, zal het apparaat de gesignaliseerde fles identificeren.Begin deze procedure door het gesignaleerde bloedkweekflesje uit de incubator te halen. Plaats het in een biologische veiligheidskast. Maak een Gram-kleuring van het gesignaleerde bloedkweekmedium volgens de lokale institutionele protocollen en onderzoek dit via microscopie wanneer er gramnegatieve organismen worden geïdentificeerd.Verwerk het kweekmedium volgens de hier beschreven methode. Indien grampositieve organismen worden geïdentificeerd, kan een alternatieve snelle moleculaire methode worden gebruikt. Keer de bloedkweekfles twee tot drie keer om om te mengen.Voer dit vervolgens uit in de veiligheidskast. Bevestig een spuit van 10 milliliter aan een veilig apparaat voor bloedoverdracht. Bevestig het apparaat voor bloedoverdracht aan de bloedkweekfles en trek vijf milliliter van het bouillon in de overdrachtspuit.Centrifugeer het geaspireerde bloedkweekmedium in een serumscheidingsbuis bij 1.250 ×g gedurende 15 minuten om de rode bloedcellen te verwijderen. Na het centrifugeren vertoont de bloedkweek uit de aerobe flessen een duidelijke scheiding van de rode bloedcellen naar de bodem van de buis, waarbij de interface van de gelvloeistof als een ondoorzichtige witte kleur verschijnt. In tegenstelling hiermee vertoont de bloedkweek uit de lytische anaerobe bloedkweek een dieprode kleur bij de interface van de gelvloeistof.Omdat de gelyseerde componenten van rode bloedcellen in het supernatant blijven zweven voor beide typen aspiraten, dient men het supernatant te verwijderen met een steriele transferpipet, waarbij voorzichtig ongeveer één milliliter van de buffy coat direct boven de interface van de gelvloeistof moet worden overgelaten. Meng vervolgens met een steriele pipet voorzichtig de laatste ene milliliter buffy coat-vloeistof boven de gelinterface en breng het gehele volume over naar een microcentrifugebuisje. Centrifugeer het nieuwe buisje 30 seconden bij 288 ×g en gebruik een plastic wegwerp-transferpipet van één milliliter.Overbreng het supernatant naar een nieuwe microcentrifugebuis en gooi de buis met het pellet weg. Het is in deze stap cruciaal om te voorkomen dat het pellet wordt overgebracht. Dit is bijzonder belangrijk bij anaerobe bloedkweekmonsters, omdat het supernatant gepigmenteerd blijft en het pellet niet altijd duidelijk zichtbaar is.Centrifugeer het monster op 18.407 ×g gedurende één minuut en zuig vervolgens met een micropipet met fijne tip de supernatant af en gooi deze weg, waarbij zo little mogelijk resterende vloeistof wordt achtergelaten zonder het pellet te verstoren. Voeg één milliliter steriel DNA- en RNA-vrij water toe en pipetteer dit op en neer om het resterende pellet te resuspenderen. Centrifugeer de geresuspendeerde oplossing op 18.407 ×g gedurende één minuut.Aspirer en verwijder na de centrifugatie het supernatant met een pipet met een fijne tip. Let hierbij opnieuw op dat zoveel mogelijk vloeistof wordt verwijderd. Resuspendeer het pellet in 10 µL 70% mierenzuur.Voor grote pellets kan het nodig zijn om het volume mierenzuur met 50 tot 100% te verhogen. Meng de oplossing indien nodig goed met de pipet om een homogene suspensie te verkrijgen; gebruik de pipetpunt om de pellet fysiek te verbreken. De resulterende oplossing bevat geconcentreerde bacteriën die zijn geïsoleerd uit het bloedkweekmedium, welke relatief vrij is van menselijke cellen en harsen van de bloedkweekfles. Inoculeer met een pipet een schone MALDI-TOF-targetplaat met twee microliters van de bereide suspensie per targetspot. Bereid drie targetposities voor elk monster voor om incidentele problemen met mislukte uitlezingen te voorkomen.Plaats de plaat aan de rand van de zuurkast om de luchtstroom eroverheen te maximaliseren, zodat deze snel droogt; bedek elke gedroogde plek met één microliter matrixoplossing. Laat de MALDI-targetplaat drogen aan de rand van de zuurkast. Zorg, zoals eerder beschreven, dat elke targetplek op de plaat is gevuld met een homogene preparatie.Plaats de targetplaat in de MALDI-massaspectrometer. Zorg ervoor dat de plaat vlak aansluit op de geveerde platen. Plaats de targetplaat pas wanneer alle targetspots droog zijn.Controleer de rubberen afdichting om er zeker van te zijn dat deze vrij is van pluis, stof en haar. Dit maakt het mogelijk om de vereiste vacuümcondities te creëren. Sluit vervolgens het Maloff-podia-deksel en druk daarna op de in-out-knop aan de voorzijde van het instrument.Het deksel wordt vergrendeld en er wordt een vacuüm gecreëerd. Open de MALDI Typ en Flex Control-software binnen de Typ-software. Selecteer in het vervolgkeuzemenu Bestand de optie Nieuwe classificatie, geef het project een naam en selecteer vervolgens Nieuw.Selecteer 'next'. Om de configuratie in het venster van de flex-besturingssoftware te voltooien, identificeert u de grafische weergave van de doelplaat op het scherm terwijl u de linkermuisknop ingedrukt houdt. Beweeg de muis over de geïnoculeerde plekken en markeer de doelplekken die worden gebruikt.Klik met de rechtermuisknop op een willekeurige van de geselecteerde doelposities en selecteer vervolgens 'add analytes' in het uitklapmenu. Voeg voor elk van de doelplekken de identificatiegegevens van de bloedkweek toe aan de ID-kolom en klik op 'next'. Selecteer na voltooiing de 'Commercial Taxonomy'-spectradatabase en klik op 'next'; laboratoria kunnen aanvullende interne of commerciële databases gebruiken om het aantal referentiespectra te verhogen. Klik op 'finish' waarna de MALDI TOF MS begint met het genereren van spectra.Soms kunnen hogere MALDI-TOF scores worden behaald door de handmatige acquisitie van MALDI-TOF spectra binnen de Flex Control-software te gebruiken. Zodra de spectra zijn verkregen en de analyse in de stereotyperingssoftware is voltooid, selecteert u de plusknop naast de soortidentificatie. Om de identificatielijst voor elk doelwit uit te breiden, bestudeert u de top vijf identificaties en let u op of deze top vijf gelijkaardig zijn.Als de vijf bovenste genera discordant zijn met scores van 1,7 of hoger voor hetzelfde doelgebied, kan er sprake zijn van een mengsel van soorten. Houd er rekening mee dat OV-technologie een lage gevoeligheid heeft voor de detectie van gemengde soorten. Wanneer een score van 2,0 of hoger wordt genoteerd voor de hoogste match op een doelgebied, rapporteer dan de soort; wanneer de hoogste score op een doelgebied 1,7 of hoger is, maar lager dan 2,0, rapporteer dan het genus.Rapporteer alleen op soortniveau als aanvullende criteria van de top vijf identificaties overeenkomen. Wanneer alle spectra voltooid zijn, druk dan op de in-out-knop van de MALDI-machine, open de houder voor de targetplaat en verwijder de plaat. Als er een herbruikbare MALDI-TOF-targetplaat wordt gebruikt, reinig dan alle targetspots met alcohol en bewaar de MALDI-plaat bij kamertemperatuur zodra deze schoon en droog is. Om gramnegatieve bacteriën uit bloedkweekbouillon te identificeren, werden spin-wascycli gebruikt om bacteriën te concentreren en te isoleren, waarna deze werden geanalyseerd met MALDI-TOF-massaspectrometrie.Zoals beschreven in dit videoartikel, worden hier de MALDI-TOF MS-gegenereerde spectra voor eureka coli getoond met een logaritmische score van 1,86. Rechts daarvan staan de eerste vijf matches die door de typeringssoftware zijn geïdentificeerd. Let op dat de soort consistent wordt gerapporteerd als re coli met een score van 1,861.Aangezien de top vijf matches E. coli zijn, wordt de identificatie als betrouwbaar beschouwd op soortniveau. De door MALDI-TOF MS gegenereerde spectra voor Pseudomonas aerogenes worden hier getoond. De logaritmische score is 2,216; rechts staan de eerste vijf matches die door de typeringssoftware zijn geïdentificeerd.Let op dat de soort consequent wordt gerapporteerd als pseudomonas aerogen met een hoge score van 2,216. De identificatie wordt als betrouwbaar beschouwd tot op soortniveau. De MALDI-TOF MS-gegenereerde spectra voor een gemengde bloedkweekbouillon die esia coli en SIO marsens bevatten, zijn hier rechts weergegeven; dit zijn de eerste vijf matches van de typeringssoftware, die zowel Reiki coli als SIO marsan rapporteert.In de eerste vijf overeenkomende spectra. Dit gemengde gen wordt slechts in ongeveer een derde van de gemengde bouillonculturen geïdentificeerd. Deze tabel vat de eerder gepubliceerde resultaten samen uit de verificatiestudie van deze methode, waarbij 91,8% van de monomicrobiële bouillons een MALDI-score van minder dan 1,7 behaalde, met een concordantie van respectievelijk 100% voor het genus en 97% voor de soort.Na het bekijken van deze video moet u een goed beeld hebben van hoe u een positief bloedkweekflesje voorbereidt voor identificatie met behulp van MALDI-TOF. Door deze methode te volgen, kunnen we hetzelfde pellet dat voor bacteriële identificatie is voorbereid, gebruiken om een meer gestandaardiseerd inoculum te maken voor geautomatiseerde gevoeligheidstesten. Deze techniek stelt laboratoria bijvoorbeeld in staat om clinici een vroege diagnose te bieden, wat een potentiële impact kan hebben op de behandeling.Vergeet niet dat het werken met bloedkweekflessen gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, waaronder het gebruik van een biologische veiligheidskast bij het manipuleren van bloedkweekflessen.

rapid-identification-gram-negative-bacteria-from-blood-culture-broth

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een snelle bacteriële pellet bereiding van een positieve bloedkweek kan worden gebruikt als een monster voor toepassingen zoals identificatie door MALDI-TOF, Gram-kleuring, antibiotica gevoeligheidstesten en PCR-gebaseerde test. De resultaten kunnen snel worden meegedeeld aan artsen om de uitkomst van patiënten die lijden aan infecties in het bloed te verbeteren.

Voorbereiding van een Bloed Cultuur Pellet voor snelle identificatie van bacteriën en antibiotica gevoeligheid testen

Dit werk beschrijft procedures voor snelle identificatie van bacteriën met behulp van MALDI-TOF MS. De identificatieprocedures omvatten spectrumverwerving, databaseconstructie en vervolganalyses. Er worden twee identificatiemethoden gepresenteerd, gebaseerd op gelijkeniscoëfficiënt en biomarker-gebaseerde methoden.

Het gebruik van MALDI-TOF-massaspectrometrie en een aangepaste database te Bacteriën inheemse karakteriseren naar een unieke Cave Milieu (Kartchner Caverns, AZ, USA)

Matrix-ondersteunde laserdesorptie/ionisatie tijd-van-vlucht massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) en moleculaire technieken (16S rRNA gen sequencing) maken de identificatie van zeldzame bacteriële pathogenen in routine diagnostische mogelijkheden. Het doel van dit protocol ligt in de combinatie van beide technieken, wat leidt tot meer nauwkeurige en betrouwbare gegevens.

Identificatie van bijzondere bacteriële pathogenen door 16S rRNA Gene Sequencing en MALDI-TOF MS

Massa-spectrometrie gebaseerde phyloproteomics (MSPP) werd gebruikt om een verzameling van Campylobacter jejuni ssp typen. Doylei isoleert De stam in vergelijking met multilocus volgorde typen (MLST).

subtypering van<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Isolaten, met behulp massaspectrometrie-gebaseerde PhyloProteomics (MSPP)

IDBac is een open-source massaspectrometrie gebaseerde bioinformatica pijpleiding die gegevens van zowel intact eiwit en gespecialiseerde metaboliet spectra, verzameld op celmateriaal geschuurd uit bacteriële kolonies integreert. De pijpleiding stelt onderzoekers in staat om snel honderden tot duizenden bacteriële kolonies in putatieve taxonomische groepen te organiseren en ze verder te differentiëren op basis van gespecialiseerde metaboliet productie.

Met behulp van de open-source MALDI TOF-MS IDBac pijpleiding voor analyse van microbiële eiwitten en gespecialiseerde metaboliet gegevens

Hier presenteren we een protocol voor de snelle identificatie van eiwitten geproduceerd door genomisch gesequencede pathogene bacteriën met behulp van MALDI-TOF-TOF tandem massaspectrometrie en top-down proteomische analyse met in eigen huis ontwikkelde software. Metastabieuze eiwitionen fragmenteren vanwege het asparaginezuureffect en deze specificiteit wordt gebruikt voor eiwitidentificatie.

Identificatie van antibacteriële immuniteitseiwitten in Escherichia coli met behulp van MALDI-TOF-TOF-MS/MS en top-down proteomische analyse

Een nieuwe monstervoorbereidingsmethode wordt gedemonstreerd voor de analyse van op agar gebaseerde, bacteriële macrokolonies via matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatiebeeldvorming massaspectrometrie.

Onderzoek naar microbiële samenwerking via beeldvorming massaspectrometrie analyse van bacteriekolonies gekweekt op agar en in weefsel tijdens infectie

EUCAST heeft een protocol voor directe antimicrobiële gevoeligheidstests (AST) ontwikkeld voor geautomatiseerde bloedculturen. De afhankelijkheid van op massaspectrometrie gebaseerde microbiële identificatie kan echter worden vermeden door gebruik te maken van een direct protocol voor de bereiding van inoculum in een geautomatiseerd microbieel identificatiesysteem. Deze aanpak kan AST-rapporten opleveren binnen 24 uur na monsterafname.

Directe microbiële identificatie met behulp van een geautomatiseerd microbieel identificatiesysteem om de EUCAST RAST-methode zonder massaspectrometrie te vergemakkelijken

Dit protocol maakt een snelle, kosteneffectieve evaluatie van de microbiële samenstelling in zuivelproducten mogelijk door culturomics te combineren met MALDI-TOF MS. Het levert taxonomieresultaten die vergelijkbaar zijn met 16S rRNA-sequencing met een kortere doorlooptijd dan traditionele kweekmethoden.

Evaluatie van de microbiële veiligheid van zuivelfabrieken met behulp van bacteriële proteomische profilering via de MALDI-benadering

Een snelle protocol voor de directe identificatie van Enterococcus faecalis en Enterococcus andere soorten uit een positieve bloedkweek met behulp van een Peptide Nucleic Acid fluorescente in situ hybridisatie assay (PNA FISH).

Een 1,5 uur Procedure voor de identificatie van Enterococcus Soorten Rechtstreeks van bloedkweken

Leer een snelle identificatiemethode voor Gram-negatieve bacteriën uit bloedkweekbouillon met MALDI-TOF massaspectrometrie. Dit protocol versnelt de diagnose van bloedstroominfecties en ondersteunt tijdige antimicrobiële therapie.

Snelle identificatie van Gram-negatieve bacteriën van Blood Culture Bouillon Met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie

Meer video's verkennen