Name: Live cell imaging van primaire Rat Neonatale Cardiomyocytes Na Adenovirale en Lentiviral Transduction via confocale draaiende schijf Microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Leer live cell imaging van primaire rat neonatale cardiomyocyten na lentivirale en adenovirale transductie met confocale draaiende schijfmicroscopie. Deze methode maakt real-time observatie van eiwitdynamiek in levende hartcellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Dr. Alengo Nyamay'antu en Dr. Ilse Timmerman bedanken voor hun adviezen over lentiviraal verpakken. Dit werk wordt ondersteund door een American Heart Association Scientist Development Grant 10SDG4170137.

<ol><li>Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+the+preparation+of+homogeneous+cultures+of+isolated+heart+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells.</a> Experimental cell research. 53, 1-10 (1968).</li>
<li>Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+toxicity+of+allylamine+and+acrolein+in+cultured+myocytes+and+fibroblasts+from+neonatal+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart.</a> Toxicology. 56, 107-117 (1989).</li>
<li>MacGregor, R. R., Klein, R. M., Bansal, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+plasminogen+activator+activity+from+neonatal+rat+heart+cells+is+regulated+by+hormones+and+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Secretion of plasminogen activator activity from neonatal rat heart cells is regulated by hormones and growth factors.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 752, 331-342 (1995).</li>
<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+and+cellular+cardiology%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> Journal of molecular and cellular cardiology. 51, 288-298 (2011).</li>
<li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> The American journal of physiology. , 271-1250 (1996).</li>
<li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+genetic+manipulation+of+adult+cardiac+myocytes+for+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging.</a> J Vis Exp. 31 (31), (2009).</li>
<li>Xu, X., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+adult+rat+heart+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture of adult rat heart myocytes.</a> J Vis Exp. 28 (28), (2009).</li>
<li>Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+isolation+procedure+for+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+biochemistry+and+biophysics%22%5BJournal%5D)">An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes.</a> Cell biochemistry and biophysics. 61, 93-101 (2011).</li>
<li>Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+primary+culture+of+cardiomyocyte+from+neonatal+mice.+In+vitro+cellular+%26+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Animal%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro cellular & developmental biology.</a> Animal. 44, 45-50 (2008).</li>
<li>Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Neonatal+Mouse+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes.</a> J Vis Exp. 79 (79), (2013).</li>
<li>Kass-Eisler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+determination+of+adenovirus-mediated+gene+delivery+to+rat+cardiac+myocytes+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Quantitative determination of adenovirus-mediated gene delivery to rat cardiac myocytes in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 11498-11502 (1993).</li>
<li>Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+heart+gene+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+gene+medicine%22%5BJournal%5D)">The evolution of heart gene delivery vectors.</a> The journal of gene medicine. 13, 557-565 (2011).</li>
<li>Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMetzger%2C+JM+%22Cardiac+Cell+and+Gene+Transfer%3A+Principles%2C+Protocols%2C+and+Applications%22">Cardiac Cell and Gene Transfer: Principles, Protocols, and Applications</a>. , Humana Press. Totowa, N.J. (2003).</li>
<li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+for+delivery+of+genes+into+neonatal+and+adult+ventricular+cardiac+myocytes+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+research+in+cardiology%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo.</a> Basic research in cardiology. 97, 348-358 (2002).</li>
<li>Bonci, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced%27+generation+lentiviruses+as+efficient+vectors+for+cardiomyocyte+gene+transduction+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Advanced' generation lentiviruses as efficient vectors for cardiomyocyte gene transduction in vitro and in vivo.</a> Gene therapy. 10, 630-636 (2003).</li>
<li>Murakami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FGF+system+has+a+key+role+in+regulating+vascular+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">The FGF system has a key role in regulating vascular integrity.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 3355-3366 (2008).</li>
<li>Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinning-disk+confocal+microscopy+--+a+cutting-edge+tool+for+imaging+of+membrane+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+structure+and+function%22%5BJournal%5D)">Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic.</a> Cell structure and function. 27, 349-355 (2002).</li>
<li>Adams, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-speed+multispectral+spinning-disk+confocal+microscope+system+for+fluorescent+speckle+microscopy+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%22%5BJournal%5D)">A high-speed multispectral spinning-disk confocal microscope system for fluorescent speckle microscopy of living cells.</a> Methods (San Diego, Calif. 29, 29-41 (2003).</li>
<li>Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinning-disk+microscopy+systems.+Cold+Spring+Harbor+protocols%29%5BTitle%5D)+AND+%222010%2C+pdb+top88%2C+doi%3A10.1101%2Fpdb.top88%22%5BJournal%5D)">Spinning-disk microscopy systems. Cold Spring Harbor protocols).</a> 2010, pdb top88, doi:10.1101/pdb.top88. , (2010).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43, 25-30 (2007).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> J Vis Exp. 32 (32), (2009).</li>
<li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. 63 (63), 10-3791 (2012).</li>
<li>Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Packaging+HIV-+or+FIV-based+lentivector+expression+constructs+and+transduction+of+VSV-G+pseudotyped+viral+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs and transduction of VSV-G pseudotyped viral particles.</a> J Vis Exp. 62 (62), 10-3791 (2012).</li>
<li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic acids research. 30, (2002).</li>
<li>Erbacher, P., Roche, A. C., Monsigny, M., Midoux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+role+of+chloroquine+in+gene+transfer+into+a+human+hepatoma+cell+line+by+DNA%2Flactosylated+polylysine+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes.</a> Experimental cell research. 225, 186-194 (1996).</li>
<li>McSharry, J., Benzinger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+purification+of+vesicular+stomatitis+virus+by+polyethylene+glycol+%27precipitation%27%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Concentration and purification of vesicular stomatitis virus by polyethylene glycol 'precipitation'.</a> Virology. 40, 745-746 (1970).</li>
<li>Wulff, N. H., Tzatzaris, M., Young, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monte+Carlo+simulation+of+the+Spearman-Kaerber+TCID50%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical%22%5BJournal%5D)">Monte Carlo simulation of the Spearman-Kaerber TCID50.</a> Journal of clinical. 2, 10-1186 (2012).</li>
<li>Kaerber, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaerber%2C+G+%22Beitrag+zur+kollektiven+Behandlung+pharmakologischer+Reihenversuche.+In%3A+Beitrag+zur+kollektiven+Behandlung+pharmakologischer+Reihenversuche.+162%22">Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. In: Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. 162</a>. , Springer. Berlin, 480–483. (1931).</li>
<li>Sakurai, T., Tsuchida, M., Lampe, P. D., Murakami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+FGF+signaling+is+required+for+Cx43+phosphorylation+and+cardiac+gap+junction+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte FGF signaling is required for Cx43 phosphorylation and cardiac gap junction maintenance.</a> Experimental cell research. 319, 2152-2165 (2013).</li>
<li>Ueno, H., Gunn, M., Dell, K., Tseng, A., Williams, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+truncated+form+of+fibroblast+growth+factor+receptor+1+inhibits+signal+transduction+by+multiple+types+of+fibroblast+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">A truncated form of fibroblast growth factor receptor 1 inhibits signal transduction by multiple types of fibroblast growth factor receptor.</a> The Journal of biological chemistry. , 267-1470 (1992).</li>
<li>Li, Y., Basilico, C., Mansukhani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+transformation+by+fibroblast+growth+factors+can+be+suppressed+by+truncated+fibroblast+growth+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Cell transformation by fibroblast growth factors can be suppressed by truncated fibroblast growth factor receptors.</a> Molecular and cellular biology. 14, 7660-7669 (1994).</li>
<li>Murakami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-dependent+regulation+of+VEGF+receptor+2+expression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">FGF-dependent regulation of VEGF receptor 2 expression in mice.</a> The Journal of clinical investigation. 121, 2668-2678 (2011).</li>
<li>Bazan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractility+assessment+in+enzymatically+isolated+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+reviews%22%5BJournal%5D)">Contractility assessment in enzymatically isolated cardiomyocytes.</a> Biophysical reviews. , 231-2310 (2012).</li>
<li>Clark, W. A., Rudnick, S. J., Simpson, D. G., LaPres, J. J., Decker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+adult+cardiac+myocytes+maintain+protein+synthetic+capacity+of+intact+adult+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Cultured adult cardiac myocytes maintain protein synthetic capacity of intact adult hearts.</a> The American journal of physiology. , 264-573 (1993).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Primaire cardiomyocyten geïsoleerd uit neonatale ratten lang gebruikt om cardiomyocyten functies te bestuderen in vitro. Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van neonatale cardiomyocyten van jonge ratten met een tweestaps enzymdigestie werkwijze eerst digereren met trypsine O / N bij 4 ° C en daarna gezuiverd collagenase. Een voordeel van het gebruik van het gezuiverde collagenase stap is dat dezelfde graad van enzym wordt gebruikt voor alle isolaties. Aldus, de kwaliteit en de hoeveelheid geïs...

Primaire cardiomyocyten van neonatale ratten zijn lang gebruikt voor het onderzoeken cardiomyocyt-functie in vitro 1. Ze zijn gemakkelijk te isoleren van jonge ratten door verschillende gevestigde methoden 2-4. De meest voorkomende methode maakt gebruik van collagenase of trypsine om bindweefsel van het hart voorafgaand aan celisolatie verteren. Onderzoekers hebben ook werkwijzen voor het isoleren cardiomyocyten van volwassen knaagdieren 5-8 en neonatale muizen 9,10. Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van hartspiercellen van pasgeboren pups rat, waarbij een twee-staps enzymdigestie procedure. Trypsine wordt eerst gebruikt O / N bij 4 ° C en daarna gezuiverd collagenase bij 37 ° C. Incubatie van het hartweefsel met trypsine O / N bij 4 ° C vermindert de nodige oogst cellen vergeleken met methoden waarbij opeenvolgende incubaties in een warme enzymoplossing 2. Bovendien, met gezuiverde collagenase plaats ruwe enzymen, kan veel te veel variabiliteit worden geëlimineerd, waardoor verbeterde reproduceerbaarheid. Functionele studies van een bepaald eiwit gebruiken vaak een eiwitexpressie systeem met een adenovirus 11-13 en / of 14-16 lentivirus. [VOORZICHTIGHEID] De virale productie en manipulatie moet worden uitgevoerd volgens de NIH richtlijnen. Het adenovirus niet integreren in het gastheergenoom. Het heeft een zeer hoge efficiëntie van transductie in de meeste celtypen, waaronder delende cellen en niet-delende cellen, en primaire cellen en gevestigde cellijnen. Dit maakt het adenovirus een betrouwbare vector voor genexpressie. Hoge niveaus van de proteïne gecodeerd door het adenovirus vector ontwikkelen binnen 48 uur na transductie, en ze kunnen enkele weken 17. Echter, een nadeel van een adenovirus voor eiwitexpressie is dat de ontwikkeling van een recombinant adenovirus is zowel gecompliceerd en tijdrovend. Dit nadeel verklaart ten dele waarom veel onderzoekers zijn zich tot lentiviruses voor recombinante genexpressie. In tegenstelling tot adenovirale constructen, het genereren van een lentivirale construct is snel en eenvoudig. Hoewel lentivirussen zijn algemeen lagere efficiëntie van transductie dan adenovirussen, zowel delende als niet-delende cellen, ze integreren in het gastheergenoom. Bijgevolg expressie van het getransduceerde gen stabieler lentivirussen dan adenovirussen. Door de technologische ontwikkelingen op het gebied van microscopie, is het veel gemakkelijker om levende cellen beelden van cellen die recombinante eiwitten vangen. Dit geldt ook bij video rate snelheden van de overname. Hierdoor kan de onderzoeker bepalen hoe bepaalde veranderingen in het eiwit van belang functioneel beïnvloeden de cel in real time. De confocale draaiende schijf microscoop heeft een aantal belangrijke functies die het een optimale techniek voor liv makene cell imaging 18,19. De Yokogawa draaiende schijf zorgt voor veel sneller beeldacquisitie, terwijl tegelijkertijd gebruik veel minder laservermogen dan point confocale microscopen. Beide speciale functies worden door de draaiende schijf, die tal confocale gaten waardoor de laser passeert gelijktijdig de monsters bevat. Tijdens acquisitie, de schijf zelf draait snel en continu 18-20. Door het autofocussysteem van de microscoop, als stabiel nadruk gehandhaafd gedurende lange tijd. Dit stelt onderzoekers in staat om goed gerichte live cell beelden nemen. Verkregen beelden worden afgespeeld als een filmbestand. De beelden worden geanalyseerd met behulp van beeldanalyse-software zoals ImageJ 21,22, FIJI 23, of andere in de handel verkrijgbare software.

<table><tbody><tr><td>1 Scissors for decapitation</td><td>WPI</td><td>501749</td><td>Autoclave voor gebruik</td></tr><tr><td>1 Fijne schaar voor hartisolatie en hakken</td><td>WPI</td><td>14393</td><td>Autoclave voor gebruik</td></tr><tr><td>2 Fijne pincetten (Dumont Nr. 5)</td><td>Sigma</td><td>F6521</td><td>Autoclave voor gebruik</td></tr><tr><td>3 Gesteriliseerde plastic schaaltjes van 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Voor hartisolatie</td></tr><tr><td>3.5 cm glazen bodemcultuurschaaltjes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>Voor het uiteindelijke plateren van cardiomyocyten voor toekomstige live-cel beeldvorming. Micro-Dishes van ibidi zijn een acceptabel alternatief.</td></tr><tr><td>3.5 cm glazen bodemcultuurschaaltjes</td><td>MatTek</td><td>P35G-0.17-14-C</td><td>Voor TIRF of hoge resolutie afbeelding</td></tr><tr><td>Ethanol oplossing, 70% (v/v) in water</td><td>Sigma</td><td>E7148</td><td></td></tr><tr><td>2% Gelatine</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>1 Gesteriliseerd plastic schaaltje van 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Voor trypsinisatie</td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Elk merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7543</td><td></td></tr><tr><td>Twee plastic cellencultuurschaaltjes van 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Voor selectie</td></tr><tr><td>Autopipet</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-300</td><td>Voor trituratie</td></tr><tr><td>Cell counter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellometer, geautomatiseerde cell counter</td><td>nexcelom</td><td></td><td>Om cellen te controleren en te tellen</td></tr><tr><td>Microscoop en hematocytometer</td><td>Elk merk</td><td></td><td>Om cellen te controleren en te tellen</td></tr><tr><td>Trypanblauw oplossing, 0,4%</td><td>invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-19AIC</td><td></td></tr><tr><td>Incuberende orbitale schudder</td><td>Sigma</td><td>Z673129</td><td>Om hartweefsel te schudden met collagenase bij 37 &deg;C bij 170-200 rpm</td></tr><tr><td>10 mg/ml BrdU oplossing</td><td>BD Pharmingen</td><td>550891</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hoge glucose</td><td>invitrogen</td><td>41965039</td><td>Meng medium zoals aangegeven in het protocol en verwarm voor gebruik</td></tr><tr><td>MEM</td><td>invitrogen</td><td>31095029</td><td>Meng medium zoals aangegeven in het protocol en verwarm voor gebruik</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine (10.000 U/ml)</td><td>invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sectie 2 Lentivirale transductie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 Packaging plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene</td><td>12251</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>De lentivirale transfer vector, pLVX-IRES-Puro</td><td>Clontech</td><td>632183</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (serumvrij medium)</td><td>invitrogen</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Transfectie reagens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>polyethyleenimine&ldquo;Max&rdquo;, (MW 40.000) - High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25.000 in Free Base Form)</td><td>Polysciences</td><td>24765-2</td><td>Kan worden vervangen door X-tremeGENE 9 van Roche</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365779001</td><td>vervanger voor PEI als transfectie reagens</td></tr><tr><td>Chloroquine</td><td>Sigma</td><td>C6628</td><td>Oplossen in water en maak 100 mM stock oplossing. Remming van endosomale acidificatie kan worden bereikt met 10-100 µM Chloroquine.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Luer-Lok spuit, gesteriliseerd</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>0.45 µm filters</td><td>Sigma</td><td>F8677</td><td>Gebruik alleen cellulose acetaat of polyethersulfone (PES) (lage proteïne binding) filters. Gebruik geen nitrocellulose filters. Nitrocellulose bindt oppervlakte-eiwitten op de lentivirale envelop en vernietigt het virus.</td></tr><tr><td>Hexadimethyleenbromide</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>Oplossen in water en maak 8 mg/ml stock oplossing, en filter het vervolgens om te steriliseren.</td></tr><tr><td>Polyethyleenglycol 6.000</td><td>Sigma</td><td>81260</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Sectie 3 Adenovirale transductie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Enkele cellencultuurschaaltjes van 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td></td></tr><tr><td>96-Well microplaat met deksel, platte bodem, weefselcultuur, steriel</td><td>BD Falcon</td><td>353072</td><td>Voor titratie</td></tr><tr><td>Meerkanaals pipet, 10-100 µl, 8-kanaals</td><td>eppendorf</td><td>3122 000.035</td><td></td></tr><tr><td>Sectie 4 Live-cel beeldvorming</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinning disk confocale microscopie</td><td>PerkinElmer</td><td>L7267000</td><td></td></tr><tr><td>Een temperatuur gecontroleerde kamer</td><td>Elk merk</td><td></td><td>Om de temperatuur op 37 &deg;C te houden</td></tr><tr><td>Een CO2 omgevingssysteem</td><td>Elk merk</td><td></td><td>Optioneel om de CO2 concentratie optimaal te houden</td></tr><tr><td>CO2 Onafhankelijk medium, geen glutamine</td><td>invitrogen</td><td>18045-054</td><td>Voor lange tijd time-lapse beeldvorming</td></tr><tr><td>DMEM, hoge glucose, HEPES, geen fenolrood</td><td>invitrogen</td><td>21063-029</td><td>Voor lange tijd time-lapse beeldvorming</td></tr></tbody></table>

live cell imaging van primaire rat neonatale cardiomyocytes na adenovirale en lentiviral transduction via confocale draaiende schijf microscopie

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primaire rat neonatale cardiomyocyten zijn nuttig in de basis in vitro cardiovasculair onderzoek, omdat zij gemakkelijk kunnen worden geïsoleerd in grote aantallen in een enkele procedure. Door de vooruitgang in microscoop technologie is het relatief eenvoudig om levende cellen beelden vast te leggen voor de onderzoeken cellulaire gebeurtenissen in realtime met minimale zorgen over fototoxiciteit aan de cellen. Dit protocol beschrijft hoe levende cellen timelapse beelden van primaire rat neonatale cardiomyocyten te nemen met behulp van een confocale draaiende schijf microscoop volgende lentivirale en adenovirale transductie om eigenschappen van de cel moduleren. De toepassing van twee verschillende soorten virussen vergemakkelijkt een passend transductie snelheid en expressieniveaus voor twee verschillende genen bereiken. Nou gericht levende cellen beelden kunnen worden verkregen met behulp van de microscoop autofocus systeem, dat stabiel aandacht onderhoudt gedurende lange perioden. De toepassing van deze methode, de functies van exogeen ingenieured eiwitten tot expressie in gekweekte primaire cellen kunnen worden geanalyseerd. Bovendien kan dit systeem worden gebruikt om de functie van genen te onderzoeken door het gebruik van siRNA en chemische modulatoren.

Om de techniek, een lentivirus codering EGFP (versterkt groen fluorescerend eiwit) gemerkte Cx43 (Connexin43) of gemuteerde Cx43 32 werd gebruikt om EGFP-gemerkte eiwitten tot expressie in cellen en een adenovirus dat codeert FGFR1DN (fibroblast groeifactor receptor 1 dominant negatief illustreren ) werd gebruikt om gesloten FGF signalering in de cel 33-35. Drie dagen na het isoleren van hartspiercellen werden de geïsoleerde cardiomyocyten getransduceerd met lentivirus om EGFP-gemerkte eiwitten tot...

Dit protocol beschrijft een methode voor live celbeeldvorming met behulp van primaire neonatale rattencardiomyocyten na lentivirale en adenovirale transductie met behulp van confocale spinning disk microscopie. Dit maakt gedetailleerde observaties van cellulaire processen in levende cardiomyocyten mogelijk.

Live cell imaging van primaire Rat Neonatale Cardiomyocytes Na Adenovirale en Lentiviral Transduction via confocale draaiende schijf Microscopie

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

Het algemene doel van deze procedure is het verkrijgen van time-lapsebeelden van primaire neonatale cardiomyocyten van ratten na lentivirale en adenovirale transductie met behulp van confocale spinning disc-microscopie. Dit wordt bereikt door eerst cardiomyocyten uit ratpupjes te oogsten en de cellen uit te plaaten op schaaltjes met een glazen bodem. De volgende stap is het uitvoeren van de transductie van EGFP-getagd Conexion 43 via lentivirus, gevolgd door transductie van dominant negatief fgfr via adenovirus in de cardiomyocyten.De laatste stap is het verkrijgen van time-lapse beelden met behulp van confocale spinning disc microscopie. Uiteindelijk kan er een film worden gegenereerd op basis van de verkregen time-lapse beelden. Deze toont de distributie van het EGFP-gelabelde eiwit, tot expressie gebracht door lentivirale genen in levende primaire cardiomyocyten onder gewijzigde celcondities door een adenoviraal tot expressie gebracht eiwit dominant negatief fgfr one.Een van de belangrijkste voordelen van deze techniek is dat live-cell time-lapse imaging kan worden uitgevoerd met een spinning disk confocale microscoop onder een gewenste conditie na genexpressie geïnduceerd door

live-cell-imaging-primary-rat-neonatal-cardiomyocytes-following

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Volwassen hartspiercellen zijn primaire cellen die kunnen worden geïsoleerd uit dierlijke harten en gekweekt voor meerdere dagen. Binnen deze cultuur periode adenovirale gentransfer kan gebruikt worden om genetisch gecodeerd biosensoren (GEBS) of TL-fusie-eiwitten uit te drukken. Beide benaderingen laten cellulaire onderzoeken door middel van confocale microscopie.

Isolatie en genetische manipulatie van Adult hartspiercellen voor confocale Imaging

Hier ontwikkelen we de instrumenten die nodig zijn voor...

Ex vivo Live-Imaging van Single Cell Divisies in Muis neuroepithelium

Primaire muis cardiomyocytkweken is een van de cruciale instrumenten voor het onderzoek myofibrillar inrichting en functie. Het volgende protocol beschrijft de isolatie en de cultuur van primaire cardiomyocyten van neonatale muis harten. De resulterende cardiomyocytkweken kunnen vervolgens worden gebruikt voor een verscheidenheid van biomechanische, biochemische en celbiologische assays.

Isolatie en cultuur van de Neonatale Mouse Cardiomyocytes

De isolatie van neonatale rat cardiomyocyten is een tijdrovende en onvoorspelbare procedure. Deze studie beschrijft methoden voor cryoconservering en ontdooien van neonatale rat cardiomyocyten die een efficiënter gebruik van cellen mogelijk maken. De ontdooide NRCM's kunnen worden gebruikt voor verschillende experimenten zonder dat elke keer isolatie nodig is.

Isolatie en cryopreservatie van de neonatale rat Cardiomyocytes

Dit protocol beschrijft een stapsgewijze methode voor de reproduceerbare isolatie en langdurige kweek van volwassen muis-cardiomyocyten met een hoge opbrengst, zuiverheid en levensvatbaarheid.

Isolatie, Cultuur en Transductie van Adult Mouse Cardiomyocytes

We beschrijven een protocol voor het volumetrisch afbeelden van met fluorescente eiwitten gelabelde cellen diep in intacte embryonale en postnatale harten. Door gebruik te maken van weefselklaringsmethoden in combinatie met gehele montagekleuring, kunnen enkele met fluorescente eiwitten gelabelde cellen in een embryonaal of postnataal hart duidelijk en nauwkeurig worden afgebeeld.

Imaging Ontruimde embryonale en postnatale Hearts bij Single-cell Resolution

Om celdeling te onderscheiden van variaties in de celcyclus in cardiomyocyten, presenteren we protocollen met behulp van twee transgene muislijnen: Myh6-H2B-mCh transgene muizen, voor de ondubbelzinnige identificatie van cardiomyocytenkernen, en CAG-eGFP-anillin muizen, voor het onderscheid tussen celdeling en variaties in de celcyclus.

Visualisatie van celcyclus Variaties en Bepaling van Nucleatie in Postnatale Cardiomyocytes

Dit manuscript beschrijft een stapsgewijs protocol voor het genereren en kwantificeren van diverse geherprogrammeerde hartsubtypen met behulp van een retrovirus-gemedieerde levering van Gata4, Hand2, Mef2c en Tbx5.

Het beoordelen van Cardiomyocyte Subtypen Na transcriptie Factor-gemedieerde herprogrammeren van muis embryonale fibroblasten

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie, transfectie, en de lange termijn cultuur van volwassen muis en rat cardiomyocyten.

Isolatie, transfectie, en lange termijn cultuur van volwassen muis en rat cardiomyocyten

Hier presenteren we een methode voor het onderzoeken van neurietmorfogenese in postnatale muis retinale explantaten door time-lapse confocale microscopie. We beschrijven een aanpak voor schaarse etikettering en acquisitie van retinale celtypen en hun fijne processen met behulp van recombinante adeno-geassocieerde virusvectoren die membraangerichte fluorescerende eiwitten op een Cre-afhankelijke manier tot expressie brengen.

Time-lapse beeldvorming van neuronale arborisatie met behulp van schaarse Adeno-geassocieerde virusetikettering van genetisch gerichte retinale celpopulaties

Er wordt een reeks protocollen gepresenteerd die de meting van de contractiele functie beschrijven via sarcomeerlengtedetectie samen met calcium (Ca2+) voorbijgaande meting in geïsoleerde rattenmyocyten. De toepassing van deze aanpak voor studies in diermodellen van hartfalen is ook inbegrepen.

Analyse van cardiale contractiele disfunctie en Ca2+ transiënten in knaagdiermyocyten

Leer live cell imaging van primaire rat neonatale cardiomyocyten na lentivirale en adenovirale transductie met confocale draaiende schijfmicroscopie. Deze methode maakt real-time observatie van eiwitdynamiek in levende hartcellen mogelijk.

Live cell imaging van primaire Rat Neonatale Cardiomyocytes Na Adenovirale en Lentiviral Transduction via confocale draaiende schijf Microscopie (Video) | JoVE Journal

Live cell imaging van primaire Rat Neonatale Cardiomyocytes Na Adenovirale en Lentiviral Transduction via confocale draaiende schijf Microscopie

Meer video's verkennen