Modellering Stroke in Muizen: Permanente Coagulatie van de distale midden cerebrale slagader
31 juli 2014
Verschillende muismodellen van midden cerebrale slagader occlusie (MCAO) worden veel gebruikt in experimenteel onderzoek hersenen. Hier tonen we het model van transcraniële permanente distale MCAO die consistent zijn corticale infarct van een omvang die overeenkomt met die door de meerderheid van de menselijke ischemische beroertes schade veroorzaakt.
Het algemene doel van deze procedure is om een permanente occlusie van de distale middelste hersenslagader van een muis te veroorzaken, met een resulterend infarct dat zich voornamelijk in de cortex bevindt en qua omvang relatief vergelijkbaar is met menselijke beroertes. Dit wordt bereikt door eerst de baseline voor asymmetrie in het gebruik van de ledematen vóór de operatie vast te stellen. De volgende stap van de procedure is het uitvoeren van de operatie voor de inductie van de beroerte door middel van elektrocoagulatie van de distale middelste hersenslagader.
Na de chirurgische ingreep worden focale sensomotorische tekorten getest door de asymmetrie in het gebruik van de vier ledematen te scoren. De laatste stap is het analyseren van het infarctvolume met behulp van kristalvioletkleuring. Uiteindelijk zijn de resulterende corticale laesies van gemiddelde grootte met een geringe variatie, waardoor deze techniek een waardevol model is voor fundamenteel en translationaal onderzoek naar beroertes.
De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van andere gangbare berotemodellen zijn de minimale mortaliteit, het infarctvolume en de lokalisatie. De neocortex vertegenwoordigt de meerderheid van de menselijke beroertes en deze methode is zeer reproduceerbaar. Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn met deze methode in eerste instantie moeite hebben met de voorzichtige verwijdering van de schedel om mechanische letsels te minimaliseren.
Ten tweede is de correcte identificatie en juiste correlatie van de distale middelste hersenslagader cruciaal voor dit model. Injecteer eerst 30 minuten voor aanvang van de operatie analgetica. Zet de warmtedeken voor de muis aan en stel deze in op 37 °C voor de operatie.
Zorg vervolgens dat het anesthesiegas bestaande uit 70% stikstof, 30% zuurstof en isofluraan gereedstaat. Stel de muis vervolgens bloot aan 4% isofluraan in een inductiekamer totdat deze stopt met bewegen. Plaats de muis daarna op het warmtekussen en dien gedurende nog één minuut 4% isofluraan toe.
Na een minuut wordt de isofluoraan-toedieningssnelheid gewijzigd naar 1,5%. Controleer nu of de muis voldoende is geanestheseerd middels een knijptest in de teen; indien dit het geval is, worden de ogen met een schaar behandeld met ethanol. Begin de operatie met een incisie van één centimeter tussen het oor en het oog. Scheid de huid en identificeer de musculus temporalis.
Stel nu op de hoogfrequentiegenerator de functie in op coagulatie, de modus op bipolair en het vermogen op 12 watts, en bevestig de pincet. Voeg tijdens de preparatie een druppel zoutoplossing toe aan de blootgelegde temporele spier. Gebruik vervolgens de elektrocoagulatiepincet om de temporele spier bij de apicale en distale delen los te maken van de schedel.
Het resultaat is een losgemaakte spierlap. Identificeer nu de arteria cerebri media of MCA onder de transparante schedel. Deze bevindt zich in het rostrale deel van het temporale gebied, dorsaal van de sinus retroorbitalis.
Gebruik een boor om het bot direct boven deze arterie te verdunnen totdat het doorzichtig is. Houd de schedel tijdens het boren vochtig met behulp van fysiologisch zout. Verwijder nu met zeer fijne pincetten voorzichtig het bot om de MCA-tak bloot te leggen.
Stel de hoogfrequentiegenerator in op zeven watt. Coaguleer nu de arterie met de elektrocoagulatietang door deze voorzichtig aan te raken zonder vast te grijpen. Coaguleer de arterie zowel proximaal als distaal ten opzichte van de bifurcatie; in het geval van een anatomische variatie zonder bifurcatie van de MCA, coaguleer de arterie zo proximaal mogelijk op twee plaatsen, ongeveer één millimeter uit elkaar na de coagulatie.
Wacht 30 seconden en raak vervolgens de arterie voorzichtig aan met botte pincetten. Verplaats daarna de spier terug naar de positie waar deze het boorgat bedekt. Hecht de wond en plaats het dier in een herstelbox bij 32 graden Celsius om bij te komen van de anesthesie, en breng het vervolgens terug naar de kooi.
Over het algemeen duurt het vijf tot 10 minuten voordat het dier zich heeft hersteld van de anesthesie. Met de cilindertest wordt gecontroleerd of er een voorkeur is voor de ene ledemaat boven de andere. Plaats het dier in een transparante cilinder van acrylglas, geflankeerd door twee spiegels in een rechte hoek.
Film het dier gedurende vijf minuten tegenover de vertex van de twee spiegels aan de andere zijde van de cilinder. Veeg na elke proef de cilinder en het tafelblad af met 60% ethanol. Voer later een frame-voor-frame-analyse uit.
Kwantificeer de assay door het contact van één van de vier poten met de cilinder tijdens het volledig rechtopstaan te tellen, en tel daarnaast het landen op één van de vier ledematen. Na een score voor het volledig rechtopstaan, minimaal 20 contacten van één van de vier ledematen per trial cryosectie, elk brein serieel in secties van 20 micrometer dik, genomen met intervallen van 400 micrometer. Verzamel de secties op objectglazen voor bewaring bij minus 20 graden Celsius.
Met dit sectieprotocol kunnen alle coupes die het infarctgebied van één brein bestrijken, op één objectglas worden geplaatst. Kleur de coupes met een standaard kristalviolet-protocol om het gebied van het geïnfarceerde weefsel van elke breinsectie af te bakenen. De objectglazen kunnen vervolgens worden gemonteerd, gescand en geanalyseerd met de Swanson-methode voor oedeem.
De gecorrigeerde mortaliteit als gevolg van de MCA-occlusiechirurgie was minder dan 5%, voornamelijk door subarachnoïdale bloedingen of incorrecte anesthesie. Er zijn geen dieren overleden tijdens de periode. Voor deze analyse voor PA-gebruik werd de asymmetrie gemeten met de cilindertest na de inductie van het infarct; in vergelijking met de baselinewaarden die vóór de MCA-occlusie waren verkregen, werd na 24 uur een significante asymmetrie van de ledematen vastgesteld, die gedurende de eerste week na het infarct gedeeltelijk herstelde.
Inductie van het infarct in voltri met kristalvioletkleuring resulteerde in een gemiddeld infarctvolume van 15,4 kubieke millimeter, wat ongeveer 12% van één hersenhemisfeer vertegenwoordigt. De standaarddeviatie van dit model is zeer laag. Bovendien vertoonde de locatie van het infarct minimale variabiliteit.
Eenmaal opgezet, kan deze handeling binnen 10 minuten worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Naast de gedemonstreerde cilindertests en de kristalvioletkleuring kunnen andere gevestigde gedragstests en histologische methoden worden gebruikt om de uitkomst verder te karakteriseren en specifieke onderzoeksvragen te beantwoorden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een permanente distale MCA-occlusie bij muizen uitvoert.
Wij raden dringend aan om standaardprocedures en gedetailleerde documentatie te gebruiken om de reproduceerbaarheid van de methode te waarborgen.
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het uitvoeren van een permanente occlusie van de distale middelste hersenslagader (MCAO) bij muizen, wat resulteert in een consistent corticaal infarct dat vergelijkbaar is met ischemische beroertes bij mensen. De techniek is waardevol voor zowel fundamenteel als translationeel onderzoek naar beroertes vanwege de reproduceerbaarheid en het minimale mortaliteitspercentage.
Belangrijkste Onderdeel van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschap
- Beroerteonderzoek
- Diermodellen
Achtergrond
- Occlusie van de middelste hersenslagader (MCAO) is een veelgebruikt model voor het bestuderen van ischemische beroertes.
- Dit model maakt het mogelijk om corticale infarcten in een gecontroleerde omgeving te onderzoeken.
- Het begrijpen van beroertemechanismen bij muizen kan inzichten verschaffen die toepasbaar zijn op menselijke aandoeningen.
- Reproduceerbaarheid en lage mortaliteitscijfers vergroten het nut van dit model in het onderzoek.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode aan te tonen voor het induceren van permanente MCAO bij muizen.
- Om de resulterende grootte van het corticale infarct en de relevantie hiervan voor menselijke beroertes te beoordelen.
- Om de gedragsmatige uitkomsten na de chirurgie te evalueren met behulp van tests voor asymmetrie in het gebruik van de ledematen.
Gebruikte methoden
- Bepaling van de baseline-asymmetrie in het gebruik van de ledematen voorafgaand aan de operatie.
- Electrocoagulatie van de distale arteria cerebri media om een beroerte op te wekken.
- Postoperatieve beoordeling van sensorimotorische tekortkomingen met behulp van de cilindertest.
- Analyse van het infarctvolume via kristalvioletkleuring van hersendoorsneden.
Belangrijkste resultaten
- Het gemiddelde infarctvolume bedroeg 15,4 kubieke millimeter, wat ongeveer 12% van één hersenhelft vertegenwoordigt.
- Er werd een significante asymmetrie van de ledematen vastgesteld 24 uur na de operatie, waarbij in de daaropvolgende week een gedeeltig herstel werd waargenomen.
- Het model vertoonde een lage variabiliteit in de locatie en grootte van het infarct.
- De mortaliteit als gevolg van de procedure was minder dan 5%, voornamelijk door subarachnoïdale bloedingen of anesthesiefouten.
Conclusies
- De beschreven MCAO-methode is effectief voor het bestuderen van ischemische beroertes bij muizen.
- Het biedt een reproduceerbaar model met minimale mortaliteit en consistente resultaten.
- Gedragstesten en histologische analyses kunnen de effecten van de beroerte verder karakteriseren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Dit model maakt reproduceerbare corticale infarcten bij muizen mogelijk met een lage mortaliteit, wat bijdraagt aan mechanische risicoreductie bij de validatie van stroke-doelen. De grootte en locatie van het infarct komen overeen met de humane stroke-pathologie, wat de translationele relevantie voor preklinische therapeutische evaluaties vergroot. Gedragsmatige en histologische read-outs leveren kwantitatieve eindpunten voor go/no-go-beslissingen in vroege discovery-pipelines.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken in corticale slagpaden met een hoge anatomische relevantie voor menselijke ziekten.
- Operationele waarde: Een lage variabiliteit in infarctvolume en -locatie verhoogt het vertrouwen in beoordelingen van target-engagement en padmodulatie.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de preklinische triage door vertraagde pathofysiologische mechanismen te modelleren, zoals inflammatie, angiogenese en neuronale plasticiteit.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Produceert gestandaardiseerde corticale laesies die geschikt zijn voor consistente screening van verbindingen en dosis-respons evaluatie.
- Kwantitatieve resultaten: Meting van het infarctvolume via cresylvioletkleuring maakt objectieve, histomorfometrische analyse vanbehandelingseffecten mogelijk.
- Schaalbaarheid: De chirurgische procedure is in minder dan 10 minuten voltooid met een minimale mortaliteit, wat een hogere doorvoer in discovery-workflows ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: De overhand van corticale infarcten weerspiegelt de meerderheid van de menselijke ischemische beroertes, wat het voorspellende vertrouwen voor klinische translatie verbetert.
- Mechanistische continuïteit: Faciliteert de studie naar subacute en chronische beroertepaden, inclusief regeneratie en plasticiteit over uitgebreide observatieperioden.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Een lage mortaliteit en een hoge reproduceerbaarheid verminderen de biologische variabiliteit, waardoor betrouwbaardere preklinische beoordelingen van werkzaamheid en veiligheid mogelijk zijn.
Integratie van Pipeline en Workflow
Het model past binnen het continuüm van beroerte-onderzoek, van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinisch efficiëntieonderzoek, in het bijzonder voor therapieën gericht op corticale beschadiging en herstelmechanismen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van neuroprotectieve en neurorestauratieve verbindingen in een klinisch relevant infarctmodel.
- Screening: Maakt gestandaardiseerde infarctgeneratie mogelijk voor een consistente evaluatie van de effecten van verbindingen op de progressie van laesies.
- Analytics: Cresylviolet-kleuring en de cilindertest bieden complementaire histologische en functionele read-outs voor dosis-respons- en tijdverloopanalyses.
- Translational Research: Modelleert vertraagde pathofysiologische processen die relevant zijn voor subacute en chronische interventievensters bij beroertes.
- Enterprise Reuse: Gestandaardiseerde chirurgische en analytische procedures maken reproduceerbaarheid tussen projecten en het delen van het platform tussen neurowetenschappelijke teams mogelijk.
Operationele & Enterprise impact
- Wetenschappelijke waarde: Hoge anatomische en pathofysiologische getrouwheid aan de menselijke beroerte verhoogt het vertrouwen in de validatie van targets.
- Operationele waarde: Minimale mortaliteit en een lage variabiliteit van het infarct verbeteren de reproduceerbaarheid van de assay en verminderen het aantal dieren per experiment.
- Strategische waarde: Maakt vroegtijdige identificatie van biologisch actieve verbindingen mogelijk, waardoor het risico op falen in een laat stadium van beroertenprogramma's wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de datagestuurde prioritering van targets op basis van consistente modulatie van de infarctgrootte en functioneel herstel.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microsurgische technieken en de identificatie van intracraniële vaten.
- Afhankelijk van electrocoagulatie-apparatuur en nauwkeurige vermogensinstellingen voor arteriële occlusie.
- Vereist gestandaardiseerde anesthesie- en postoperatieve zorgprotocollen om variabiliteit te minimaliseren.
- Aanpassing aan transgene modellen vereist validatie van de chirurgische haalbaarheid en de consistentie van het infarct.
- Histologische analyse vereist gestandaardiseerde coupesnij- en kleuringsprotocollen voor een betrouwbare infarctkwantificering.
