Focus Formation: A-cel gebaseerde test om de oncogene potentiaal van een Gene bepalen
31 december 2014
De Focus Formation Assay verschaft een eenvoudige methode om de transformerende potentieel van een kandidaat oncogen beoordelen.
Het algemene doel van deze procedure is om de focusvormingstest uit te voeren in muisfibroblastcellijnen, met behulp van een retrovirus om het oncogeen potentieel van een gen te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst de sequentie voor het gen van belang in een retroviraal vector te klonen. De tweede stap is om retrovirale deeltjes te produceren met behulp van de virale vector en PLA e-verpakkingscellen.
Vervolgens wordt het retrovirus gebruikt om NIH drie T drie muisfibroblastcellen te infecteren om het transformerende potentieel van het gen van belang te beoordelen. De laatste stap is om de NIH drie T drie-cellen twee tot drie weken te laten delen, gevolgd door kristallen violetkleuring om het aantal gevormde foci te kwantificeren. Uiteindelijk wordt de focusvormingstest gebruikt om aan te tonen of overexpressie van een gen van belang voldoende is om dichtheidsonafhankelijke groei in muisfibroblastcellen te induceren.
Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van de kankerbiologie te beantwoorden, zoals het screenen op het oncogeen potentieel van een gen. Om te beginnen, maak de virale vector zoals beschreven in het tekstprotocol. Maak vervolgens plat E-cultures van bevroren cellen door plat E-cellen snel te ontdooien in een waterbad van 37 graden Celsius en vervolgens over te brengen naar een kegelbuis van 15 milliliter.
Voeg langzaam negen milliliter PLA E-medium toe aan de kegelbuis van 15 milliliter. Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten bij 180 keer G en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de cellen met 10 milliliter plat E-medium en breng over naar een 10 centimeter kweekschaal.
Vervolgens incubeer de cellen in een incubator van 37 graden Celsius met 5% CO2 tot ze tussen de 80 en 90% confluent zijn. Deel de cellen op door eerst het medium af te zuigen, vervolgens de cellen één keer te wassen met PBS voordat je twee milliliter 0,05% tripsine EDTA toevoegt en gedurende één minuut op kamertemperatuur incubeert, los de cellen door op de bodem te tikken. Voeg vervolgens 10 milliliter plat E-medium toe en breng de celsuspensie over naar een 15 milliliter buis.
Centrifugeer de buis zoals eerder en resuspendeer de cellen met 10 milliliter plat E-medium. Zaai vervolgens 2 miljoen cellen per 10 centimeter kweekschaal met plat E-medium zonder antibiotica en laat de cellen een nacht incuberen. De volgende dag breng 300 microliter optimum over naar een microbuisje van 1,5 milliliter.
Voeg 27 microliter polyethyleenamine toe aan de voorbereide buis met Optum. Meng voorzichtig door op de bodem te tikken en incubeer gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Voeg vervolgens negen microgram transfectiegradig plasmide-DNA toe aan de buis, meng voorzichtig door te vortexen en incubeer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.
Voeg vervolgens het mengsel druppelsgewijs toe aan de plat E-schaal voordat je een nacht incubeert. De volgende dag zuig het medium met het transfectiemiddel af en voeg 10 milliliter vers plat E-medium toe voordat je de cellen terugbrengt naar de incubator om NIH drie T drie-cultures te vestigen. Ontdooi eerst snel de cellen in een waterbad van 37 graden Celsius en breng over naar een 15 milliliter buis.
Voeg langzaam negen milliliter NIH drie, T drie-medium toe aan de cellen, centrifugeer de buis gedurende vijf minuten bij 180 keer G en gooi het supernatant weg. Resuspendeer vervolgens de cellen met 10 milliliter NIH drie, T drie-medium en breng over naar een 10 centimeter kweekschaal. Incubeer de cellen in een incubator van 37 graden Celsius met 5% CO2, houd ze onder confluent aangezien de frequentie van spontane transformatie toeneemt.
Zodra een cultuur co-fluentie bereikt, zaai drie keer 10 tot de vijfde nih, drie T drie-cellen per 10 centimeter schaal en incubeer een nacht voor infectie de volgende dag. De volgende dag oogst je het retrovirale supernatant van de plat E-schaal door het met een wegwerpspuit van 10 milliliter te verzamelen, het door een nylon membraanfilter met een poriëngrootte van 0,45 micron te filteren en het over te brengen naar een 15 milliliter buis. Voeg 10 milliliter vers plat E-medium toe aan de cellen voordat je ze terugbrengt naar de incubator.
Zuig vervolgens het medium van de te infecteren NIH drie T dree-celschaal af en voeg vijf milliliter regulier NI H drie, T drie-medium en vijf milliliter virusbevattend gefilterd supernatant toe. Voeg vervolgens polybrein toe aan de schaal. Voeg een concentratie van zes microgram per milliliter toe.
Incubeer de cellen een nacht voordat je de infectiestappen herhaalt voor een tweede ronde infectie. Na infectie, vervang het virus, bevattend medium met regulier IH drie T drie-medium. Laat de IH dree T drie-cellen twee tot drie dagen groeien, vervang het medium zo nodig voor kristallen violetkleuring.
Zuig het NIH drie T dree-medium af en plaats de schalen op ijs. Was de schalen twee keer met ijskoud PBS. Fixeer de cellen met ijskoud methanol gedurende 10 minuten.
Verwijder vervolgens de schalen van het ijs en zuig het methanol af. Voeg drie milliliter 0,5% kristallen violetoplossing gemaakt in 25% methanol toe en incubeer de schalen gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Na incubatie zuig je de kristallen violetoplossing af en spoel de schaal voorzichtig af met Milli Q-water totdat er geen kleur meer loskomt.
Laat de schalen onbedekt een nacht op een werkblad drogen. Zodra de schalen droog zijn, gebruik een liniaal om de foci te meten en tel die groter zijn dan vijf millimeter in diameter. Het getal MXD drie is een basiek helix-loop-helix leucine zipper transcriptiefactor die een atypisch lid is van de MAD-familie, en het is gemeld dat het betrokken is bij carcinogenese in vergelijking met de negatieve controle en de positieve controle.
De NIH drie T dree-schalen waarin MXD drie overexpressie vertoonde, hadden significant minder foci. De gegevens werden verzameld uit meerdere experimenten om de significantie te bepalen en dezelfde trends werden waargenomen uit deze test. De resultaten suggereren dat MXD d
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
De Focus Formation Assay is een methode die wordt gebruikt om het oncogene potentieel van een gen te evalueren door het vermogen ervan om groei te induceren in fibroblastcellen van muizen te beoordelen. Deze assay maakt gebruik van retrovirale vectoren om het gen van belang in de cellen te introduceren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Oncologie
- Celbiologie
- Genetica
Achtergrond
- De focusvormingsassay helpt bepalen of een gen ongecontroleerde celgroei kan bevorderen.
- Cellijnen van muis-fibroblasten worden doorgaans gebruikt voor dergelijke assays.
- Retrovirussen zijn effectieve instrumenten voor genoverdracht in zoogdiercellen.
- Kristalvioletkleuring is een standaardmethode voor het kwantificeren van celgroei.
Doel van de studie
- Om het transformerend potentieel van kandidaat-oncogenen te beoordelen.
- Om het vermogen van een gen om dichtheidsonafhankelijke groei te induceren te evalueren.
- Om een eenvoudige methodologie te bieden voor het testen van oncogenen.
Gebruikte methoden
- Kloneren van het gen van belang in een retrovirale vector.
- Produceren van retrovirale particles met behulp van packaging-cellen.
- Infecteren van NIH 3T3 muis-fibroblastcellen met het retrovirus.
- De cellen laten groeien en vervolgens kleuren met kristalviolet.
Belangrijkste resultaten
- De assay kwantificeert het aantal foci dat door geïnfecteerde cellen wordt gevormd.
- Overexpressie van het gen kan leiden tot dichtheidsonafhankelijke groei.
- De resultaten duiden op het oncogene potentieel van het geteste gen.
- Deze methode biedt een duidelijke visuele weergave van celtransformatie.
Conclusies
- De Focus Formation Assay is effectief voor het evalueren van oncogenen.
- Het demonstreert het vermogen van genen om tumorigenische eigenschappen te induceren.
- Deze assay kan een waardevolle tool zijn in kankeronderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
De Focus Formation Assay biedt een functionele readout voor oncogeen potentieel door dichtheidsonafhankelijke groei in NIH 3T3-cellen te meten, wat vroege targetvalidatie in oncologisch onderzoek mogelijk maakt. Door de vorming van foci te kwantificeren, ondersteunt de assay het mechanistische de-risking van kandidaatgenen voordat er middelen worden ingezet voor lead-identificatie. Deze aanpak vergroot het voorspellend vertrouwen bij de selectie van targets en informeert triagebeslissingen voor de portfolio in preklinische oncologische pipelines.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door te testen of gen-overexpressie transformatiephenotypes induceert.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van retrovirale transductie voor efficiënte en biosafe genlevering in zoogdiercellen.
- Voorspellende waarde: Maakt functionele beoordeling van oncogene activiteit mogelijk, onafhankelijk van genomische annotaties.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert kwantificeerbare, gekleurde foci die gemeten en geteld kunnen worden met behulp van gestandaardiseerde beeldvorming.
- Reproduceerbaarheid: Ondersteunt consistente resultaten over verschillende experimenten wanneer de celconfluentie en infectieparameters gecontroleerd worden.
- Schaalbaarheid: Compatibel met multi-well formaten voor medium-throughput screening van genbibliotheken.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Modelleert een belangrijk kenmerk van maligniteit — het verlies van contactinhibitie — binnen een gedefinieerde genetische achtergrond.
- Mechanische risicoreductie: Maakt onderscheid tussen oncogenen en niet-transformerende genen, zoals aangetoond door de reductie van focusvorming bij overexpressie van MXD3.
- Translationele continuïteit: Verbindt in vitro transformatie met in vivo tumorigenisch potentieel, ter ondersteuning van go/no-go-beslissingen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot lead-identificatie en levert functioneel bewijs dat biochemische en genetische screens aanvult.
- Discovery Biology: Test of whether een gen fenotypische transformatie kan aansturen, ter ondersteuning van de validatie van signaalpaden en targets.
- Screening: Levert kwantitatieve, op beelden gebaseerde resultaten voor het beoordelen van het transformerend potentieel van verschillende genkandidaten.
- Analytics: Maakt statistische vergelijking van foci-aantallen tussen experimentele en controlecondities mogelijk om de significantie te bepalen.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt cellulaire transformatiefenotypes met tumorigenisch potentieel, wat bijdraagt aan preklinische vooruitgang.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor oncogen-screening dat kan worden aangepast voor verschillende projecten en teams.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt mechanistisch inzicht in genfunctie door overexpressie te koppelen aan fenotypische transformatie.
- Operationele waarde: Standardiseert de beoordeling van transformatie via retrovirale aflevering en kristalviolet-kwantificering.
- Strategische waarde: Vermindert het biologische risico bij de selectie van targets door oncogeen potentieel in een vroeg stadium van de ontdekking te bevestigen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van targets op basis van functionele transformatiegegevens.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de productie van retrovirale vectoren en praktijken voor biosafety level 2.
- Afhankelijk van toegang tot packaging-cellen (bijv. PlatE) en filtratieapparatuur voor viraal supernatant.
- Maakt standaardisatie van het tijdstip van infectie, de zaaidichtheid van de cellen en de kleuringsprotocollen tussen gebruikers noodzakelijk.
- Aanpassing aan andere cellijnen kan optimalisatie van de transductie-efficiëntie en selectiemarkers vereisen.
- Beperkt tot adherente, contact-geinhibeerde cellijnen; niet geschikt voor niet-transformeerbare culturen of suspensieculturen.
