Name: Focus Formation: A-cel gebaseerde test om de oncogene potentiaal van een Gene bepalen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Leer de focus formatie assay om oncogene potentieel van genen te bepalen met behulp van retrovirale transductie in NIH 3T3 muizenfibroblasten. Deze methode kwantificeert celtransformatie via kristalviolet kleuring.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de NIH directeur Nieuwe Innovator Award Program (ED). AA werd mede ondersteund door undergraduate awards van het National Cancer Institute en de National Science Foundation.

1. Het maken van de virale vectoren De coderende sequenties voor het gen van belang, evenals de positieve en negatieve controles, worden in pBABEpuro ingevoegd traditionele kloneringsmethoden (PCR amplificatie, restrictie digestie en ligatie). Er zijn vier restrictieplaatsen van de vector waarin het DNA kan worden ingebracht: BamHI, SnaBI, EcoRI en Sali. <ol><li> Bereid transfectie-grade plasmide-DNA van competente cellen met behulp van de QIAGEN plasmide midi kit. </li><li> Meet DNA-concentratie met behulp van een NanoDrop2000 spectrofotometer. </li></ol> 2. Retrovirus Production De Plat-E verpakkingscellijn wordt gebruikt om ecotropische retrovirus dat levert het cDNA van belang NIH 3T3 cellen. <ol><li> Oprichting van Plat-E Culturen van bevroren cellen <ol><li> Snel ontdooien Plat-E cellen in een 37 ° C waterbad en naar een 15 ml conische buis. Voeg langzaam 9 ml Plat-E medium (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% foetaal runderserum (FBS) + penicilline en streptomycine). </li><li> Centrifugeer de buis bij 180 x g gedurende 5 min en gooi het supernatant. </li><li> Re-schorten de cellen met 10 ml Plat-E medium en transfer naar een 10 cm cultuur schotel. </li><li> Incubeer de cellen in een 37 ° C, 5% CO2 incubator tot ze 80-90% confluent (ongeveer 2 dagen). </li></ol></li><li> Cel splitsen <ol><li> Zuig het medium en was cellen eenmaal met PBS. </li><li> Voeg 2 ml van 0,05% trypsine-EDTA en incubeer gedurende 1 min bij kamertemperatuur. </li><li> Maak de cellen door de vinger te tikken, voeg 10 ml Plat-E medium, en breng de celsuspensie aan een 15 ml buis. </li><li> Centrifugeer de buis bij 180 x g gedurende 5 min en gooi het supernatant. </li><li> Resuspendeer de cellen met 10 ml Plat-E medium en zaden ze nieuwe schotels 1: 4-1: 6 verdunningen. </li></ol></li><li> Plat-E Zaaien en Transfection <ol><li> Zaad 2 x 10 6cellen per 10 cm cultuur schotel met behulp van Plat-E medium zonder antibiotica. </li><li> Incubeer de cellen O / N in een 37 ° C, 5% CO2 incubator. </li><li> De volgende dag, overdracht 300 pi Opti-MEM in 1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Voeg 27 ul van polyethyleenimine (PEI), een rendabele transfectie reagens 12 naar de voorbereide buis met Opti-MEM. Meng voorzichtig door vinger tikken en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 9 ug transfectie-grade plasmide DNA in Opti-MEM / PEI tube, meng vortex en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg de DNA / PEI complex druppelsgewijs in de Plat-E schotel en incubeer O / N bij 37 ° C, 5% CO2. </li><li> De volgende dag, zuig het medium dat de transfectiereagens en voeg 10 ml vers Plat-E medium (zonder antibiotica). </li><li> Zet de cellen in de incubator. </li></ol></li></ol> 3. NIH 3T3-cellen en Infectie <ol><li> Oprichting van NIH3T3 culturen en zaaien <ol><li> Snel ontdooien NIH 3T3 cellen in een 37 ° C waterbad en naar een 15 ml buis. Voeg langzaam 9 ml NIH 3T3 medium (DMEM + 10% FBS). </li><li> Centrifugeer de buis bij 180 x g gedurende 5 min en gooi het supernatant. </li><li> Resuspendeer de cellen met 10 ml NIH 3T3 medium overgebracht in een 10 cm kweekschaal. </li><li> Incubeer de cellen in een 37 ° C, 5% CO2 incubator. Het is zeer belangrijk dat NIH 3T3-cellen altijd bewaard underconfluent (50-60%), de frequentie van spontane transformatie (en dus basale niveaus van foci vorming) toeneemt wanneer een kweek confluentie bereikt. </li><li> Zaad 3 x 10 5 cellen per 10 cm schaal en incubeer O / N voor infectie werden de volgende dag. </li></ol></li><li> Infectie <ol><li> Oogst de retrovirale supernatant van de Plat-E schotel met een 10 ml wegwerpspuit, filtering door een 0,45 urn poriegrootte nylon membraan filter, en over te dragen in een 15 mlbuis. </li><li> Voeg 10 ml vers Plat-E medium aan de cellen (zonder antibiotica), en terug naar de incubator. </li><li> Zuig het medium van de NIH 3T3 cellen schaal besmet en voeg 5 ml normale NIH 3T3 medium en 5 ml van virus-bevattende supernatant gefiltreerd. </li><li> Polybreen Aan de schotel in een concentratie van 6 ug / ml. </li><li> Incubeer de cellen O / N bij 37 ° C, 5% CO2. </li><li> De volgende dag, herhaalt u stap 3.2.1 - 3.2.5 voor een tweede ronde van de infectie. </li><li> Vervang de virus-bevattend medium met regelmatige NIH 3T3 medium. </li><li> Laat de NIH 3T3 cellen groeien gedurende 2-3 weken, vervangt het medium nodig. Controleer expressie van het eiwit van interesse door conventionele eiwit elektroforese en immunoblot van lysaten van gehele cellen uit kopie platen. </li></ol></li></ol> 4. kleuring en kwantificering <ol><li> Crystal Violet kleuring <ol><li> Zuig het NIH 3T3 medium en plaats de gerechtenop ijs. </li><li> De afwas tweemaal met ijskoude PBS. </li><li> Fixeer de cellen met ijskoude methanol gedurende 10 min. </li><li> Verwijder de gerechten van ijs, zuigen de methanol en 3 ml 0,5% kristalviolet oplossing bereid in 25% methanol (RT). </li><li> Incubeer de gerechten gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Zuig het kristalvioletoplossing en zorgvuldig spoel de schaal met Milli-Q H 2 O tot er geen kleur komt uit in de spoeling. </li><li> Laat de gerechten te drogen O / N op een tafelmodel (open). </li></ol></li><li> Brandpunten Kwantificering <ol><li> Zodra de gerechten zijn droog, gebruik een liniaal om de donker gekleurde collecties van cellen op het bord te meten. Alleen tellen die meer dan 5 mm in diameter zijn &quot;brandpunten&quot;. Noteer het aantal foci en bereken gemiddelden en de betekenis vergeleken met de controles. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+assays+for+Ras+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Biological assays for Ras transformation.</a> Methods in enzymology. , 255-395 (1995).</li>
<li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCelis%2C+JE+%22Cell+biology+%3A+a+laboratory+handbook%22">Cell biology : a laboratory handbook</a>. , 3rd edn, Elsevier Academic. 345-352 (2006).</li>
<li>Raptis, L., Vultur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoplastic+transformation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Neoplastic transformation assays.</a> Methods in molecular biology. 165, 151-164 (2001).</li>
<li>Johnson, P. J., Coussens, P. M., Danko, A. V., Shalloway, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpressed+pp60c-src+can+induce+focus+formation+without+complete+transformation+of+NIH+3T3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Overexpressed pp60c-src can induce focus formation without complete transformation of NIH 3T3 cells.</a> Molecular and cellular biology. 5, 1073-1083 (1985).</li>
<li>Bonner, T. I., Kerby, S. B., Sutrave, P., Gunnell, M. A., Mark, G., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+biological+activity+of+human+homologs+of+the+raf%2Fmil+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22IMolecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Structure and biological activity of human homologs of the raf/mil oncogene.</a> IMolecular and cellular biology. 5, 71400-71407 (1985).</li>
<li>Yancopoulos, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-myc+can+cooperate+with+ras+to+transform+normal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">N-myc can cooperate with ras to transform normal cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 5455-5459 (1985).</li>
<li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+activity+of+purinergic+receptor+P2Y%2C+G+protein+coupled%2C+8+revealed+by+retroviral+expression+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+lymphoma%22%5BJournal%5D)">Transforming activity of purinergic receptor P2Y, G protein coupled, 8 revealed by retroviral expression screening.</a> Leukemia & lymphoma. 48, 978-986 (2007).</li>
<li>Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plat-E%3A+an+efficient+and+stable+system+for+transient+packaging+of+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses.</a> Gene. 7, 1063-1066 (2000).</li>
<li>Morgenstern, J. P., Land, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+mammalian+gene+transfer%3A+high+titre+retroviral+vectors+with+multiple+drug+selection+markers+and+a+complementary+helper-free+packaging+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line.</a> Nucleic acids research. 18, 3587-3596 (1990).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+bioanalytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 397, 3173-3178 (2010).</li>
<li>Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+5%27+and+3%27+long+terminal+repeat+promoter+function+in+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Comparison of 5' and 3' long terminal repeat promoter function in human immunodeficiency virus.</a> Journal of virology. 68, 3830-3840 (1994).</li>
<li>Fukumoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective+gene+transfection+by+DNA+compaction+at+pH+4.0+using+acidified%2C+long+shelf-life+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine.</a> Cytotechnology. 62, 73-82 (2010).</li>
<li>Fox, E. J., Wright, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-phase-specific+expression+of+the+Mad3+gene+in+proliferating+and+differentiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">S-phase-specific expression of the Mad3 gene in proliferating and differentiating cells.</a> The Biochemical journal. 359, 361-367 (2001).</li>
<li>Yun, J. S., Rust, J. M., Ishimaru, T., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+of+the+Mad+family+member+Mad3+in+cerebellar+granule+neuron+precursor+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">A novel role of the Mad family member Mad3 in cerebellar granule neuron precursor proliferation.</a> Molecular and cellular biology. 27, 8178-8189 (2007).</li>
<li>Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mad3+negatively+regulates+B+cell+differentiation+in+the+spleen+by+inducing+Id2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression.</a> Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).</li>
<li>Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cerebellar+proliferation+to+tumorigenesis%3A+new+insights+into+the+role+of+Mad3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3.</a> Cell cycle. 7, 423-427 (2008).</li>
<li>Barisone, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+MXD3+in+proliferation+of+DAOY+human+medulloblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells.</a> PloS One. 7, e38508(2012).</li>
<li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112, 193-205 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De FFA biedt een snelle en eenvoudige methode om maligne transformatie in vitro evalueren. Het is vatbaar voor screening van een relatief groot aantal kandidaat-genen, en zijn bescheiden technische eisen maken het kosten-effectief is. Verder kunnen twee of meer genen co-expressie (soms aangeduid als een &quot;samenwerking&quot; assay) om de tumorigene potentieel van de combinatie te evalueren. De voordelen van deze bepaling afhankelijk zijn eenvoudige techniek, het gemak van kwantificering en de relatief korte ...

Tumorcellen kunnen worden onderscheiden van hun normale tegenhangers diverse wijzigingen van patronen van genexpressie te epigenomics morfologische en proliferatieve veranderingen. Onder de laatste, verminderde afhankelijkheid van serum, verlies van contact (dichtheid) remming, de verwerving van verankering-onafhankelijke proliferatie en, uiteindelijk, het vermogen om tumoren te vormen wanneer geïnjecteerd in dieren zijn nuttig meetbare maligne transformatie 3. Verschillende in vitro en in vivo assays zijn ontwikkeld voor cellulaire transformatie. In vitro assays gericht op het identificeren en meten van veranderingen in cultuur morfologie (focusformatie assay), kweek dynamica (groeisnelheid, verzadiging dichtheid) en groeifactor (groei verminderde serum) of ankerplaats (groei in zachte agar) eisen. De gouden standaard voor het bepalen van kwaadaardige karakter van een celtype blijft tumorvorming (xenografts) bij proefdieren. Echter, thij kost en de lengte van in vivo studies ze niet altijd te rechtvaardigen als een eerste validatie stap of de screening van kandidaat oncogenen maken. Hoewel er geen in vitro test geeft een duidelijke beoordeling van de oncogene potentieel van een gen, ze geven inzicht in oncogene potentieel dat kan een beperking van de toekomst in vivo studies. Eén van de meest gebruikte systemen voor de evaluatie oncogeen potentieel in vitro is het Focus Formatie Assay 2. Deze aanpak berust op het gebruik van NIH 3T3 muis fibroblast, een niet-getransformeerde cellijn die sterk contactremming toont. Overexpressie van een oncogen resulteert in het verlies van de dichtheid-afhankelijke groei; getransformeerde cellen kunnen dan in meerdere lagen, vormen &quot;foei&quot;, gemakkelijk gevisualiseerd tegen de achtergrond monolaag van niet getransformeerde cellen. De Focus Formation Assay, dan meet het vermogen van een kandidaat oncogen maligne transformatie induceren, zoals blijkt door het verlies van contact inhibvulle als meetbaar fenotype. De FFA is gebruikt voor transformatie evalueren door overexpressie van eiwitkinasen (bv Src 4, BRAF 5), transcriptiefactoren (bijvoorbeeld N-myc 6), G-eiwit gekoppelde receptoren (bv P2RY8 7) en GTPases (bv Ras 1), onder anderen. Het relatieve gemak van deze test maakt het een goede keuze die een snelle en visueel duidelijk antwoord of overexpressie van het gen is voldoende om NIH 3T3 muis fibroblast cellen te transformeren in vitro biedt. De in dit protocol beschreven FFA gebruikt de Plat-E inpakcellijn 8, die virale verpakking eiwitten levert, en de retrovirale vector pBABEpuro 9 (Addgene plasmide 1764) aan retrovirus produceren. Na transfectie met pBABEpuro construct dat het gen van belang, de Plat-E cellijn ecotropische retrovirus dat kan worden gebruikt om NIH 3T3 cellen te infecteren. Tzijn virale Werkwijze genafgifte efficiënter is dan traditionele chemische transfectie methoden en biedt een manier om duurzame expressie van het gen 10. Eenmaal opgenomen in het genoom van de NIH 3T3 cellen, wordt overexpressie van het gen van belang aangestuurd door de virale lange eindstandige herhalingen (LTR) promoter 11. Deze constante expressie kan worden vastgesteld of het betreffende gen heeft oncogene activiteit zoals gemeten door de vorming van foci op NIH 3T3 cellen.

<table><tbody><tr><td>pBABE-puro vector</td><td>Addgene</td><td>Plasmid 1764</td><td>kloneringsvector</td></tr><tr><td>Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic</td><td>Cell Biolabs, Inc.</td><td>RV-101</td><td>cellijn voor virale productie</td></tr><tr><td>NIH 3T3 Cell Line murine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93061524</td><td>cellijn voor focusvormingstest</td></tr><tr><td>10 ml BD Luer-Lok tip spuit</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td>reagens voor virale productie</td></tr><tr><td>0.45 &mu;m Puradisc Spuitfilter</td><td>Whatman</td><td>6750-2504</td><td>reagens voor virale productie</td></tr><tr><td>Polyethylenimine (PEI)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966-2</td><td>reagens voor celtransfectie</td></tr><tr><td>Polybrene Infectie / Transfectiereagens</td><td>EMD Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td>reagens voor celtransfectie</td></tr><tr><td>Kristalviolet</td><td>Fisher Scientific</td><td>C581-25</td><td>reagens voor celkleuring</td></tr><tr><td>Plasmid Plus Midi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12945</td><td>plasmide-zuivering</td></tr><tr><td>BD Falcon weefselkweekschalen</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td>celkweekbenodigdheden</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>celkweekmedium</td></tr><tr><td>0.05% Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>celkweekbenodigdheden</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>celkweekmedium</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>celkweekmedium</td></tr></tbody></table>

focus formation: a-cel gebaseerde test om de oncogene potentiaal van een gene bepalen

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Maligne transformatie van cellen wordt meestal geassocieerd met verhoogde proliferatie, verlies van contactremming, verwerving van verankeringsonafhankelijk groeipotentieel en het vermogen om tumoren te vormen in experimentele dieren1. In NIH 3T3 cellen is bekend dat de Ras signaaltransductieroute veel van deze gebeurtenissen triggert, wat bekend staat als Ras transformatie. De introductie van een overgeëxprimeerd gen in NIH 3T3 cellen kan morfologische transformatie en verlies van contactremming bevorderen, wat kan helpen om het oncogene potentieel van dat gen van belang te bepalen. Een test die een eenvoudige methode biedt om één aspect van het transformerende potentieel van een oncogene te beoordelen, is de Focus Formation Assay (FFA)2. Wanneer NIH 3T3 cellen normaal in cultuur delen, doen ze dat totdat ze een confluent enkellaags monolaag bereiken. Echter, in aanwezigheid van een overgeëxprimeerd oncogene, kunnen deze cellen beginnen te groeien in dichte, meerlagige foci1 die kunnen worden gevisualiseerd en gekwantificeerd door kristallen violet of Hema 3 kleuring. In dit artikel beschrijven we het FFA protocol met retrovirale transductie van het gen van belang in NIH 3T3 cellen, en hoe de aantallen foci door middel van kleuring te kwantificeren. Retrovirale transductie biedt een efficiëntere methode van genlevering dan transfectie, en het gebruik van een ecotrope muisretrovirus biedt een bioveiligheidscontrole bij het werken met potentiële humane oncogenen.

MXD3 is een basis helix-loop-helix leucine zipper (bHLHZ) transcriptiefactor die lid is van de MYC / MAX / MAD netwerk. Het is een atypisch lid van de familie MAD 13-15, en er is gemeld betrokken bij carcinogenese 16,17. Vergeleken met pBABEpuro (negatieve controle) en MYC (positieve controle), NIH 3T3 gerechten waar MXD3 werd overexpressie significant minder foci (figuur 1A). De gegevens in Figuur 1B werden verzameld op verschillende experimenten significantie te ...

De Focus Formation Assay verschaft een eenvoudige methode om de transformerende potentieel van een kandidaat oncogen beoordelen.

Focus Formation: A-cel gebaseerde test om de oncogene potentiaal van een Gene bepalen

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Het algemene doel van deze procedure is om de focus-vormingassay uit te voeren in muizenfibroblast-cellijnen, waarbij een retrovirus wordt gebruikt om het oncogene potentieel van een gen te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst de sequentie van het gen van belang in een retrovirale vector te kloneren. De tweede stap is het produceren van retrovirale deeltjes met behulp van de virale vector en PLA e packaging-cellen.Vervolgens wordt het retrovirus gebruikt om NIH 3T3-muis fibroblastcellen te infecteren om het transformerend vermogen van het gen van belang te beoordelen. De laatste stap is om de NIH 3T3-cellen twee tot drie weken te laten delen, gevolgd door kleuring met kristalviolet om het aantal gevormde foci te kwantificeren. Uiteindelijk wordt de focusvormingsassay gebruikt om aan te tonen of overexpressie van een gen van belang voldoende is om densiteitsonafhankelijke groei in muis fibroblastcellen te induceren.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de kankerbiologie, zoals het screenen op het oncogene potentieel van een gen. Maak om te beginnen de virale vector zoals beschreven in het tekstprotocol. Stel vervolgens plat E-culturen op vanuit bevroren cellen door plat E-cellen snel te ontdooien in een waterbad van 37 °C en deze vervolgens over te brengen naar een conische buis van 15 mL.Voeg langzaam negen milliliter PLA E-medium toe aan de 15 milliliter conische buis. Centrifugeer de buis bij 180 ×g gedurende vijf minuten en verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in 10 milliliter PLA E-medium en breng deze over naar een 10 centimeter kweekschaal.Incubeer de cellen vervolgens in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 totdat ze een confluentie van 80 tot 90% hebben bereikt. Voer de celsplitsing uit door eerst het medium af te zuigen, waarna de cellen eenmaal met PBS worden gewassen; voeg vervolgens twee milliliter 0,05% tripsin-EDTA toe en incubeer dit gedurende één minuut bij kamertemperatuur, waarna de cellen door voorzichtig tikken tegen de wand worden losgemaakt. Voeg daarna 10 milliliter plat E-medium toe en breng de celsuspensie over naar een buis van 15 milliliter.Centrifugeer de buis zoals voorheen en resuspendeer de cellen in 10 milliliters plat E medium. Zaai vervolgens 2 miljoen cellen per 10 centimeter kweekschaal met plat E medium zonder antibiotica en laat de cellen overnight incuberen. Breng de volgende dag 300 microliters van het optimum over in een 1,5 milliliter microbuisje.Voeg 27 µL polyethyleenamine toe aan de voorbereide buis met Optum. Meng voorzichtig door op de buis te tikken en laat dit vijf minuten incuberen bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 9 µg plasmid DNA van transfectiekwaliteit toe aan de buis, meng voorzichtig door te vortexen en laat dit 15 minuten incuberen bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens het mengsel druppelsgewijs toe aan de plat E-schaal voordat u deze een nacht incubeert. Aspireer de volgende dag het medium dat het transfectiereagens bevat en voeg 10 milliliters vers plat E-medium toe voordat u de cellen terugplaatst in de incubator om NIH three T three-culturen te vestigen. Ontdooi eerst de cellen snel in een waterbad van 37 °C en breng ze over naar een 15 milliliter buis.Voeg langzaam negen milliliter NIH 3, T 3-medium toe aan de cellen, centrifugeer de buis bij 180 ×g gedurende vijf minuten en verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen vervolgens in 10 milliliter NIH 3, T 3-medium en breng ze over naar een kweekschaal van 10 centimeter. Incubeer de cellen in een incubator op 37 °C met 5% CO2 en houd ze subconfluent, aangezien de frequentie van spontane transformatie toeneemt.Zodra een cultuur confluentie bereikt, zaai dan 3 x 10⁵ NIH 3T3-cellen per 10 cm petrischaal en laat deze een nacht incuberen voor infectie op de volgende dag. Oogst de volgende dag het retrovirale supernatant uit de petrischaal met een wegwerpspuit van 10 ml, filtreer dit door een nylon membraanfilter met een poriegrootte van 0,45 µm en breng het over in een buis van 15 ml. Voeg 10 ml vers plat E-medium toe aan de cellen voordat u ze terugplaatst in de incubator.Aspireer vervolgens het medium uit de schaal met NIH 3T3-cellen die geïnfecteerd moet worden en voeg vijf milliliter regulier NIH 3T3-medium en vijf milliliter gefiltreerd supernatant dat virus bevat toe. Voeg daarna polybrene toe aan de schaal. Voeg dit toe in een concentratie van 6 µg/mL.Incubeer de cellen overnight voordat de infectiestappen worden herhaald voor een tweede infectieronde. Vervang na de infectie het virushoudende medium door regulier IH3T3-medium. Laat de IH3T3-cellen twee tot drie dagen groeien, waarbij het medium indien nodig wordt vervangen, gevolgd door kleuring met kristalviolet.Snuif het NIH 3T3-medium af en plaats de schaaltjes op ijs. Was de schaaltjes tweemaal met ijskoud PBS. Fixeer de cellen gedurende 10 minuten met ijskoud methanol.Verwijder vervolgens de schaaltjes uit het ijs en aspireer de methanol. Voeg drie milliliter 0,5% kristalviolet-oplossing toe, bereid in 25% methanol, en laat de schaaltjes vijf minuten incuberen bij kamertemperatuur. Aspireer na incubatie de kristalviolet-oplossing en spoel het schaaltje voorzichtig met Milli Q-water tot er geen kleur meer vrijkomt bij het spoelen.Laat de schaaltjes gedurende de nacht onafgedekt op een werkbank drogen. Zodra de schaaltjes droog zijn, gebruik een liniaal om de foci te meten en tel degene die groter zijn dan vijf millimeter in diameter. Het aantal MXD3 is een basale helix-loop-helix-leucine zipper transcriptiefactor die een atypisch lid is van de MAD-familie, en er is gemeld dat dit betrokken is bij carcinogenese in vergelijking met de negatieve controle en de positieve controle.De NIH 3T3-schalen waarin MXD3 was overgeëxpresseerd, vertoonden significant minder foci. De gegevens werden verzameld uit meerdere experimenten om de significantie te bepalen, waarbij dezelfde trends werden waargenomen in deze assay. De resultaten suggereren dat MXD3 na deze procedure niet functioneert als een oncogen.Andere methoden, zoals de focus-formatie-assay met gencombinaties, groei in soft agar proliferatie en celcyclusanalyse, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de rol van een gen van belang in de pathogenese van oncogenese.

focus-formation-cell-based-assay-to-determine-oncogenic-potential

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Deze video beschrijft een zachte agar kolonievormingstest om de effecten van een PADI-enzymremmer en BB-Cl-amidine op borstkankertumorigeniciteit in vitrote testen. Deze test maakt ook de kwantitatieve beoordeling van het celtransformatiepotentieel in de context van genetische verstoringen mogelijk.

Soft Agar Colony Formation Assay: een methode om effecten van nieuwe verbindingen op de proliferatie van kankercellen te testen

This video describes the colony formation assay, which helps determine lung cancer cells' ability to proliferate indefinitely and form individual colonies. We can analyze the effect of an anticancer agent on the colony-forming cells by analyzing the changes in the number and/or size of the resulting colonies.

Colony Formation Assay: Assessing the Efficacy of Anticancer Agents on Colony-Forming Lung Cancer Cells

This video describes the protocol for methyl cellulose-based colony formation unit or CFU assay, which helps identify and count the number of colonies formed by leukemic cells in response to the treatment with anticancer compounds.

Methyl Cellulose-Based CFU Assay: A Method to Determine the Effect of Anti-cancer Compounds on Colony Formation in Leukemic Cells

Het bereiken van een systeemniveau begrip van cellulaire processen is een doel van de hedendaagse celbiologie. We beschrijven hier strategieën voor multiplexing luciferase reporters van verschillende cellulaire functie eindpunten naar gen-functie met behulp van genoom-schaal RNAi bibliotheken ondervragen.

Een Multiplexed Luciferase-gebaseerde screening Platform voor ondervragen Kanker-geassocieerde signaaltransductie in gekweekte cellen

De zachte agar-kolonievormingstest is een methode die wordt gebruikt om cellulaire ankeronafhankelijke groei in vitro te bevestigen. Het doel van dit protocol is om een strenge methode te illustreren voor de detectie van het tumorigene potentieel van getransformeerde cellen en de tumoronderdrukkende effecten van eiwitten op getransformeerde cellen.

De Soft Agar Kolonie Formatie Assay

Het identificeren van nieuwe geneesmiddeldoelen die overgaan van preklinisch onderzoek naar menselijke proeven is een wetenschappelijke prioriteit. Daartoe beschrijven we hier een functionele genoombenadering voor het onderzoeken van de impact van gendepletie op kankerstamlijnsferoïden, die menselijke kankers beter modelleren in vivo.

Gebruik makend van Functional Genomics Screening om potentieel nieuwe drug targets in Cancer Cell Sferoïde Cultures Identificeer

We hebben een nieuw protocol ontwikkeld voor het bestuderen van heterocellulaire populatie dynamiek in reactie op verstoringen. Dit manuscript beschrijft een beeldvormend platform dat kwantitatieve datasets produceert voor gelijktijdige karakterisering van meerdere cellulaire fenotypen van heterocellulaire populaties op een robuuste manier.

Discriminatie en karakterisering van heterocellulaire populaties met behulp van kwantitatieve beeldvormingstechnieken

We beschrijven hier protocollen voor de validatie van het genetische en chemische van c-Fos en Dusp1 als een drug target in met behulp van in vitro en in vivo genetische en gehumaniseerd Muismodellen leukemie. Deze methode kan worden toegepast op een doelwit voor genetische valideren en therapeutische ontwikkeling.

Methoden voor de evaluatie van de rol van c-Fos en Dusp1 in afhankelijkheid van de oncogen

Dit protocol beschrijft een reproduceerbare methode voor isolatie van muizen rhabdomyosarcoom primaire cellen, tumorsphere vorming en behandeling, en transplantaat transplantatie vanaf tumorspheres culturen.

Tumorsphere afleiding en behandeling van primaire tumor cellen geïsoleerd van de muis Rhabdomyosarcomas

Intrinsiek ongeordende domeinen zijn belangrijk voor de functie van de oncogene fusietranscriptiefactor. Om deze eiwitten therapeutisch te targeten, is een meer gedetailleerd begrip van de regulerende mechanismen die door deze domeinen worden gebruikt, vereist. Hier gebruiken we transcriptomics om belangrijke structurele kenmerken van het intrinsiek ongeordende EWS-domein in Ewing-sarcoom in kaart te brengen.

Het in kaart brengen van de structuur-functierelaties van ongeordende oncogene transcriptiefactoren met behulp van transcriptomische analyse

Dit experimentele protocol biedt een stabiele, kosteneffectieve en efficiënte methode die lncRNA-knockdown combineert met kolonievormende assays om het effect van lncRNA op de proliferatie van osteosarcoomcellen te kwantificeren.

Kolonievormingstest Detecteer de proliferatieve capaciteit van LncRNA-knockdown osteosarcoomcellen

Leer de focus formatie assay om oncogene potentieel van genen te bepalen met behulp van retrovirale transductie in NIH 3T3 muizenfibroblasten. Deze methode kwantificeert celtransformatie via kristalviolet kleuring.

Focus Formation: A-cel gebaseerde test om de oncogene potentiaal van een Gene bepalen

Meer video's verkennen