Focus Formation: A-cel gebaseerde test om de oncogene potentiaal van een Gene bepalen

Het algemene doel van deze procedure is om de focus-vormingassay uit te voeren in muizenfibroblast-cellijnen, waarbij een retrovirus wordt gebruikt om het oncogene potentieel van een gen te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst de sequentie van het gen van belang in een retrovirale vector te kloneren. De tweede stap is het produceren van retrovirale deeltjes met behulp van de virale vector en PLA e packaging-cellen.

Vervolgens wordt het retrovirus gebruikt om NIH 3T3-muis fibroblastcellen te infecteren om het transformerend vermogen van het gen van belang te beoordelen. De laatste stap is om de NIH 3T3-cellen twee tot drie weken te laten delen, gevolgd door kleuring met kristalviolet om het aantal gevormde foci te kwantificeren. Uiteindelijk wordt de focusvormingsassay gebruikt om aan te tonen of overexpressie van een gen van belang voldoende is om densiteitsonafhankelijke groei in muis fibroblastcellen te induceren.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de kankerbiologie, zoals het screenen op het oncogene potentieel van een gen. Maak om te beginnen de virale vector zoals beschreven in het tekstprotocol. Stel vervolgens plat E-culturen op vanuit bevroren cellen door plat E-cellen snel te ontdooien in een waterbad van 37 °C en deze vervolgens over te brengen naar een conische buis van 15 mL.

Voeg langzaam negen milliliter PLA E-medium toe aan de 15 milliliter conische buis. Centrifugeer de buis bij 180 ×g gedurende vijf minuten en verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in 10 milliliter PLA E-medium en breng deze over naar een 10 centimeter kweekschaal.

Incubeer de cellen vervolgens in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 totdat ze een confluentie van 80 tot 90% hebben bereikt. Voer de celsplitsing uit door eerst het medium af te zuigen, waarna de cellen eenmaal met PBS worden gewassen; voeg vervolgens twee milliliter 0,05% tripsin-EDTA toe en incubeer dit gedurende één minuut bij kamertemperatuur, waarna de cellen door voorzichtig tikken tegen de wand worden losgemaakt. Voeg daarna 10 milliliter plat E-medium toe en breng de celsuspensie over naar een buis van 15 milliliter.

Centrifugeer de buis zoals voorheen en resuspendeer de cellen in 10 milliliters plat E medium. Zaai vervolgens 2 miljoen cellen per 10 centimeter kweekschaal met plat E medium zonder antibiotica en laat de cellen overnight incuberen. Breng de volgende dag 300 microliters van het optimum over in een 1,5 milliliter microbuisje.

Voeg 27 µL polyethyleenamine toe aan de voorbereide buis met Optum. Meng voorzichtig door op de buis te tikken en laat dit vijf minuten incuberen bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 9 µg plasmid DNA van transfectiekwaliteit toe aan de buis, meng voorzichtig door te vortexen en laat dit 15 minuten incuberen bij kamertemperatuur.

Voeg vervolgens het mengsel druppelsgewijs toe aan de plat E-schaal voordat u deze een nacht incubeert. Aspireer de volgende dag het medium dat het transfectiereagens bevat en voeg 10 milliliters vers plat E-medium toe voordat u de cellen terugplaatst in de incubator om NIH three T three-culturen te vestigen. Ontdooi eerst de cellen snel in een waterbad van 37 °C en breng ze over naar een 15 milliliter buis.

Voeg langzaam negen milliliter NIH 3, T 3-medium toe aan de cellen, centrifugeer de buis bij 180 ×g gedurende vijf minuten en verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen vervolgens in 10 milliliter NIH 3, T 3-medium en breng ze over naar een kweekschaal van 10 centimeter. Incubeer de cellen in een incubator op 37 °C met 5% CO2 en houd ze subconfluent, aangezien de frequentie van spontane transformatie toeneemt.

Zodra een cultuur confluentie bereikt, zaai dan 3 x 10⁵ NIH 3T3-cellen per 10 cm petrischaal en laat deze een nacht incuberen voor infectie op de volgende dag. Oogst de volgende dag het retrovirale supernatant uit de petrischaal met een wegwerpspuit van 10 ml, filtreer dit door een nylon membraanfilter met een poriegrootte van 0,45 µm en breng het over in een buis van 15 ml. Voeg 10 ml vers plat E-medium toe aan de cellen voordat u ze terugplaatst in de incubator.

Aspireer vervolgens het medium uit de schaal met NIH 3T3-cellen die geïnfecteerd moet worden en voeg vijf milliliter regulier NIH 3T3-medium en vijf milliliter gefiltreerd supernatant dat virus bevat toe. Voeg daarna polybrene toe aan de schaal. Voeg dit toe in een concentratie van 6 µg/mL.

Incubeer de cellen overnight voordat de infectiestappen worden herhaald voor een tweede infectieronde. Vervang na de infectie het virushoudende medium door regulier IH3T3-medium. Laat de IH3T3-cellen twee tot drie dagen groeien, waarbij het medium indien nodig wordt vervangen, gevolgd door kleuring met kristalviolet.

Snuif het NIH 3T3-medium af en plaats de schaaltjes op ijs. Was de schaaltjes tweemaal met ijskoud PBS. Fixeer de cellen gedurende 10 minuten met ijskoud methanol.

Verwijder vervolgens de schaaltjes uit het ijs en aspireer de methanol. Voeg drie milliliter 0,5% kristalviolet-oplossing toe, bereid in 25% methanol, en laat de schaaltjes vijf minuten incuberen bij kamertemperatuur. Aspireer na incubatie de kristalviolet-oplossing en spoel het schaaltje voorzichtig met Milli Q-water tot er geen kleur meer vrijkomt bij het spoelen.

Laat de schaaltjes gedurende de nacht onafgedekt op een werkbank drogen. Zodra de schaaltjes droog zijn, gebruik een liniaal om de foci te meten en tel degene die groter zijn dan vijf millimeter in diameter. Het aantal MXD3 is een basale helix-loop-helix-leucine zipper transcriptiefactor die een atypisch lid is van de MAD-familie, en er is gemeld dat dit betrokken is bij carcinogenese in vergelijking met de negatieve controle en de positieve controle.

De NIH 3T3-schalen waarin MXD3 was overgeëxpresseerd, vertoonden significant minder foci. De gegevens werden verzameld uit meerdere experimenten om de significantie te bepalen, waarbij dezelfde trends werden waargenomen in deze assay. De resultaten suggereren dat MXD3 na deze procedure niet functioneert als een oncogen.

Andere methoden, zoals de focus-formatie-assay met gencombinaties, groei in soft agar proliferatie en celcyclusanalyse, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de rol van een gen van belang in de pathogenese van oncogenese.