Flat Mount beeldvorming van de huid van muizen en de toepassing ervan op de Analyse van Haarzakje Patterning en Sensorische Axon morfologie

Het algemene doel van deze procedure is om huidstructuren, zoals haarfollikels en zenuwuiteinden, in hun geheel te visualiseren zonder het monster fysiek in coupes te snijden. Dit wordt bereikt door eerst huid te verzamelen van verschillende lichaamsregio's, waaronder de rug, de achterpoot en de staart. De tweede stap bestaat uit het platmaken en reinigen van de huidmonsters.

Vervolgens worden de huidmonsters onderworpen aan een geschikte fixatie. De laatste stap is het uitvoeren van immunokleuring of histochemie op de huidmonsters. Tot slot wordt beeldvorming met een dissectiemicroscoop of confocale microscoop gebruikt om de geometrie van diverse huidstructuren te visualiseren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de preparatie van epidermale hormoonmontages, is dat deze kan worden toegepast op de huid op elke locatie van het lichaam en geen scheiding van de epidermis van de dermis vereist. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het onderzoek naar cellulaire polariteit in de huid. Aangezien de tweedimensionale geometrie van de huid en de bijzondere rangschikking van haarfollikels de huid tot een ideaal systeem maken om dit proces te bestuderen, kan deze methode niet alleen inzicht bieden in de cellulaire polariteit van de huid, maar kan deze ook worden toegepast om andere aspecten van huidontwikkeling te bestuderen, zoals de definitie van somatosensorische neurontypen op basis van directe visualisatie van individuele assoneuze morfologieën.

Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien huiddissectie van bepaalde regio's, zoals de poten en de staart, moeilijk aan te leren is; het is belangrijk om deze perfect vlak te maken en rimpels en overrekking te voorkomen. In deze demonstratie wordt de dorsale huid verzameld van P drie muizen die zijn geëuthanaseerd met isofluorine via inhalatie. Gebruik scalpels om een horizontale snede te maken vanaf de basis van de staart langs elke flank, waarbij de dorsale zijde van de basis van elke ledemaat wordt gevolgd, zijwaarts richting de oren verlopend en eindigend bij de neus.

Pel de huid voorzichtig van het onderliggende weefsel, van posterieur naar anterieur, door de huid tussen guants-gedragen vingers vast te houden zodat deze niet door de pincet wordt bekneld. Wanneer de huid eerst op het niveau van de oren wordt gepeld, knip de oren dan eerst af met een schaar en ga extra langzaam te werk, aangezien de huid op deze locatie kan scheuren. Orienteer de huid vanaf dit punt zodanig dat de binnenkant naar boven is gericht.

Zet de huid vast op de S Guard met ongeveer 20 insectenspelden die gelijkmatig over de periferie zijn verdeeld. Rek de huid niet te veel uit. Bedek de huid met 10 tot 20 milliliters PBS met behulp van een gebogen of geknikte pincet.

Disseceer het vet- en bindweefsel dat aan de huid vastzit weg. Houd de puntige zijde van de pincet horizontaal om het risico te minimaliseren dat de pincet door de huid dringt. Verwijder eventuele luchtbellen die onder de huid vastzitten door voorzichtig met een wattenstaafje over het huidoppervlak te rollen.

De volgende stap is het fixeren van de pin-huid. Als de huid wordt gebruikt voor melanine-imaging of alkalische fosfatase-histochemie, voeg dan 20 milliliters per 10 centimeter petrischaal vers bereid 4%P-F-A-P-B-S of 10% gebufferde formaline toe. Als de huid wordt gebruikt voor immunokleuring of het visualiseren van een transgeen keratine, KRT 17 GFP, voeg dan 20 milliliters per 10 centimeter petrischaal vers bereid 2%P-F-A-P-B-S toe; roteer voorzichtig gedurende de nacht in een koelruimte en was de volgende dag gedurende meer dan 10 minuten in PBS.

De procedure voor alkalische fosfatase-histochemie wordt in deze video niet gedemonstreerd. Voor de melanin-imaging wordt de huid gedehydrateerd via een graduele ethanolreeks, waarbij elke stap één dag duurt met zachte horizontale rotatie bij kamertemperatuur. Drie dagen later worden de resterende bindweefsels uit de gedehydrateerde huid verwijderd terwijl de huid zich in 100% ethanol bevindt.

Verwijder de insectenspelden en verplaats de huid naar een glazen schaal met een diameter van 10 centimeter. Voor het succes van deze procedure moet het huidmonster als één intact stuk zijn verzameld en volledig vlak worden gemaakt. Plaats twee glazen microscoopglasplaatjes op de huid om deze vlak te houden en te voorkomen dat deze opkrult.

Voeg 20 milliliter benzoylbenzoaat en benzoylalcohol of BBBA toe, wat het weefsel gedurende de volgende paar uur snel zal uitharden. Til de objectglaasjes enkele seconden van de huid af om de BBBA over de huid te laten spoelen. Voethuid voor de analyse van haarfollikelpatronen wordt doorgaans gedisseceerd van dieren in stadium P one tot P eight. Snijd na euthanasie de poten boven het enkelgewricht af en maak één rechte snede langs het ventrale oppervlak door de voetzolen.

Pel de huid voorzichtig van het onderliggende weefsel in proximale naar distale richting. Snijd de tenen door om de huid los te maken en spelden de huid vast op een dissectieplaat met de binnenzijde naar boven. Er is minimale hoeveelheid bindweefsel op de voet aanwezig.

Huidtransgeen. KRT 17 GFP-huid is nu klaar voor melanine-imaging. Fixeer en verwerk de huid zoals eerder gedemonstreerd voor de dorsale huid. Verwijder na euthanasie van het P 21-dier het haar door het in te wrijven met een haarverwijderingsmiddel.

Breng met een handschoen-bedekte vinger en duim gel aan over het huidoppervlak en wacht 10 minuten. Was het huidoppervlak met kraanwater. Dissecteer vervolgens de huid van de voet en spel deze vast aan de S-guard zoals eerder getoond.

Fixeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met 1%P-F-A-P-B-S en was vervolgens in PBS. Om de staarthuid voor te bereiden, wordt er een cirkelvormige snede rond de basis van de staart gemaakt, gevolgd door een longitudinale incisie over de gehele lengte van de staart langs de ventrale zijde. Pel de staarthuid vanaf de punt af door de punt van het staartbot of het bindweefsel stevig vast te pakken met één pincet en de huid met een tweede pincet.

Bevestig de staarthuid aan een SIL-guard voor de analyse van de melanineverdeling en de oriëntatie van de haarfollikels. Fixeer en verwerk de huid zoals gedemonstreerd voor de rughuid voor de analyse van talgklieren voorafgaand aan de fixatie. Snijd de staarthuid in een reeks segmenten van ongeveer 0,5 tot 1 cm lang en incubeer de huidstukken in PBS met 5 mM EDTA gedurende de nacht bij 37 °C.

Om de adhesie tussen dermis en epidermis de volgende dag te verzwakken, wordt de epidermis voorzichtig van de dermis afgepeld. Zet de epidermis-interface vast aan de S guard en fixeer deze gedurende één uur bij kamertemperatuur in 4% PFA in PBS. Was de epidermis vervolgens met PBS en kleur deze met oil red O zoals beschreven in de protocoltekst.

Een dissectiemicroscoop wordt gebruikt om beelden te maken van de huid van de dorsale voet of de staart terwijl deze zijn ondergedompeld in BBBA, platgedrukt onder het glazen dekglas en nog steeds in de glazen schaal liggen. Deze aanpak minimaliseert de BBBA-contaminatie van de microscoop. Verlicht de schaal van onderaf om ruimtelijke variatie in lichtintensiteit over het gezichtsveld te minimaliseren.

Til de glazen schaal op tot een hoogte van ongeveer 10 centimeter boven het standaard werkvlak van de dissectiemicroscoop en plaats een diffuserende plastic of glazen plaat over de lichtbron. Wanneer de beeldvorming is voltooid, wordt de huid teruggeplaatst in 100% ethanol voor langdurige bewaring bij -20 °C. Om met alkalische fosfatase gekleurde huid voor beeldvorming voor te bereiden, wordt deze tussen twee glasplaten geplaatst van het type dat wordt gebruikt voor kleine proteïnegels.

Zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen de plaatjes en de huid terechtkomen. Dep eventueel overtollig BBBA voorzichtig weg met een papieren handdoek. Plaats deze sandwich van plaatje-huid-plaatje op de tafel van een microscoop.

Gebruik brightfield- of DIC-verlichting met een 10x objectief en Z-stappen van twee micrometer of vijf micrometer. Gebruik een gemechaniseerde XY-tafel om een montage van XY-beelden vast te leggen die aan elkaar worden gestikt om één driedimensionale grijswaardendataset te creëren. Voer semi-geautomatiseerde tracering van axonale arbors uit met een van de diverse beschikbare softwarepakketten.

Brightfield-beeldvorming van skin flat mounts kan worden gebruikt om een enkele cutane sensorische arbor in beeld te brengen, hier getoond met de bijbehorende getraceerde afbeelding. Brightfield-beeldvorming maakt daarnaast de visualisatie van haarfollikelpatronen mogelijk op basis van melaninepigmentatie. Deze afbeeldingen tonen P1-huid van wildtype en Frizzled 6-knockout-muizen en P7-huid van Frizzled 6-knockout-muizen.

Lichtmicroscopische beeldvorming van skin flat mounts kan worden gebruikt om de geometrie van talgklieren en staarten te definiëren. In huid gevisualiseerd met Oil Red O zijn de talgklieren gedesorganiseerd in een frizzled six knockout-muis vergeleken met een wildtype dorsale voet. Huid geoogst van wildtype en frizzled six knockout-muizen die een GFP-getagde keratine KRT 17 GFP dragen en gekleurd zijn met olie.

Red O maakte duidelijk dat de knockout-huid een haarwervel in het centrum heeft. Confocale beeldvorming van skin flat mounts kan ook de geometrie bepalen van haarfollikels gevisualiseerd met KRT 17 GFP en anti-GFP immunokleuring en de erector pili. Oogspieren gevisualiseerd met anti-smooth muscle actin immunokleuring.

Merkelcelclusters worden gevisualiseerd met anti-cytokeratine acht of met opname van am 1 43-kleurstof, en de centrale haarfollikel wordt gevisualiseerd met KRT 17 GFP. In plaats van open te zijn naar de voorzijde, vormt het Merkelcelcluster van de Frizzled zes-knockout een gesloten cirkel. Zodra de techniek onder de knie is, kan een dissectie in ongeveer 30 minuten worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd, en verschillende kleuringen kunnen binnen enkele dagen tot een week worden voltooid. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u huid uit verschillende lichaamsregio's verzamelt en hoe u deze kleurt om verschillende huidstructuren in het hormoonformaat te visualiseren. Volledige dikte, hoge resolutie beelden van huidstructuren kunnen worden verzameld met standaard lichtmicroscopie en confocale microscopie.

Vergeet niet dat het werken met paraformaldehyde en BBBA uiterst gevaarlijk kan zijn. Inademing van dampen moet worden geminimaliseerd door deze oplossingen in afgesloten containers te bewaren en huidcontact moet worden vermeden. Zorg dat BBBA niet in contact komt met plastic.